王　化，李夢莎，朱良玉，周麗萍

RP-HPLC法測定暴馬丁香中齊墩果酸的含量

王化，李夢莎，朱良玉，周麗萍

（黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所，哈爾濱 150040）

建立反相高效液相色譜法測定暴馬丁香中齊墩果酸含量的方法。采用Waters C18色譜柱，流動(dòng)相為甲醇-0.5%磷酸水溶液（82∶18），流速為1.0 mL/min，檢測波長為205 nm。齊墩果酸進(jìn)樣濃度在0.01～1.0 mg/mL線性關(guān)系良好（R2=0.9998）；平均回收率為101.3%（RSD=1.7%）。本法準(zhǔn)確、可靠，靈敏度高，可作為暴馬丁香中齊墩果酸的定量分析方法。

暴馬丁香；齊墩果酸；高效液相色譜法

暴馬丁香（Syringa reticulata），木犀科，丁香屬，溫性樹種，適應(yīng)性強(qiáng)，栽培歷史悠久。在我國境內(nèi)主要分布于黑龍江省東部山區(qū)和小興安嶺地區(qū)，吉林省東部山區(qū)和遼寧省丹東、寬甸、鳳城等地［1］。暴馬丁香不僅具有美化環(huán)境的作用，還具有良好的藥用價(jià)值，全株可入藥［2］。從暴馬丁香枝葉中共分離出40余種成分，主要有紫丁香苷、橄欖苦苷、齊墩果酸、山奈酚、槲皮素等［3-4］，經(jīng)現(xiàn)代藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)已證明：暴馬丁香有清肺、祛痰、平喘、止咳、消炎、利尿等功效［5］，以其為原料生產(chǎn)的芩暴紅止咳片、膠囊對治療急性支氣管炎、慢性支氣管炎急性發(fā)作、感冒咳嗽等癥均具有較好療效［6］。在抗菌、保肝和抗氧化等方面，暴馬丁香也表現(xiàn)出較好的活性［7］。因此，研究及分析暴馬丁香中的活性物質(zhì)對暴馬丁香的基礎(chǔ)研究和開發(fā)應(yīng)用具有重要意義。

齊墩果酸（Oleanolic acid）屬五環(huán)三萜類化合物，有護(hù)肝降酶、抗菌、抗腫瘤、強(qiáng)心利尿等藥理作用，用于急、慢性肝炎輔助治療［8-9］。齊墩果酸結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不易人工合成，因此主要從植物中提取得到。雖然齊墩果酸是暴馬丁香的重要活性成分之一，但暴馬丁香中齊墩果酸的含量測定未見文獻(xiàn)報(bào)道。本文采用RP-HPLC法對暴馬丁香中齊墩果酸的含量進(jìn)行了方法學(xué)研究，為進(jìn)一步開發(fā)、利用暴馬丁香資源提供了科學(xué)依據(jù)。

1　儀器與試藥

Waters e2695-2998液相檢測系統(tǒng)；齊墩果酸對照品（≥98%）購自天津一方科技有限公司；2014年5月采集暴馬丁香枝條、葉片樣品于60℃烘干至恒重，粉碎，過篩40目，于陰暗干燥處儲(chǔ)存、備用；甲醇（色譜純），無水乙醇（分析純），超純水自制。

2　方法與結(jié)果

2.1溶液的配制

2.1.1對照品溶液

精密稱定齊墩果酸對照品，加70%乙醇制成齊墩果酸濃度為1mg/mL的溶液作為對照品儲(chǔ)備液。

2.1.2供試品溶液

暴馬丁香原料粉碎，過40目篩，稱取細(xì)粉1.00g，置于燒杯中，加入70%乙醇20mL，放入超聲波提取器中提取1.0h，過濾，取濾液為供試品溶液。

2.2色譜條件

色譜柱為WatersC18（150mm×4.6mm，5μm）柱；流動(dòng)相為甲醇-0.5%磷酸溶液，梯度洗脫；流速為1.0 mL/min；檢測波長為205nm；進(jìn)樣量為10μL。色譜圖見圖1。

圖1　對照品（A）及樣品（B）HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms ofreference substance（A）and sample（B）

2.3線性關(guān)系試驗(yàn)

精密量取對照品的儲(chǔ)備液，加入濃度為70%的乙醇，配制濃度為0.01mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL的對照品溶液，以齊墩果酸濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)（X），以HPLC檢測峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：Y=6 437 809.91X-42 429.80，R2=0.999 8。結(jié)果表明：齊墩果酸濃度在0.01～1.0 mg/mL線性關(guān)系良好（如圖2所示）。

