韓曉磊，王　丹，徐　濤，朱綠定，王富凱，韓曜平，朱慶華

（1.常熟理工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500；2.常州市武進(jìn)區(qū)前黃鎮(zhèn)農(nóng)技農(nóng)機(jī)站，江蘇 常州 213100；3.常州市秋余水產(chǎn)養(yǎng)殖專業(yè)合作社，江蘇 常州 213100）

大鱗副泥鰍部分線粒體基因的序列分析研究

韓曉磊1，王丹2，徐濤1，朱綠定3，王富凱1，韓曜平1，朱慶華3

（1.常熟理工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500；2.常州市武進(jìn)區(qū)前黃鎮(zhèn)農(nóng)技農(nóng)機(jī)站，江蘇 常州 213100；3.常州市秋余水產(chǎn)養(yǎng)殖專業(yè)合作社，江蘇 常州 213100）

通過(guò)PCR和DNA測(cè)序技術(shù)，獲得了大鱗副泥鰍（Paramisgurnus dabryanus）線粒體基因組的部分序列，所得4段序列長(zhǎng)度共計(jì)11552 bp，包括5個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因（ND1、ND2、ND4、ND4L、ND6和Cytb），14個(gè)tRNA基因.本研究獲得序列的堿基組成為A 28.9%、C 27.7%、G 15.7%、T 27.7%，可看出（A+T）＞（C+G）；測(cè)出的蛋白編碼基因的堿基都有一個(gè)明顯的現(xiàn)象，就是G的含量很明顯的少于其他堿基，而C的含量都比較高，并且（A+T）＞（C+G），這樣的結(jié)果表現(xiàn)出明顯的反G偏倚和堿基組成偏好性.將大鱗副泥鰍Cytb序列與GenBank其他6種魚(yú)類的Cytb序列進(jìn)行%對(duì)，表明大鱗副泥鰍與洛東江高麗鰍和俄羅斯泥鰍親緣關(guān)系最近.用NJ法構(gòu)建7種魚(yú)類的進(jìn)化關(guān)系樹(shù)，結(jié)果表明：大鱗副泥鰍與洛東江高麗鰍和俄羅斯泥鰍最先聚類，再與其他鰍科魚(yú)類相聚，最后與鯉科魚(yú)類斑馬魚(yú)相聚，結(jié)果與傳統(tǒng)分類一致.

大鱗副泥鰍；線粒體DNA；NADH還原酶復(fù)合體；Cytb

大鱗副泥鰍（Paramisgurnus dabryanus）隸屬于鯉形目，鰍科，花鰍亞科，副泥鰍屬，主要分布于四川、江蘇、浙江、臺(tái)灣，遼寧、黑龍江等地，具有很高的食用價(jià)值，俗稱“水中人參”［1-3］.大鱗副泥鰍現(xiàn)已成為我國(guó)出口韓國(guó)的重要水產(chǎn)品之一，且在國(guó)內(nèi)市場(chǎng)的需求量也在不斷攀升.作為一種優(yōu)良的養(yǎng)殖品種，它是中國(guó)近年養(yǎng)殖規(guī)模發(fā)展較快的名優(yōu)魚(yú)類，許多省份已開(kāi)始規(guī)?；B(yǎng)殖生產(chǎn)［4-7］.動(dòng)物mtDNA是共價(jià)閉合的雙鏈DNA分子，核酸序列和組成比較保守，基因的排列順序比較穩(wěn)定而且緊密，無(wú)重組和單拷貝.由于mtDNA含有豐富的進(jìn)化信息，具有長(zhǎng)度短、含量豐富、母性遺傳和進(jìn)化速度快等特點(diǎn)，已成為研究動(dòng)物起源進(jìn)化以及群體遺傳分化的理想對(duì)象［8-13］.本實(shí)驗(yàn)采用PCR技術(shù)，獲得大鱗副泥鰍部分線粒體DNA的序列，為大鱗副泥鰍的系統(tǒng)分類提供分子水平的證據(jù)，并對(duì)其種屬水平的分類研究進(jìn)行了初步探討，同時(shí)也為今后大鱗副泥鰍的資源保護(hù)、開(kāi)發(fā)和養(yǎng)殖提供相應(yīng)的理論依據(jù).

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)樣品

大鱗副泥鰍，取自常州市武進(jìn)區(qū)水產(chǎn)推廣站大鱗副泥鰍良種場(chǎng)，運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室后進(jìn)行活體宰殺，迅速采集肌肉組織后放于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1基因組DNA提取

基因組DNA提取參照《分子克隆試驗(yàn)指南》［14］.用Eppendorf公司生產(chǎn)的Bio Photometer核酸檢測(cè)儀檢測(cè)DNA溶液濃度與純度，并將濃度稀釋至30 ng/μL，置-20℃保存?zhèn)溆?

