李家園，胡　俊，侯建軍*，周　婷，鄭和龍，劉細霞，畢永紅（. 湖北師范學院 生命科學學院，湖北 黃石 4500；. 華東師范大學 河口海岸學國家重點實驗室，上海 0006；. 中國科學院 水生生物研究所，湖北 武漢 40070）

一種利用純培養(yǎng)藻株制備浮游植物光合色素標準品的方法研究

李家園1，胡俊2，侯建軍*1，周婷1，鄭和龍1，劉細霞1，畢永紅3
（1. 湖北師范學院 生命科學學院，湖北 黃石 435002；2. 華東師范大學 河口海岸學國家重點實驗室，上海 200062；3. 中國科學院 水生生物研究所，湖北 武漢 430070）

浮游植物色素組成分析可間接反映野外樣品中浮游植物的相對豐度和組成。然而由于色素標準品的獲得較為困難，制約了該方法的廣泛應用。本研究開發(fā)了一種利用純培養(yǎng)藻株制備浮游植物光合色素標準品的方法，包括Chlorophyll a、Chlorophyll b、Fucoxanthin、Lutein、Zeaxanthin、Alloxanthin、N eoxanthin、Violaxanthin、Peridinin。每種浮游植物均有其特征的的色素組成，提取純培養(yǎng)藻株的色素，用液相色譜分離，通過比較各色素的出峰時間和吸收光譜，對色素進行定性分析。之后通過餾分收集獲得各種色素的標準品，并用分光光度法確定各色素分離液的濃度。液相色譜分析結(jié)果顯示各色素標準品純度均在99%以上，各色素標準品的響應因子與購買的光合色素標準品有很好的相關(guān)性。

純培養(yǎng)藻株；高效液相色譜；色素分離；定量；標準品

浮游植物的化學分類需要有合適的生物標志物以及強有力的分析手段，Jeffrey[1]和Hallegraeff[2]等人先后意識到不同的光合色素及其組成具有浮游植物分類學意義。高效液相色譜法的發(fā)展可以完成浮游植物光合色素定性、定量分析工作，但是浮游植物光合色素種類繁多，藻細胞的光合色素組成非常復雜。因此，浮游植物光合色素研究的定性、定量工作較為困難，其中用于光合色素分析的定量標準品的獲得就是主要困難之一[3]。淡水水體中常見的浮游植物類型有藍藻、金藻、隱藻和甲藻等，各類型的色素組成如表1所示。

表1　單種藻及含有色素種類

不同門類的浮游植物有其特征的光合色素組成，自然水體中浮游植物色素組成可間接反映野外樣品中浮游植物的組成和相對豐度。目前，葉綠素 a (Chlorophyll a)、葉綠素 b (Chlorophyll b)及β胡蘿卜素(β -carotene)等可以從Sigma-Aldrich公司購得，玉米黃素(Zeaxanthin)和葉黃素 (Lutein)可以從Roth化學試劑公司購買，但其種類不全，提供的光合色素標準品有限，往往難以滿足對水體中浮游植物光合色素的定性、定量需求。雖然丹麥DHI-14C公司提供了種類較全的光合色素標準品，但其量甚少（每瓶2.5ml），濃度也不夠高。當環(huán)境中浮游植物生物量高，特別是在水華狀態(tài)下，樣品中的光合色素濃度落于工作曲線之外。另外，這些標準品是以有機溶劑的液態(tài)形式存在，由于溶劑的揮發(fā)以及色素的降解等因素，拆封后需立即使用。若想拆封保存一段時間后繼續(xù)使用，需要確定標準品是否降解，并采用分光光度法重新進行濃度標定[4]。相對其昂貴的價格，這不是經(jīng)濟和方便的選擇。因此，本研究探索了以實驗室培養(yǎng)的單種藻為材料，采用高效液相色譜進行了單種光合色素的分離、純化，并采用分光光度法對其濃度進行了標定，獲得了9種光合色素標準品，旨在為光合色素的化學分類法研究提供借鑒與參考。

