宋魏，于慶凱△，張晶晶，張建波，孫淼淼

胃癌伴神經(jīng)內(nèi)分泌分化HER-2基因擴(kuò)增和蛋白表達(dá)及預(yù)后分析

宋魏1，于慶凱1△，張晶晶2，張建波1，孫淼淼1

目的 觀察胃癌伴神經(jīng)內(nèi)分泌分化（NED）和胃癌中HER-2基因擴(kuò)增及蛋白表達(dá)情況。方法 回顧性分析胃癌伴神經(jīng)內(nèi)分泌分化患者70例和具有相同分期的胃癌患者150例，采用免疫組化法（IHC）聯(lián)合雙色銀染色素原位雜交（DISH）檢測(cè)胃癌伴NED和胃癌中HER-2基因擴(kuò)增和蛋白表達(dá)情況，并對(duì)胃癌伴NED進(jìn)行預(yù)后分析。結(jié)果 胃癌伴NED和胃癌中HER-2蛋白過表達(dá)率分別為20.00%和21.33%，HER-2基因擴(kuò)增率分別為8.57%和14.67%。HER-2蛋白表達(dá)、HER-2基因擴(kuò)增及基因擴(kuò)增類型2組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；胃癌伴NED17號(hào)染色體多體與HER-2基因擴(kuò)增呈正相關(guān)。胃癌伴NED患者中HER-2基因擴(kuò)增者術(shù)后生存期短于HER基因不擴(kuò)增者。多因素分析顯示胃癌伴或不伴NED、HER-2基因是否擴(kuò)增、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和手術(shù)方式是預(yù)后的獨(dú)立影響因素。結(jié)論 胃癌伴NED屬于胃癌特殊類型，其HER-2基因擴(kuò)增、蛋白表達(dá)情況和胃癌相同，HER-2基因擴(kuò)增的胃癌伴NED患者預(yù)后差。

癌，神經(jīng)內(nèi)分泌；胃腫瘤；原癌基因蛋白質(zhì)類；原位雜交；基因擴(kuò)增；HER-2；蛋白表達(dá)

人表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）是一種跨膜酪氨酸蛋白激酶受體，其基因擴(kuò)增及其蛋白過表達(dá)是乳腺癌預(yù)后的判斷因子之一，與預(yù)后不良及存活期較短相關(guān)。越來越多的證據(jù)表明，HER-2是重要的生物學(xué)標(biāo)志物，在胃癌發(fā)生中起關(guān)鍵作用，其擴(kuò)增率或過表達(dá)率為7%～34%，HER-2陽性的胃癌可能預(yù)示腫瘤惡性程度高和預(yù)后不良［1］。胃癌伴神經(jīng)內(nèi)分泌分化（neuro?endocrine cell differentiation，NED）是胃癌的一種特殊類型，指分化的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞以單個(gè)或者細(xì)胞巢的形式散在分布于胃癌細(xì)胞之間，其神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞占腫瘤成分≤30%。本研究回顧性分析70例胃癌伴NED和150例具有相同分期的胃癌患者，比較兩者HER-2基因擴(kuò)增和蛋白表達(dá)情況有無差異。

1 資料與方法

1.1 一般資料 根據(jù)免疫組化（IHC）結(jié)果從2011年1月—2014年1月河南省腫瘤醫(yī)院治療的875例胃癌患者中篩選出70例胃癌伴NED蠟塊（胃癌NED組）和150例具有相同分期的不伴NED的胃腺癌蠟塊（胃癌組）。胃癌NED組中，男52例，女18例，年齡（56.49±8.92）歲；胃癌組中，男119例，女31例，年齡（57.96±7.31）歲，2組間性別（χ2=0.441）、年齡（t=1.293）比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有患者均進(jìn)行胃癌手術(shù)治療，其中155例進(jìn)行根治切除，65例姑息切除。2組患者隨訪時(shí)間12～36個(gè)月，截止日期為2013年12月，無失訪病例。

