石小東（徐州醫(yī)學院麻醉學重點實驗室，江蘇徐州 221004）

亞基交換在小分子熱休克蛋白AgsA發(fā)揮類分子伴侶活性中扮演著重要的角色

石小東
（徐州醫(yī)學院麻醉學重點實驗室，江蘇徐州 221004）

為了研究鼠傷寒沙門氏菌小分子熱休克蛋白AgsA的亞基交換在其發(fā)揮類分子伴侶活性中的作用，本文通過將野生型AgsA和在C末端添加His-tag標簽的AgsA在不同條件下與Ni-NTA Agarose混合，最后檢測pull down下來的蛋白來分析目標蛋白的亞基交換情況。凝膠排阻層析和類分子伴侶活性測定結(jié)果顯示，在C末端添加His-tag標簽并不影響AgsA的寡聚狀態(tài)和類分子伴侶活性。Pull down的研究結(jié)果表明，AgsA的亞基交換速率隨著溫度的升高而升高，而且，部分變性底物的存在也加速了AgsA的亞基交換速率。由于AgsA的類分子伴侶活性是隨著溫度的升高而升高的，由此可以推測，亞基交換在AgsA發(fā)揮類分子伴侶活性中扮演著重要的角色。

小分子熱休克蛋白 AgsA 類分子伴侶活性 亞基交換

【Abstract】In order to study the role of subunit exchange in the chaperone-like activity of small heat shock protein AgsA from Salmonella enterica serovar Typhimurium，wild type AgsA and the AgsA with a His-tag added on the C terminus were mixed with Ni-NTA Agarose under different conditions，then the proteins pulled down were detected to analyse the subunit exchange of AgsA. The results of the gel exclusion chromatography analysis and chaperone-like activity assay showed that the added His-tag neither affected the oligomeric state of AgsA，nor the chaperone-like activity of AgsA. The results of the pull down assay showed that subunit exchange of AgsA occurred faster upon temperature increasing，and the presence of partial denatured substrate also accelerate the subunit exchange rate of AgsA. Since the chaperone-like activity of AgsA enhanced as temperature increased，it could be speculated that subunit exchange may play an important role in the chaperone-like activity of AgsA.

【Key words】small heat shock protein，AgsA，chaperone-like activity，subunit exchange

小分子熱休克蛋白是一類普遍存在的應(yīng)激蛋白，分子量在12-43 kDa之間，具有保守的、大約100多個氨基酸殘基組成的a-crystallin結(jié)構(gòu)域［1-2］。通常，小分子熱休克蛋白在體外以多個亞基組成的球狀寡聚體形式存在，這種寡聚體是一種動態(tài)的結(jié)構(gòu)，在寡聚體之間發(fā)生著快速的亞基交換［3-4］，盡管關(guān)于該過程的機制和動力學都還知之甚少，越來越多的證據(jù)都表明亞基交換是小分子熱休克蛋白發(fā)揮類分子伴侶活性必不可少的［5-9］。為了確定這種關(guān)系是否也存在于鼠傷寒沙門氏菌小分子熱休克蛋白AgsA中，本文采用His-tag pull down法對該蛋白在不同條件下的亞基交換情況進行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AgsA的亞基交換速率隨著溫度的升高而升高，而且部分變性底物的存在也加速了AgsA的亞基交換，表明亞基交換在AgsA的類分子伴侶活性的發(fā)揮中也扮演著重要的角色。

圖1　凝膠排阻層析分析AgsA和AgsA-His6在室溫下的寡聚狀態(tài)

圖2　AgsA和AgsA-His6類分子伴侶活性的測量

1　材料和方法

1.1材料

E. coli DH5α用于分子克隆操作，E. col BL21（DE3）用于目標蛋白的表達和純化，pET21a-agsA質(zhì)粒受贈于北京大學生命科學學院蛋白質(zhì)科學實驗室。Ni-NTA Agarose購自北京百匯中源有限公司。Insulin、DTT（dithiothreitol）購自Sigma公司。其他所有化學試劑均為分析純量級。