1　材料與方法

1.1單種藻的培養(yǎng)

本實驗所用藻類選取了淡水水體中常見的5個門類的六種淡水藻，藻種的詳細信息見表2，均由中國科學院淡水藻種庫提供。單種藻的培養(yǎng)條件為：光照強度為 1000-4000 lux, 溫度為 25℃，培養(yǎng)基分別為BG11、CSI、BBM、119、AF-6。

表2　單種藻種類信息

1.2藻類光合色素的提取

取處于對數(shù)生長期的藻液100mL，用4000~6000rpm/5min離心的方法濃縮收集于離心管中，將上清液的多余水分棄去，加入預冷至0~4℃的二甲基甲酰胺，振蕩搖勻后置于-10℃~ -20℃溫度下，抽提30~50min，期間搖晃1-2次；離心管用錫箔紙包好以避光；將提取液在4000rpm下離心3分鐘，取上清液，用PTFE濾膜過濾于棕色色譜瓶中0.5ml，所有的處理過程均在低光照強度下進行；待HPLC儀器信號穩(wěn)定，在提取液中加入相同體積的 1mol/L 乙酸銨溶液，然后上機進行混合色素分離。乙酸銨溶液的加入盡量在上機之前，避免出現(xiàn)沉淀，影響儀器的正常運行[5]。

1.3HPLC單種色素分離分析

光合色素的分離分析選用Agilent 1260 Infinity Series液相色譜工作站，色譜柱為Eclipse XDB-C8(3.5μ m, 4.6 ×150mm)。通過二極管陣列檢測器(DAD)檢測洗出峰，固定記錄波長為440nm和667nm，波長范圍為190~900nm。流動相A為甲醇：1mol/L乙酸銨溶液=80：20；流動相B為100% 甲醇；流動相A的配制：將甲醇與1mol/L乙酸銨溶液按體積比4：1比例混合，通過pH計測定逐滴加入乙酸調(diào)節(jié)至pH=7.2，并用0.45μ m碳酸纖維濾膜過濾，超聲波清洗器超聲脫氣20min后再用，流動相均現(xiàn)配現(xiàn)用。乙酸銨作為離子配對劑可以有效提高色素分離效果，改善峰形[6]。HPLC分析所有有機試劑均為色譜純。洗脫程序參考文獻[7]如表3。

1.4單種色素的獲取

在收集目標光合色素之前，先進行一次完整的單種藻 HPLC圖譜分析，以混合標準色素的分析圖譜為依據(jù)，并參考胡俊等[7]提出的各光合色素的保留時間及最大吸收波長等特征來進行定性分析。依據(jù)實驗得到的各色素保留時間，重復收集5-10次。此操作過程均需要在弱光條件下進行，準確把握好收集色素的時間。

1.5單種光合色素的定性與定量

表3　梯度洗脫程序

將得到的單種藻的色譜圖與光合色素的混合標準品液相色譜圖進行對比分析，通過保留時間與各光合色素的最大吸收波長特征結(jié)合起來進行定性。得到目標單種色素后，首先用同樣的梯度洗脫程序?qū)ζ浣M成進行再分析，確保獲得的目標物是單一色素后，用真空濃縮干燥器濃縮，并依據(jù)不同的分析要求溶解于不同的有機溶劑中(表4)，通過分光光度計來測定其在最大吸收波長處的吸光度，扣除750nm處的雜質(zhì)吸收，然后根據(jù)如下公式進行定量計算[8]：