1.2 IHC 試劑購(gòu)均自VENTANA公司，采用VENTANA全自動(dòng)免疫組織化學(xué)儀（Bench Maker）進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，TBS代替一抗作為陰性對(duì)照，HER-2蛋白表達(dá)（+++）的乳腺非特殊型浸潤(rùn)性癌為陽性對(duì)照。在胃癌組織切片中標(biāo)記嗜鉻素A（CgA）、突觸素（Syn）、神經(jīng)細(xì)胞黏附分子（CD56），染色定位于胞漿。3個(gè)特異的神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物中有任何一個(gè)標(biāo)志物表達(dá)即判定為神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物陽性。在光鏡下觀察神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞在胃癌組織中以單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞巢形式分散存在，≤30%診斷為胃癌伴NED。HER-2蛋白表達(dá)結(jié)果：0（在＜10%的腫瘤細(xì)胞中無反應(yīng)或細(xì)胞膜染色），+（在≥10%的腫瘤細(xì)胞中有微弱或不完整細(xì)胞膜染色），++（在≥10%的腫瘤細(xì)胞中有弱-中度的完全、基底外側(cè)或側(cè)面細(xì)胞膜染色），+++（在≥10%的腫瘤細(xì)胞中有強(qiáng)烈的完全、基底外側(cè)或側(cè)面細(xì)胞膜染色）。0和+視為無或低表達(dá)，++和+++視為過表達(dá)。

1.3 雙色銀染色素原位雜交（DISH） HER/17號(hào)染色體DNA雙探針及試劑均購(gòu)自VENTANA公司，采用VENTANA全自動(dòng)免疫組織化學(xué)儀（Bench Maker XT）對(duì)胃癌伴NED和胃癌HER-2蛋白過表達(dá)（IHC染色HER-2++和+++）的組織進(jìn)行染色。腫瘤組織中計(jì)數(shù)20個(gè)細(xì)胞核17號(hào)染色體（紅色）拷貝平均值和HER-2基因（黑色）拷貝平均值。17號(hào)染色體拷貝數(shù)可表現(xiàn)為單倍體（1個(gè)紅色信號(hào)）、整倍體（2個(gè)紅色信號(hào)）和多倍體（≥3個(gè)紅色信號(hào)）。HER-2基因拷貝平均值與17號(hào)染色體拷貝平均值的比值≥2.0且＜6.0為擴(kuò)增，比值＜2.0為無擴(kuò)增，比值≥6.0為簇?cái)U(kuò)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)處理應(yīng)用SPSS 19.0軟件，2組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)，兩變量間的相關(guān)性應(yīng)用χ2檢驗(yàn)并計(jì)算列聯(lián)系數(shù)進(jìn)行分析，生存時(shí)間為胃癌手術(shù)之日至最后1次隨訪或死亡時(shí)間，并對(duì)其進(jìn)行Log-rank檢驗(yàn)，作出Kaplan-Meier生存曲線。運(yùn)用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型評(píng)估伴或不伴NED及各種臨床病理因素對(duì)胃癌患者預(yù)后的影響。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HER-2的蛋白表達(dá)水平和HER-2基因擴(kuò)增情況 HER-2蛋白陽性信號(hào)定位于細(xì)胞膜，胞質(zhì)著色罕見。胃癌NED組中HER-2蛋白表達(dá)情況為：0～+56例，++12例，+++2例，過表達(dá)率為20.00% （14/70），胃癌組中HER-2蛋白表達(dá)情況為：0～+ 118例，++17例，+++15例，過表達(dá)率為21.33%（32/ 150）。2組表達(dá)情況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.384，P＞0.05），見圖1。HER-2基因DISH染色信號(hào)定位于細(xì)胞核。胃癌NED組的基因擴(kuò)增6例（8.57%），胃癌組的基因擴(kuò)增22例（14.67%），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.095，P＞0.05），見圖2。HER-2基因擴(kuò)增情況：6例胃癌NED組中整倍體擴(kuò)增1例，多倍體擴(kuò)增3例，整倍體簇?cái)U(kuò)2例。22例胃癌組中整倍體擴(kuò)增6例，多倍體擴(kuò)增14例，整倍體簇?cái)U(kuò)2例，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.296，P＞0.05）。

Fig.1 Positive HER-2 expression in gastric carcinoma with NED（SP，×400）圖1 胃癌NED組HER-2蛋白+++（SP，×400）

Fig.2 HER-2 amplification and Chromosome 17 euploid in gastric carcinoma with NED（DISH，×400）圖2 胃癌NED組HER-2基因擴(kuò)增，17號(hào)染色體整倍體（DISH，×400）

2.2 胃癌NED組17號(hào)染色體多體與HER-2基因擴(kuò)增的相關(guān)性 HER-2基因擴(kuò)增的胃癌NED組中17號(hào)染色體整倍體3例，多倍體3例，HER-2基因不擴(kuò)增的胃癌NED組中17號(hào)染色體整倍體60例，多倍體 4例，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2= 19.782），胃癌伴NED17號(hào)染色體多倍體與HER-2基因擴(kuò)增存在關(guān)聯(lián)性（r=0.471，P＜0.05）。