圖2　齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of oleanolic acid

2.4精密度試驗(yàn)

對照品溶液6次重復(fù)進(jìn)樣，每次進(jìn)樣體積10μL，記錄峰齊墩果酸面積數(shù)值。求得其峰面積的RSD為0.2%，表明精密度良好。

2.5重復(fù)性試驗(yàn)

取暴馬丁香細(xì)粉，按“2.1.2”項(xiàng)所述方法操作，制備6份平行供試品溶液，按上述色譜條件分別測定，結(jié)果齊墩果酸含量的平均值 （n=6）為0.24%，RSD為3.2%，表明重復(fù)性良好。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)

取新制同一供試品溶液，于室溫下放置，在0h、2h、4h、6h、8h、12h分別進(jìn)樣10μL，記錄齊墩果酸峰面積，計(jì)算得到其峰面積的RSD為0.3%，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7回收率試驗(yàn)

取已知齊墩果酸含量 （0.24%）的暴馬丁香細(xì)粉約0.1g，共6份，精密稱定后，分別加入濃度為0.5mg/mL齊墩果酸對照品2mL，制備所需溶液，每個(gè)溶液進(jìn)樣量10μL，記錄齊墩果酸峰面積，計(jì)算得到平均回收率（n=6）為101.3%（RSD=1.7%），表明本方法準(zhǔn)確性較好。

2.8樣品測定

分別稱取暴馬丁香枝條、葉片樣品粉末，按照“2.1.2”項(xiàng)方法制備供試樣品溶液，按“2.2”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測定，每個(gè)樣品重復(fù)3次。記錄樣品峰面積，計(jì)算齊墩果酸含量，結(jié)果見于表1中。

表1　樣品測定結(jié)果Tab.1　Results of sample determination

3　討論

第一，試驗(yàn)所采用色譜條件的線性關(guān)系、重復(fù)性、穩(wěn)定性、加樣回收率良好，方法可行。

第二，試驗(yàn)所采用色譜條件檢測靈敏度高，峰形對稱，且在20 min內(nèi)可對所有色譜峰檢測完畢，說明該方法靈敏度高、節(jié)省時(shí)間及溶劑使用量。

第三，試驗(yàn)結(jié)果表明：暴馬丁香枝條中齊墩果酸的含量高于葉片中含量，在工業(yè)生產(chǎn)中，基于提高生產(chǎn)效率原則，可更多的考慮以暴馬丁香枝條作為原料。關(guān)于暴馬丁香枝條中齊墩果酸含量的時(shí)空動(dòng)態(tài)變化比較還在進(jìn)一步的研究中。

［1］崔洪霞，蔣高明，臧淑英.丁香屬植物的地理分布及其起源演化［J］.植物研究，2004，24（2）：141-145.

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［3］ 徐國興.長白山暴馬丁香枝化學(xué)成分的研究［D］.長春：吉林大學(xué)，2003.

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［5］蔡恩博，張崇禧，朱啟光，等.星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選暴馬丁香樹皮中紫丁香苷的提取工藝［J］.藥物分析雜志，2011，31（9）：1808-1811.

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［8］ 唐初，陳玉，柏舜，等.齊墩果酸的結(jié)構(gòu)修飾與生物活性研究進(jìn)展［J］.有機(jī)化學(xué)，2013，（33）：46-65.

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RP-HPLC determination of oleanolic acid in Syringa reticulata

WANGHua，LI Meng-sha，ZHULiang-yu，ZHOULi-ping
（Institute ofNatural Resources and Ecology，HeilongjiangAcademyofSciences，Harbin 150040，China）

This paper aims to develop a RP-HPLC method for the determination of oleanolic acid in Syringa reticulate.A Waters C18 column was adopted.The mobile phase was a mixture of methanol-0.5%phosphoric acid solution（82:18）.The flow rate was 1.0 mL/min，UV detection wave length was at 205nm.A good linearity was obtained in the range of 0.01-1.0 mg/mL for oleanolic acid.The average recoveries was 101.3%（RSD=1.7%）.This method is simple，accurate，sensitive and suitable for the determination ofoleanolic acid in Syringa reticulate.

Syringa reticulate；Oleanolic acid；HPLC

R927.2

A

1674-8646（2015）04-0054-02

2015-03-25

王化（1981-），女，吉林大安人，助理研究員，博士，從事天然產(chǎn)物研究。