其中，C(g/L)為各色素濃度；Aλ max為各色素在最大吸收波長處的吸光度，d(cm)為比色皿的寬度；α (L·g-1·cm-1)為各光合色素的消光系數(shù)；各光合色素的消光系數(shù)數(shù)值[9]如表4所示。文中各光合色素分別為別藻黃素(Alloxanthin)，葉綠素a (Chllorophyll a)，葉綠素b (Chllorophyll b)，巖藻黃素(Fucoxanthin)，葉黃素(Lutein)，新葉黃素(Neoxanthin)，堇菜色素(Violaxanthin)，玉米黃素(Zeaxanthin)，多甲藻黃素（Peridinin）。

1.6各光合色素響應因子的確定

將已知濃度的光合色素溶液按要求的梯度（如5個濃度梯度）稀釋后，以相同的實驗條件、通過 HPLC獲得不同濃度下的積分面積，以峰面積為 x軸，各光合色素進樣量為 y軸，通過線性回歸得出線性方程，擬合直線的斜率即為某一光合色素的響應因子值（fp）。此過程要嚴格保持弱光的環(huán)境條件。

表4　浮游植物光合色素定量的消光系數(shù)

2　實驗結(jié)果

2.1藻類光合色素組成的HPLC分析

各純種培養(yǎng)藻類的 HPLC分析圖譜如圖1所示。除α-carotene與β-carotene沒有很好的分離外，其它各色素都可以得到較好的分離。通過對銅綠微囊藻(圖1.a)的高效液相色譜分析表明：該藻的主要色素為Zeaxanthin及Chlorophyll a。其中Zeaxanthin的保留時間為21分鐘，經(jīng)過多次收集保留時間為21分鐘的出峰物質(zhì)，即可獲得Zeaxanthin單物質(zhì)溶液；同樣，多次收集保留時間在28分鐘的物質(zhì)即獲得葉綠素a單物質(zhì)溶液。

圖1　單種藻的HPLC色素分析圖譜

圖1.b、c、d、e分別為單種培養(yǎng)的小球藻、空星藻、小定鞭金藻、隱藻的光合色素HPLC分析圖譜，小球藻和空星藻的色素組成基本一致，包括Neoxanthin(16.0)，Violaxanthin(16.92)，Lutein(22.6)，Chlorophyll b(26.0)， Chlorophyll a(28.0)。用同樣的方法分離小球藻（1.b）空星藻（1.c）也可得到各光合色素的單一物質(zhì)溶液；小定鞭金藻（1.d）的色素組成主要有Fucoxanthin，Chlorophyllide，Violaxanthin單物質(zhì)溶液，同樣通過HPLC分離，手動富集可得到各色素的單一物質(zhì)溶液；分離隱藻(圖1.e)可得到Alloxanthin單一物質(zhì)溶液，分離甲藻(圖1.f)可得到Peridinin單一物質(zhì)溶液。

2.2單一光合色素的分離及純度分析

圖2顯示，用本實驗方法獲得的光合色素為單一物質(zhì)，分別根據(jù)其保留時間和吸收光譜特征，可以確定其為Zeaxanthin。用同樣的方法對收集的色素用相同的梯度洗脫程序經(jīng)過HPLC分析后，也可確定其為單物質(zhì)溶液。繼續(xù)分離和富集可得到其他幾種藻類光合色素。

圖2　單種色素的HPLC分析及其DAD圖譜

2.3光合色素定量的響應因子分析

圖 3分別為 Zeaxanthin, Alloxanthin, Chlorophyll a, Chlorophyll b, Fucoxanthin, Lutien, Neoxanthin, Violaxanthin, Peridinin的HPLC定量工作曲線，對實驗得到的9種不同光合色素分別用不同的濃度梯度進行進樣，外標法得到了其響應因子fp，各擬合曲線的線性相關(guān)系數(shù)均在0.9954與1之間。對本實驗獲得的各光合色素的響應因子與文獻參考值進行相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)為0.931。

圖3　標準光合色素定量曲線

3　討論

Chlorophyll a和Zeaxanthin從銅綠微囊藻中分離；Neoxanthin、Violaxanthin、Lutein和Chlorophyll b從小球藻和空星藻中分離；Alloxanthin和Peridinin分別從隱藻和甲藻中分離。