2.3 生存分析

2.3.1 生存率分析結(jié)果 中位隨訪時(shí)間17個(gè)月（5～36個(gè)月），胃癌NED組HER-2基因擴(kuò)增患者術(shù)后1年生存率為66.66%，3年生存率為0，中位生存期為13個(gè)月，胃癌NED組HER-2基因不擴(kuò)增患者術(shù)后 1年生存率為 65.33%，3年生存率為26.56%，中位生存期為19個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.116，P＜0.05），見圖3。

Fig.3 Kaplan-Meier survival curves of HER-2 gene amplification and HER-2 gene non-amplification in gastric cancer patients with NED圖3 胃癌伴NED患者HER-2基因擴(kuò)增組與不擴(kuò)增組Kapla-Meier生存曲線

Tab.1 Variable assignment of factors influencing prognosis of gastric cancer表1 胃癌預(yù)后影響因素變量賦值情況

2.3.2 多因素分析 以生存狀態(tài)為因變量（生存=0，死亡=1），以胃癌伴或不伴NED、HER-2基因是否擴(kuò)增、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期、性別、年齡、手術(shù)方式為自變量，將各因素納入COX風(fēng)險(xiǎn)比例模型，見表1、2。結(jié)果顯示胃癌伴或不伴NED、HER-2基因是否擴(kuò)增、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和手術(shù)方式是預(yù)后的獨(dú)立影響因素。

Tab.2 Assessment of independent factors influencing prognosis of gastric cancer patients in COX proportional hazard model表2 運(yùn)用COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型評(píng)估胃癌預(yù)后的影響因素

3 討論

2010 年第4版《世界衛(wèi)生組織消化系統(tǒng)腫瘤》把通過IHC證實(shí)神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞在癌組織中≤30%診斷為胃癌伴NED，歸屬為腺癌范疇。把神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞達(dá)到30%定義為混合性腺神經(jīng)內(nèi)分泌癌［2］。胃腺癌伴NED現(xiàn)象在光鏡下難以判定，而超微結(jié)構(gòu)觀察及免疫組織化學(xué)染色對(duì)診斷具有重要意義，電鏡找到NE顆粒最可靠。由于電鏡標(biāo)本取材局限，制作周期長(zhǎng)，費(fèi)用高，免疫組織化學(xué)NE標(biāo)記相對(duì)是研究NE分化的一種十分實(shí)用、敏感和可靠的手段。CgA、Syn是近年來發(fā)現(xiàn)的作為診斷NE存在和分布的特異性標(biāo)志物。本研究選擇SyN、CgA、CD56 這3種神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物共同應(yīng)用，可以提高NE分化的診斷率，為臨床診斷和治療提供可靠依據(jù)。

染色體的多體是癌細(xì)胞普遍存在的遺傳學(xué)特征之一。因?yàn)镠ER-2基因定位在17號(hào)染色體上，17號(hào)染色體多體可影響HER-2基因擴(kuò)增的判讀［3］。17號(hào)染色體出現(xiàn)多體時(shí)，HER-2基因也同步擴(kuò)增，從而出現(xiàn)了HERZ基因擴(kuò)增的假陽性結(jié)果，因此檢測(cè)HERZ-2基因擴(kuò)增必須同時(shí)有17號(hào)染色體作為參考，這樣可以避免17號(hào)染色體多體產(chǎn)生的假陽性結(jié)果［3］。本研究在胃癌和胃癌伴NED患者的HER-2 DISH檢測(cè)結(jié)果中均發(fā)現(xiàn)HER-2基因/17號(hào)染色體共擴(kuò)增的情況，而且HER-2基因擴(kuò)增的胃癌NED組出現(xiàn)17號(hào)染色體多體的概率比HER-2基因無擴(kuò)增組更高。DISH檢測(cè)HER-2基因狀態(tài)時(shí)應(yīng)用不同顏色的熒光信號(hào)同時(shí)標(biāo)記了HER-2基因和17號(hào)染色體著絲粒，DISH比值法在17號(hào)染色體為異倍體時(shí)校正了17號(hào)染色體拷貝數(shù)差異的影響，是比IHC更準(zhǔn)確的方法。

