張艷，李志樑，胡春玲

急性冠脈綜合征患者mTOR活化與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及細(xì)胞因子的關(guān)系

張艷1，2，李志樑1△，胡春玲2

目的 檢測哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）在急性冠脈綜合征（ACS）患者外周血T細(xì)胞中的活化狀態(tài)，及其與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）以及細(xì)胞因子的關(guān)系。方法 選取ACS患者32例（ACS組），同期因胸痛癥狀為主訴但心電圖及冠脈造影正常，排除冠心病的胸痛綜合征（CPS）患者28例為對照組；采用蛋白免疫印跡法檢測2組外周血T細(xì)胞中mTOR、p70S6KT389磷酸化（p-p70S6KT389）及AKTS473磷酸化（p-AKTS473）水平；酶聯(lián)免疫吸附測定法測T細(xì)胞亞群相關(guān)細(xì)胞因子干擾素-γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素（IL）-4、IL-17及轉(zhuǎn)化生長因子-β（1TGF-β1）水平；流式細(xì)胞儀檢測CD4+CD25+FoxP3+Tregs占CD4+T細(xì)胞的百分比；采用Spearman相關(guān)分析各指標(biāo)之間的關(guān)聯(lián)性。 結(jié)果 ACS 組mTOR及p-p70S6KT389表達(dá)量均高于對照組（均P＜0.01）；與對照組比較，ACS組IFN-γ、IL-17升高，Tregs百分比及TGF-β1減少（均P＜0.05），而2組p-AKTS473、IL-4比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；相關(guān)分析顯示p-p70S6KT389與IFN-γ及IL-17呈顯著正相關(guān)（rs分別為0.91，0.92，均P＜0.01），與Tregs及TGF-β1呈顯著負(fù)相關(guān)（rs分別為-0.85，-0.80，均P＜0.01）。結(jié)論 ACS患者外周血T細(xì)胞中mTORC1活化與Tregs減少及細(xì)胞因子失衡有關(guān)。

急性冠脈綜合征；他克莫司結(jié)合蛋白質(zhì)類；T淋巴細(xì)胞，調(diào)節(jié)性；細(xì)胞因子類；哺乳動物雷帕霉素靶蛋白

冠狀動脈粥樣硬化從發(fā)生、發(fā)展到斑塊破裂、血栓形成最終引發(fā)急性冠脈綜合征（ACS），是炎癥和免疫交織的過程。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）減少或功能缺陷、抗炎或促炎細(xì)胞因子平衡失調(diào)是ACS的重要發(fā)病機(jī)制之一。近來國外研究發(fā)現(xiàn)，抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）或基因敲除后，可誘導(dǎo)產(chǎn)生較多的Tregs，提示mTOR在調(diào)節(jié)效應(yīng)性T細(xì)胞與Tregs之間的平衡中扮演重要角色［1-3］。但目前尚鮮見有關(guān)ACS患者T細(xì)胞中mTOR與Tregs及細(xì)胞因子之間關(guān)系的研究。本研究通過檢測ACS患者外周血T細(xì)胞中mTOR的活化狀態(tài)、T細(xì)胞亞群相關(guān)細(xì)胞因子及Tregs百分比，并分析他們之間的關(guān)聯(lián)，以期探討mTOR在ACS免疫發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2012年10月—2013年10月在南方醫(yī)科大學(xué)附屬珠江醫(yī)院心內(nèi)科住院的ACS患者共32例（ACS組），男20例，女12例，平均年齡（63.20±3.05）歲；其中不穩(wěn)定型心絞痛（UAP）12例，非ST段抬高型心肌梗死（NSTEMI）10例，ST段抬高型心肌梗死（STEMI）10例。選擇同期因胸痛癥狀為主訴但心電圖及冠脈造影正常，排除冠心病的胸痛綜合征（CPS）患者28例為對照組，男17例，女11例，平均年齡（63.35±2.74）歲。均排除合并感染、發(fā)熱、肝腎功能不全、腫瘤和使用免疫抑制劑者。2組性別（χ2=0.876）、年齡（t=0.443）差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2 主要試劑及儀器 兔抗人mTOR抗體、兔抗人pp70S6K（Thr389）和p-Akt（Ser473）抗體（Cellsignal，美國）；山羊抗兔二抗（southern biotech，美國）；BCA法蛋白含量檢測試劑盒（南京凱基生物發(fā)展有限公司）；RosetteSep人T細(xì)胞富集試劑盒（StemCell，加拿大）；人調(diào)節(jié)T細(xì)胞試劑盒（ebiosci?ence，美國）；干擾素（IFN）-γ、白細(xì)胞介素（IL）-4、IL-17、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（R&D，美國）；Calibur型流式細(xì)胞儀（BD Bioscience，美國）。