以光合色素為生物標志物的化學分類法是一個成熟可靠的研究方法，目前已被廣泛地應用于河口、近海、陸架及開放大洋區(qū)域的浮游植物類群組成研究。相對于海洋，淡水中浮游植物光合色素的研究起步較晚。關(guān)于HPLC法分析淡水浮游植物光合色素的研究均基于海洋浮游植物的化學分類法，但由于環(huán)境不同，淡水藻類與海洋藻類可能存在差異，直接采用海洋的相關(guān)數(shù)據(jù)，可能會導致較大誤差。因此，非常有必要開展淡水常見優(yōu)勢藻類光合色素的組成、含量及其生理變化的研究。本研究以淡水藍藻（銅綠微囊藻）、綠藻（小球藻、空星藻）、及金藻（小定鞭金藻）、隱藻（Cryptomonas sp.）為主要研究對象，分析了各種藻的色素組成，通過手動富集各目標色素，進行單種色素標定，得到了各色素的響應因子，結(jié)果顯示各色素響應因子與文獻中各色素的響應因子基本一致（表5）。各光合色素的fp值除Chlorophyll a和Chlorophyll b外，其余都與文獻的報道值[3,7]一致。

表5　光合色素標準品保留時間、響應因子、相關(guān)系數(shù)及最大吸收波長

藍藻門的銅綠微囊藻檢測出高含量的 Zeaxanthin；小球藻和空星藻都屬于綠藻門，它們的色素組成基本一致，都含有較高含量的Chlorophyll b、Lutien、Neoxanthin和Violaxanthin；在小定鞭金藻中檢測出一定含量的Fucoxanthin；在隱藻里面檢測出一定含量的特征光合色素Alloxanthin；另外，小定鞭金藻和隱藻中Chlorophyllide含量較高，這是由于單種培養(yǎng)過程中沒有及時進行HPLC色素分析工作，實驗藻處于衰亡期，部分葉綠素a降解所致。本實驗經(jīng)過手動富集得到的單一色素溶液濃度較高，在標準曲線制作過程中，需要根據(jù)現(xiàn)場監(jiān)測到的各光合色素實際濃度進行相應地稀釋。

對同一光合色素進行平行進樣，結(jié)果顯示各光合色素的保留時間波動范圍在2分鐘內(nèi)，最大吸收波長的波動范圍在1-2nm之間，這可能是由于流動相配比的差異，造成乙酸銨-色素離子配對劑的修飾作用不同。另外，本實驗得到各目標光合色素的DAD吸收光譜特征與文獻值[3,7]相差1-5nm，這也是由于不同HPLC分析系統(tǒng)的流動相及色素與不同溶劑的作用力不同引起的。特別是實驗得出的各光合色素的響應因子與文獻[3,7]提供的數(shù)據(jù)有顯著的相關(guān)性，這一點類胡蘿卜素類表現(xiàn)尤為明顯，而葉綠素類則差異較大。本結(jié)果中葉綠素類相關(guān)性欠佳的原因可歸結(jié)為三點：第一、不同的光合色素分離條件（色譜柱型號、流動相組成、梯度洗脫程序、有機溶劑）之間存在差異；第二、葉綠素類較類胡蘿卜素類對光敏感程度強烈，在手動收集、紫外分光光度計定量及外標法制作標準曲線的過程中，雖然光照條件很弱，但即使是弱光條件仍不可避免地影響其穩(wěn)定性；第三、在有機溶劑中，葉綠素類的穩(wěn)定性較差，即使是在超低溫狀態(tài)下也可能存在著降解的問題，在運輸過程中更難免存在降解的問題。

[1] Jeffrey S. W. Profiles of Photosynthetic Pigments in the ocean using thin-Iayer chromatography[J]. Marine Biol., 1974, 26: 101-110.