目前大量的研究發(fā)現(xiàn)，在多種惡性腫瘤中存在HER-2基因的異常擴(kuò)增，并且與其預(yù)后不良有關(guān)。HER-2在胃癌發(fā)生中起關(guān)鍵作用，其擴(kuò)增率或過表達(dá)率為7%～34%，HER-2陽性的胃癌可能預(yù)示腫瘤惡性程度高和預(yù)后不良［4］。胃癌伴NED患者的術(shù)后生存情況，各文獻(xiàn)報(bào)道不同。Naritomi等［5］研究發(fā)現(xiàn)胃癌伴NED的患者術(shù)后生存時(shí)間較短，預(yù)后差。于紅梅等［6］也得出了相似的結(jié)論。但有學(xué)者認(rèn)為胃腺癌中神經(jīng)內(nèi)分泌分化細(xì)胞雖然可能不是獨(dú)立的提示患者預(yù)后的因素，但可以在一定程度上影響腫瘤的分級(jí)和分期。胃癌伴NED HER-2基因擴(kuò)增及蛋白表達(dá)情況國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少。本研究發(fā)現(xiàn)雖然胃癌伴NED是胃癌的特殊類型，但胃癌伴NED患者的HER-2基因擴(kuò)增和蛋白表達(dá)情況和不伴NED的胃癌相同。HER-2基因擴(kuò)增的胃癌伴NED患者術(shù)后生存期短于不擴(kuò)增患者，且胃癌伴或不伴NED、HER-2基因是否擴(kuò)增、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和手術(shù)方式是預(yù)后的獨(dú)立影響因素。ToGA研究顯示，在歐美國(guó)家和日本，曲妥珠單抗聯(lián)合化療成為目前治療HER2陽性胃癌患者的最佳選擇［7］。這個(gè)結(jié)果引起了廣泛關(guān)注，使胃癌的靶向治療成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。張小田等［8］也認(rèn)為曲妥珠單抗聯(lián)合化療治療HER2陽性胃癌安全有效，將其應(yīng)用于二線化療、維持治療亦可能使患者獲益。中國(guó)15家研究中心參與的ToGA試驗(yàn)證實(shí)曲妥珠單抗聯(lián)合化療可作為HER-2陽性的中國(guó)晚期胃或胃食管結(jié)合部腺癌新的標(biāo)準(zhǔn)治療［9］。對(duì)于胃癌伴NED且HER-2陽性患者使用曲妥珠單抗聯(lián)合化療能否作為無法手術(shù)的局部進(jìn)展期或轉(zhuǎn)移性胃或胃食管結(jié)合部腺癌新的治療選擇還需要進(jìn)一步研究。

［1］Gravalos C，Jimeno A.HER2 in gastric cancer：a new prognostic factor and a novel therapeutic target［J］.Ann Oncol，2008，19：1523-1529.

［2］Pericleous M，Toumpanakis C，Lumgair H，et al.Gastric mixed ade? noneuroendocrine carcinoma with a trilineage cell differentiation: case report and review of the literature［J］.Case Rep Oncol，2012，5 （2）:313-319.

［3］Zhao P，Jiang XG，Li XY，et al.Clinicopathological application of fluorescence in situ hybridization technique to diagnose and anal?yse HER-2 gene amplification and chromosome 17 polysomy in in?vasive ductalbreast cancer tissues［J］.Chinese Journal of Cancer Pre?vention and Treatment，2011，18（9）:680-683.［趙坡，姜學(xué)革，李曉瑛，等.FISH檢測(cè)乳腺癌HER-2基因擴(kuò)增及17號(hào)染色體多體狀況及其臨床病理學(xué)意義的分析［J］.中華腫瘤防治雜志，2011，18（9）:680-683］.

［4］Pietrantonio F，De Braud F，Da Prat V，et al.A review on biomark?ers for prediction of treatment outcome in gastric cancer［J］.Antican?cer Res，2013，33（4）:1257-1266.

［5］Naritomi K，F(xiàn)utami K，Arima S，et al.Malignant potential regarding mucin phenotypes and endocrine cell differentiation in gastric ade?nocarcinoma［J］.Anticancer Res，2003，23（6a）:4411-4422.

［6］Yu HM，Liu XW，Long ZW，et al.Analysis of clinicopathological features and prognosis of gastric cancer with neuroendocrine cell differentiation［J］.China Oncology，2013，23（1）：42-46.［于紅梅，劉曉文，龍子雯，等.胃癌伴神經(jīng)內(nèi)分泌分化的臨床病理及預(yù)后分析［J］.中國(guó)癌癥雜志，2013，23（1）：42-46］.