1.3 血液標(biāo)本采集 各組于入院后次日早晨空腹抽取靜脈血20 mL，其中2 mL不抗凝，自然凝固20 min，2 000 r/min離心5～10 min，收集血清，ELISA法測細(xì)胞因子。余下的用肝素抗凝后，取其中部分用于流式細(xì)胞檢測，其余用于提取T細(xì)胞。

1.4 T細(xì)胞的分離 按照RosetteSep人T細(xì)胞富集試劑盒說明提取T細(xì)胞，并用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)為（2～4）×106/L。

1.5 mTOR、p70S6KT389磷酸化（p-p70S6KT389）和AKTS473磷酸化（p-AKTS473）水平檢測 采用蛋白免疫印跡法：分離的T細(xì)胞離心，提取蛋白后BCA法測蛋白濃度；經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、室溫封閉后，分別加入一抗（兔抗人）mTOR（1∶1 000）、p-p70S6K （Thr389，1∶1 000）、p-Akt（Ser473，1∶1 000）震蕩過夜后洗滌并加入山羊抗兔二抗（1∶5 000），室溫孵育，洗滌后暗膠片曝光，用Quantity One圖像分析系統(tǒng)分析檢測。

1.6 外周血CD4+CD25+FoxP3+Tregs水平檢測 用流式細(xì)胞儀檢測，收獲各組抗凝血100 μL于試管，嚴(yán)格按照人調(diào)節(jié)T細(xì)胞試劑盒說明操作，最后以CD4+T細(xì)胞設(shè)門，分析熒光強(qiáng)度，記錄CD4+CD25+FoxP3+Tregs百分率。

1.7 細(xì)胞因子的檢測 血清IFN-γ、IL-4、IL-17、TGF-β1的測定均按照ELISA試劑盒說明操作進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 T細(xì)胞mTOR、p-p70S6KT389和p-AKTS473表達(dá)水平 ACS組的mTOR及p-p70S6KT389水平高于對照組（P＜0.01）；2組p-AKTS473表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖1、表1。

Fig.1 Expression of mTOR，p-p70S6KT389and p-AKTS473in peripheral T lymphocytes in two groups shown by Western blot圖1 2組外周血T細(xì)胞mTOR、p-p70S6KT389和p-AKTS473表達(dá)水平

Tab.1 Comparison of mTOR，p-p70S6KT389and p-AKTS473expression in peripheral T lymphocytes in two groups表1 2組患者外周血T細(xì)胞mTOR、p-p70S6KT389和p-AKTS473表達(dá)水平比較 （±s）

Tab.1 Comparison of mTOR，p-p70S6KT389and p-AKTS473expression in peripheral T lymphocytes in two groups表1 2組患者外周血T細(xì)胞mTOR、p-p70S6KT389和p-AKTS473表達(dá)水平比較 （±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；表2、3同

組別nmTOR p-AKTS473p-p70S6KT389對照組2850.12±5.5739.39±3.4484.76±4.93 ACS組32857.15±6.5642.53±4.21620.41±5.81 t 171.17＊＊1.98141.63＊＊

2.2 CD4+CD25+FoxP3+Tregs檢測結(jié)果 ACS組患者CD4+CD25+FoxP3+Tregs占CD4+T細(xì)胞的比率為（1.09±0.16）%，顯著低于對照組（2.52±0.10）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.23，P＜0.05），見圖2。