[2] Hallegraeff G. F. Seasonal study of Phytoplankton Pigments and species at a coastal station off Sydney: importance of diatoms and nanoplankton[J]. Marine Biol., 1981, 61: 107-118.

[3] Jeffrey S. W., Mantoura R. F. C., Wright S. W. Praparation of chlorophyll standard[M]. In: Phytoplankton pigments in oceanography: guidelines to modern methods. UNESCO, Paris, 1997b, 207-237.

[4] Saro Jayaraman, Michael L. Knuth, Mark Cantwell, et al. High performance liquid chromatographic analysis of phytoplankton pigments using a C16-Amide column[J]. J. Chromatogr. A, 2011, 1218: 3432-3438.

[5] Wright S. W., Jeffrey S. W., Mantoura R. F. C. et al. Improved HPLC method for the analysis of chlorophylls and carotenoids from marine phytoplankton[J]. Marine ecology progress series, 1991, 183-196.

[6] Ston-Egiert J., Kosakowska A. RP-HPLC determination of phytoplankton pigments—comparison of calibration results for two columns[J]. Marine Biol., 2005, 147: 251-260.

[7] 胡俊, 柳欣, 王磊, 等. 應用反相高效液相色譜定性和定量浮游植物光合色素[J]. 海洋科學, 2011, 35(11): 19-28.

[8] Van Heukelem L., Thomas C. S. Computer-assisted high-performance liquid chromatography method development with applications to the isolation and analysis of phytoplankton pigments[J]. J. Chromatogr. A, 2001, 910(1): 31-49.

[9] Jeffrey S. W. Chlorophyll and carotenoid excitation coefficients[M]. In: Jeffrey S.W., Mantoura R. F. C.w, Wright S. W (eds) Phytoplankton pigments in oceanography: guidelines to modern methods. UNESCO, Paris, 1997a. 595-596.

Preparation of Phytoplankton Pigments Standards from Pure Culture of Freshwater Algae

LI Jia-yuan1, HU Jun2, HOU Jian-jun1, ZHOU Ting1, ZHENG He-long1, LIU Xi-xia1, BI Yong-hong3
(1. College of Life Sciences, Hubei Normal University, Huangshi Hubei 435002, China; 2. State Key Laboratory of Estuarine and Coastal Research, East China Normal University, Shanghai 200062, China; 3.Institute of Hydrobiology, Wuhan Hubei 430070, China)

Analyzing the component and content of pigments in phytoplankton community enables the classification of strains into different phyla. However, the series of pigments standards are unavailable which restrains the application of this method. In this study, a method for the preparation of phytoplankton pigments standards from pure culture of freshwater algae was proposed, including chlorophyll a, chlorophyll b, fucoxanthin, lutein, zeaxanthin, alloxanthin, neoxanthin, violaxanthin and peridinin. Each phylum of phytoplankton has its typical composition of pigments. The pigments in each pure culture of phytoplankton were separated by high performance liquid chromatography (HPLC). The chromatographic peaks were identified according to the typical composition of pigments in the phytoplankton, also the retention time and absorption spectra of each peak. After the peak of each pigment was qualitative identified, the corresponding fraction was collected. Pool collected fractions were used as standard solutions whose concentrations were determined by spectrophotometry. Purities of all the standard solutions were over 99% identified by HPLC. The response factors of the the standard solutions were well correlated with those in literatures.

pure culture; high-performance liquid chromatographic; pigments separation; quantification; standards

Q178

A

2095－414X(2015)06－0078－06

侯建軍（1966-），男，教授，研究生導師，研究方向：水環(huán)境分析及化學分類法研究浮游植物多樣性.

國家自然科學基金項目（41171045）；湖北師范學院優(yōu)秀創(chuàng)新團隊項目（T201504）；湖北省高等學校2014年省級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201410513027）；湖北師范學院研究生創(chuàng)新基金項目（201204）.