［7］Sawaki A，Ohashi Y，Omuro Y，et al.Efficacy of trastuzumab in Jap?anese patients with HER2-positive advanced gastric or gastroesoph?ageal junction cancer：a subgroup analysis of the Trastuzumab for Gastric Cancer（ToGA）study［J］.Gastric Cancer，2012，15：313-322.

［8］Zhang XT，Wu YH，Gong JF，et al.Clinical application of trastuzumab plus chemotherapy in the treatment of HER2-positive gastricor gastrooesophageal junction adenocarcinoma:a retrospective analysis of 75 cases［J］.Med J Chin PLA，2014，39（3）:206-211.［張小田，伍遠(yuǎn)航，龔繼芳，等.曲妥珠單抗在HER2陽性胃或胃食管結(jié)合部腺癌中的臨床應(yīng)用實(shí)踐：75例回顧性研究［J］.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2014，39（3）: 206-211］.doi:10.11855/j.issn.0577-7402.2014.03.08.

［9］Shen L，Xu JM，F(xiàn)eng FY，et al.Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for first line treatment of HER2-positive advanced gastric or gustroesophageal junction can?cer：a PhaseⅢ，multi-center，randomized controlled trial，Chinese subreport［J］.Chinese Journal of Oncology，2013，4（35）:295-300.［沈琳，徐建明，馮奉儀，等.曲妥珠單抗聯(lián)合化療一線治療人表皮生長(zhǎng)因子受體2陽性無法手術(shù)的局部進(jìn)展期或轉(zhuǎn)移性胃或胃食管結(jié)合部腺癌的多臨床試驗(yàn)中國(guó)亞組報(bào)告中心隨機(jī)對(duì)照Ⅲ期［J］.中華腫瘤雜志，2013，4（35）:295-300］.

（2014-05-07收稿 2014-11-13修回）

（本文編輯 魏杰）

Roles of HER-2 gene amplification and protein expression in gastric carcinoma with neuroendocrine differentiation

SONG Wei1，YU Qingkai1△，ZHANG Jingjing2，ZHANG Jianbo1，SUN Miaomiao1
1 Department of Pathology，Affiliated Cancer Hospital of Zhengzhou University，Henan 450003，China；2 Department of Car?diology，Zhengzhou Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University
△Corresponding Author E-mail：yuqingkai@hotmail.com

Objective To evaluate the gene amplification and protein expression of HER-2 in gastric carcinoma with or without neuroendocrine differentiation（NED），and to explore the difference in HER-2 gene profile between these two neo?plasms.Methods Cases of gastric carcinoma with NED（n=70）and cases of gastric carcinoma without NED（n=150）were retrospectively reviewed.Gene amplification and protein expression of HER-2 genes in gastric carcinoma with or without NED were detected by combination of immunohistochemical method（IHC）and double color silver dye for in situ hybridiza?tion（DISH）.Prognosis of gastric cancer patients with NED were predicted using Kaplan-Meiers survival analysis.Results Expression rates of HER-2 in gastric cancer with and without NED are 20.00%and 21.33%respectively.Amplification of HER-2 in gastric cancer with and without NED are 8.57%and 14.67%respectively.Gene amplification and protein expres?sion of HER-2 between gastric cancer with NED and without NED showed no statistical difference.Chromosome 17 multibody positively correlated with gene HER-2 amplification in Gastric carcinoma with NED.Postoperative survival period in patients of gastric carcinoma with NED and HER-2 amplification was shorter than that in patients of gastric carcinoma with?out NED but with HER-2 amplification.Gastric carcinoma with or without NED，HER-2 gene amplification，lymph node me?tastasis and operation method obviously correlate with prognosis of gastric carcinoma patients（P＜0.05）.Conclusion The gastric cancer with NED is a special type of gastric cancer，there was no difference of gene amplification and protein expres?sion of HER-2 gene between gastric carcinoma with NED and without NED.Poor prognosis would be expected in gastric can?cer patients with NED and HER-2 amplification.

carcinoma，neuroendocrine；stomach neoplasms；proto-oncogene proteins；in situ hybridization；gene am?plification；HER-2；protein expression

R735.2

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.04.014

河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)項(xiàng)目（2011020159，200803121）；河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究項(xiàng)目（102300410038）；河南省公益科研所預(yù)研項(xiàng)目（082103810505）

1鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科（郵編450003）；2鄭州大學(xué)附屬中心醫(yī)院心內(nèi)科

宋魏（1980），女，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤病理學(xué)方面研究

△E-mail:yuqingkai@hotmail.com