Fig.2 CD4+CD25+FoxP3+Tregs/CD4+frequencies in two groups shown by FACS圖2 流式細(xì)胞術(shù)測2組CD4+CD25+FoxP3+Tregs/CD4+T細(xì)胞比率

2.3 血清IFN-γ、IL-4、TGF-β1和IL-17細(xì)胞因子水平 與對照組比較，ACS組IFN-γ、IL-17水平顯著升高，TGF-β1明顯減少（均P＜0.01），2組IL-4無明顯差異（P＞0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of serum levels of cytokines in two groups表2 2組血清IFN-γ、IL-4、TGF-β1和IL-17細(xì)胞因子水平比較 （ng/L，±s）

Tab.2 Comparison of serum levels of cytokines in two groups表2 2組血清IFN-γ、IL-4、TGF-β1和IL-17細(xì)胞因子水平比較 （ng/L，±s）

組別對照組ACS組t n 28 32 IFN-γ 37.48±1.63 53.02±3.14 19.25＊＊IL-4 18.74±2.19 21.03±2.20 1.31 TGF-β159.20±2.27 40.09±2.10 21.16＊＊IL-17 14.46±1.42 59.02±2.05 23.62＊＊

2.4 p-p70S6KT389、CD4+CD25+FoxP3+Tregs、細(xì)胞因子的相關(guān)分析 p-p70S6KT389與IFN-γ及IL-17均呈高度正相關(guān)，與TGF-β1及CD4+CD25+FoxP3+Tregs呈高度負(fù)相關(guān)（均P＜0.01）。CD4+CD25+FoxP3+Tregs與TGF-β1水平呈高度正相關(guān)，與IFN-γ、IL-17均呈高度負(fù)相關(guān)（均P＜0.01），見表3。

Tab.3 Correlation analysis on p-p70S6KT389，CD4+CD25+FoxP3+Tregs and cytokins表3 p-p70S6KT389、CD4+CD25+FoxP3+Tregs與細(xì)胞因子的相關(guān)分析 （rs）

3 討論

目前研究已證實，大量存在于ACS患者循環(huán)及斑塊中的活化CD4+T細(xì)胞及其分泌的炎癥細(xì)胞因子，對粥樣硬化進(jìn)展起到極其重要的作用；而輔助性T細(xì)胞Th1、Th2、Th17及Tregs細(xì)胞亞群功能失衡，尤其是Tregs減少，是ACS的重要發(fā)病機(jī)制之一［4-5］。

mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化中起重要作用［6］。mTOR以mTORC1和mTORC2兩種多蛋白復(fù)合物形式存在。而p70S6K （Thr389）及AKT（Ser473）磷酸化水平通?？煞謩e作為評估m(xù)TORC1和mTORC2活性的指標(biāo)［7］。近來國外學(xué)者們發(fā)現(xiàn)mTORC1在Th1和Th17亞群分化中起重要作用，而 Th2亞群則依賴于 mTORC2，mTORC1及mTORC2均影響FoxP3+Tregs的分化［1-3］。