圖3　His-tag pull down方法研究AgsA在不同條件下的亞基交換情況

1.2方法

（1）重組質(zhì)粒的構(gòu)建。為了表達在C末端帶有His-tag標簽的AgsA，以質(zhì)粒pET21a-agsA作為模板進行PCR擴增，所得DNA片段用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切后，插入到質(zhì)粒pET21a中，獲得的重組質(zhì)粒pET21a-agsA-his6轉(zhuǎn)化到E. coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞進行目的蛋白的表達。

（2）AgsA的表達與純化。將含有重組載體的E. coli BL21（DE3）菌株小量培養(yǎng)過夜，轉(zhuǎn)接至新鮮LB培養(yǎng)基中于37℃，200 rpm條件下大量培養(yǎng)，當細菌長至OD600約為0.6時，加入1 mM的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)約6 h。5000 rpm離心10 min收獲菌體，去離子水洗滌后凍存于-20℃過夜。不帶His-tag標簽的AgsA的純化方法參考Shi等人的操作步驟［10］。對于帶有His-tag標簽的AgsA，凍存菌體在冰上緩慢融化之后，用含有1 mM蛋白酶抑制劑PMSF的緩沖液A（50 mM Na3PO4，50 mM NaCl，20 mM咪唑，pH 7.5）重懸后進行超聲破碎。細胞裂解液于15000 g離心40 min，收集上清上樣于Ni-NTA柱，隨后用緩沖液B（50 mM Na3PO4，1 M NaCl，20 mM咪唑，pH 7.5）洗脫雜蛋白，最后用緩沖液C（50 mM Na3PO4，50 mM NaCl，250 mM咪唑，pH 7.5）進行目的蛋白的洗脫。采用BCA法對純化所得蛋白進行濃度測定。

（3）凝膠排阻層析。采用凝膠排阻層析柱Superdex200，每次上樣量為100 μl，AgsA濃度為3.5 mg/ml，洗脫液為50 mM Na3PO4（含50 mM NaCl，pH 7.5），流速為0.5 ml/min。樣品在上樣前15000 g離心10 min。

（4）類分子伴侶活性的測量。以Insulin作為底物來測定AgsA的類分子伴侶活性。類分子伴侶活性的測量在UV-8500分光光度計（上海，Techcorp）上進行，檢測波長為360 nm。

（5）His-tag pull down試驗。于1.5 ml eppendorf管中加入500 μl Ni-NTA Agarose，2000 g離心1 min，棄上清；用去離子水洗5次之后用緩沖液A再洗5次；加入在特定溫度下孵育10 min的目標蛋白（200 μl野生型AgsA和/或200 μl C端帶有His-tag標簽的AgsA）計400 μl，旋轉(zhuǎn)混合5 min，2000 g離心1 min，取50 μ l上清液為不和Ni-NTA Agarose結(jié)合的蛋白組分，余下上清棄掉；加入緩沖液C 250 μl，旋轉(zhuǎn)混合1 h，2000 g離心1 min，取50 μl上清液為和Ni-NTA Agarose結(jié)合不緊密的蛋白組分，余下上清棄掉；加入1×SDS loading buffer 250 μl，置于沸水中加熱5 min，2000 g離心1 min，取50 μl上清液為和Ni-NTA Agarose緊密結(jié)合的蛋白組分；所有樣品經(jīng)過SDS-PAGE電泳分離，用考馬斯亮藍染色。對于變性底物誘導試驗，目標蛋白除了200 μl野生型AgsA 和200 μl C端帶有His-tag標簽的AgsA之外，還加入100 μl insulin（5mg/ml）和20 μl DTT（1 M），在30oC孵育10 min，其余操作同上。

2　結(jié)果

2.1在AgsA的C末端添加His-tag標簽不會影響其寡聚狀態(tài)

AgsA在體外形成大的寡聚體結(jié)構(gòu)［11］，其在室溫條件下的洗脫曲線只呈現(xiàn)單一的洗脫峰（圖1）。凝膠排阻層析對AgsA-His6的分析結(jié)果顯示，在C末端添加His-tag標簽未明顯改變AgsA在室溫條件下的洗脫曲線（圖1），表明在AgsA的C末端添加His-tag標簽并不會影響其寡聚狀態(tài)。

2.2在AgsA的C末端添加His-tag標簽不會影響其類分子伴侶活性

以Insulin作為底物測定AgsA的類分子伴侶活性的試驗結(jié)果表明，AgsA可以在室溫條件下阻止DTT誘導的Insulin B鏈的聚集（圖2）。采用同樣方法測定AgsA-His6對Insulin B鏈聚集的保護情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在C末端添加His-tag標簽都幾乎不影響AgsA在室溫條件下的類分子伴侶活性（圖2）。

在室溫條件下，用UV-8500分光光度計分別檢測不同濃度的AgsA和AgsA-His6對DTT誘導的Insulin B鏈聚集的保護，檢測波長為360nm，DTT的終濃度為20 mM。WT：野生型AgsA；C-tag：C末端帶有His-tag標簽的AgsA。

2.3AgsA的亞基交換速率受溫度和底物的影響

在確定添加His-tag對AgsA的寡聚狀態(tài)和類分子伴侶活性無影響之后，首先通過比較AgsA和AgsA-His6與Ni-NTA Agarose的結(jié)合能力來檢驗本實驗室所建立的His-tag pull down體系。如圖3A所示，AgsA因為不結(jié)合Ni-NTA Agarose，主要出現(xiàn)在lane 2，而AgsA-His6結(jié)合Ni-NTA Agarose，主要出現(xiàn)在lane 4。當把AgsA 和AgsA-His6等量混合進行上述實驗，如果發(fā)生亞基交換，從lane 2 到lane 4中則均可檢測出兩種蛋白的存在，二者的比例體現(xiàn)的是亞基交換能力的差異。本文分別在4WT：野生型AgsA；N-tag；C-tag：C末端帶有His-tag標簽的4℃、30℃、60℃以及部分變性底物存在的條件下對AgsA的亞基交換情況進行了研究。試驗結(jié)果表明，在4℃，AgsA基本不發(fā)生亞基交換，隨著溫度的升高，從30℃到60℃，伴隨著AgsA的亞基交換速率增加。此外，部分變性底物Insulin的存在也加快了AgsA的亞基交換速率（見圖3B）。

3　討論

在我們之前的研究中發(fā)現(xiàn)，AgsA的類分子伴侶活性是溫度依賴的［10］。為了探究亞基交換在AgsA類分子伴侶活性發(fā)揮中的作用，本文對該蛋白在不同溫度下的亞基交換速率進行了比較。熒光能量共振轉(zhuǎn)移（FRET）通常被用來研究小分子熱休克蛋白的亞基交換，該方法需要對蛋白進行標記［4，5］，而本文則采用了免標記的His-tag pull down法。研究結(jié)果顯示，AgsA的亞基交換也是溫度依賴的，隨著溫度的升高，亞基交換速率增加，這與Hsp16.3、Hsp16.5以及αA-crystallin的亞基交換受溫度影響的趨勢是一致的［4，5，12］。除了溫度可以加速AgsA的亞基交換速率，我們還發(fā)現(xiàn)部分變性的底物也可以在一定程度上促進AgsA的亞基交換。由此可見，亞基交換在AgsA類分子伴侶活性的發(fā)揮中起著重要的作用。小分子熱休克蛋白發(fā)揮類分子伴侶活性的機制普遍被認為是通過寡聚體先發(fā)生解聚，然后去識別并結(jié)合去折疊且暴露出疏水表面的部分變性蛋白中間體，通過抑制其疏水面暴露而引起的聚集，達到抑制底物蛋白聚集的效果，亞基交換速率的加快則有助于AgsA更有效地提供解聚的寡聚體，更有效地結(jié)合部分變性的底物蛋白，發(fā)揮其類分子伴侶活性。

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國家自然科學基金（81300930）；江蘇省自然科學基金（BK20130232）

★石小東