本研究表明ACS組的mTOR及p-p70S6KT389水平高于對照組，但2組p-AKTS473表達(dá)水平無明顯差異，提示mTORC1途徑在ACS發(fā)病中可能發(fā)揮更重要的作用。本研究還觀察到與對照組相比，ACS組外周血Treg比率及其主要細(xì)胞因子TGF-β1水平明顯下降，Th1、Th17主要細(xì)胞因子IFN-γ和IL-17則升高，再次證實了Tregs表達(dá)下降，Th1、Th17型免疫反應(yīng)亢進(jìn)，同時引起抗炎及促炎因子平衡失調(diào)，促進(jìn)了ACS發(fā)病進(jìn)展過程［4-5］，與既往研究結(jié)果相似［8］。2 組Th2細(xì)胞因子IL-4水平無明顯差異，與Zhao等［9］研究結(jié)果相似，提示Th2型免疫反應(yīng)在ACS病變中所起作用相對較小。相關(guān)分析結(jié)果提示Tregs在維持自身免疫穩(wěn)定中的作用與TGF-β1有關(guān)，mTORC1活化可能與Th1、Th17、Tregs細(xì)胞因子失衡及Tregs減少有關(guān)。mTORC1活化使得T細(xì)胞向Th1和Th17亞群分化，Tregs細(xì)胞亞群減少，打破了機(jī)體維持外周自身免疫應(yīng)答的穩(wěn)態(tài)，同時導(dǎo)致T細(xì)胞亞群分泌的細(xì)胞因子失衡，最終促進(jìn)ACS病變進(jìn)展。在T細(xì)胞亞群的檢測中，本研究主要集中于對ACS起潛在保護(hù)作用的Tregs細(xì)胞上，而對其他T細(xì)胞亞群只采用ELISA法檢測其相關(guān)細(xì)胞因子，因此需要在下一步深入研究中進(jìn)一步完善T細(xì)胞亞群的檢測，這將會對本研究結(jié)果提供更充足的證據(jù)。

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（2014-08-26收稿 2014-10-20修回）

（本文編輯 閆娟）

Relationship among mTOR levels，regulatory T cells and cytokins in patients with acute coronary syndrome

ZHANG Yan1，2，LI Zhiliang1△，HU Chunling2
1 Department of Cardiology，Zhujiang Hospital of Southern Medical University，Guangzhou 510282，China；2 Department of Internal Medicine，Guangdong Province Maternity and Child Care Hospital
△Corresponding Author E-mail：happydragon2012qq@126.com

Objective To assess whether mTOR was activated in peripheral T lymphocytes of acute coronary syndrome （ACS）patients and to investigate the relationship among mTOR，regulatory T cells and cytokins.Methods Patients with acute coronary syndrome（n=32）were selected in ACS group.Meanwhile，patients who complainted of chest pain but were proven to be normal in ECG and in coronary arteriography，were excluded as ACS patients but were diagnosed as Chest Pain Syndrome（CPS）and selected in CPS group（n=28）.The expression levels of mTOR，phospho-p70S6KT389（indicative of mTORC1 activity）and phospho-AKTS473（indicative of mTORC2 activity）were investigated in T cells，which were isolated from peripheral blood of patients in ACS group or CPS group，using Western blot.The proportion of CD4+CD25+Foxp3+Tregs over CD4+cells were evaluated by FACS.And T cell subset related cytokines such as IFN-γ，IL-4，IL-17 and TGF-β1were exam?ined by ELISA.Then we investigated the relationship among mTOR，regulatory T cells and cytokins by Spearman analysis.Results mTOR and p-p70S6KT389expression were significantly enhanced in ACS group as compared with those in patients from CPS group（P＜0.01）.Higher levels of IFN-γ，IL-17 but lower level of TGF-β1cytokines as well as decreased propor?tion of Tregs were observed in ACS group than those in CPS group（P＜0.05）.There was no significant difference in the level of IL-4 and p-AKTS473between the two groups（P＞0.05）.By correlation analysis，p-p70S6KT389expression level positively correlated with IFN-γ，IL-17（rs=0.91，092，P＜0.01）and negatively correlated with Tregs and TGF-β（1rs=-0.85，-0.80，re?spectively，P＜0.01）.Conclusion mTORC1 pathway was activated in peripheral T lymphocytes of ACS patients，and Tregs insufficiency and cytokins imbalance both contribute to the activation of mTORC1 pathway and pathological process of ACS.

acute coronary syndrome；tacrolimus binding proteins；T-lymphocytes，regulatory；cytokines；mTOR

R541.4

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.04.022

1南方醫(yī)科大學(xué)附屬珠江醫(yī)院心內(nèi)科，廣東廣州（郵編510282）；2廣東省婦幼保健院內(nèi)科

張艷（1979），女，主治醫(yī)師，博士在讀，主要從事冠心病防治的研究

△E-mail：happydragon2012qq@126.com