1.2.2線粒體DNA基因片段的擴(kuò)增

從GenBank下載了與大鱗副泥鰍親緣關(guān)系較近的3種鰍科魚(yú)類（Cobitis striata，Misgurnus anguillicaudatus，Misgurnus nikolskyi）線粒體基因組全序列并采用DNAMAN5.0進(jìn)行比對(duì)，尋找保守區(qū)域，設(shè)計(jì)了7對(duì)PCR引物（表1），引物合成由上海生工完成.用PE9600型PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng).PCR反應(yīng)的總體積為50 μL，其中包括5 μL的10×Reaction Buffer，1 μL dNTP mix（10 mmol/L），引物F和R各1 μL（25 μmol/L），0.4 μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL），1 μL總DNA（約100 ng），加滅菌雙蒸水至終體積.PCR反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，運(yùn)行35個(gè)循環(huán)，然后再延伸10 min.最后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳（內(nèi)有溴化乙錠）中電泳，以DL2000 marker為分子量標(biāo)記，電泳結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)中拍照.

1.2.3DNA序列測(cè)定

表1　大鱗副泥鰍線粒體擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)

將PCR產(chǎn)物割膠純化（純化試劑盒購(gòu)自中科開(kāi)瑞生物技術(shù)公司），然后送往上海英駿生物工程公司進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序在ABI3730測(cè)序儀上進(jìn)行.

1.2.4數(shù)據(jù)分析

所獲得的序列經(jīng)校對(duì)后，采用ClustalX1.83軟件進(jìn)行比對(duì)，用MEGA5.1軟件進(jìn)行分析.根據(jù)Kimura雙參數(shù)模型計(jì)算遺傳距離，用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，采用bootstrap檢驗(yàn)，重復(fù)次數(shù)為1000次.

2　結(jié)果與分析

表2　大鱗副泥鰍部分線粒體基因

2.1大鱗副泥鰍部分線粒體DNA序列

本實(shí)驗(yàn)共測(cè)定拼接完成4段大鱗副泥鰍的線粒體基因，拼接后長(zhǎng)度分別為2790 bp、2861 bp、1859 bp和4042 bp，其中包括6個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因（ND1、ND2、ND4、ND4L、ND6和Cytb，14個(gè)tRNA基因，也注明了各個(gè)基因的起始位點(diǎn)和終止位點(diǎn)（表2）.

2.2蛋白質(zhì)編碼基因的序列分析

魚(yú)類線粒體基因組共編碼13個(gè)蛋白質(zhì)，包括：細(xì)胞色素b（Cytb），2個(gè)ATP酶的亞單位（ATPase8和ATPase6），3個(gè)細(xì)胞色素C氧化酶的亞單位（COI，Ⅱ，Ⅲ），7個(gè)NADH還原酶復(fù)合體的亞單位（ND1，2，3，4，4L，5和6）.我們獲得了部分蛋白質(zhì)編碼基因（ND1、ND2、ND4、ND4L、ND6和Cy?tb），分析了其堿基組成及密碼子的使用情況.

2.2.1ND1基因

大鱗副泥鰍ND1基因的序列長(zhǎng)度為972 bp（表2）.堿基T、C、A、G分別是30.5%、27.6%、27.5%、14.5%；密碼子第三位上堿基T、C、A、G分別是29.6%、23.8%、41.7%、4.9%（表3）.比較ND1基因總的堿基組成和第三位點(diǎn)的堿基組成，發(fā)現(xiàn)A的含量都比較高.比較ND1基因三個(gè)位點(diǎn)的堿基組成，發(fā)現(xiàn)第一位點(diǎn)C含量稍高；第二位點(diǎn)T含量最高，為40.4%，存在反G偏移，含量為11.4%；第三位點(diǎn)A含量最高，為41.7%，存在反G偏移，含量為4.9%.

將大鱗副泥鰍ND1基因核苷酸序列翻譯為氨基酸序列時(shí)，在所有密碼子中，UUG，CCG，UAG，CAG，AAG，UGU，UGC，CGG，AGU，AGA，AGG都沒(méi)有使用到.使用頻率最高的是CUA密碼子（30.0），其次是AUU 和GCC密碼子（都是18.0）；GGG，UGG，GAU，UAA，GCG，ACG，CUG密碼子使用情況均為1.0.由于篇幅有限，此處及下文的密碼子使用情況表格均未列出.

2.2.2ND2基因

大鱗副泥鰍ND2基因的序列長(zhǎng)度為1047 bp（表2）.堿基T、C、A、G分別為25.7%、30.0%、30.5%、13.8%；密碼子第三位上堿基T、C、A、G含量分別為38.4%、34.7%、15.8%、11.2%（表3）.比較ND2基因總的堿基組成和第一位點(diǎn)和第三位點(diǎn)的堿基組成，發(fā)現(xiàn)C的含量都比較高，第一位點(diǎn)C含量很高，為30.0%，存在反G偏移，只有8.0%；第三位點(diǎn)T含量最高，為38.4%.C為34.7%，G為11.2%，存在反G偏移.

表3　大鱗副泥鰍ND1基因密碼子各位置的堿基組成及含量（%）

將大鱗副泥鰍ND2基因核苷酸序列翻譯為氨基酸序列時(shí)，在所有密碼子中，CCG，UCG，GCG，UAG，GAA，GAG，CGA，CGG，GGA都沒(méi)有使用到.使用頻率最高的是CCU密碼子（28.0），其次是AAC密碼子（25.0）；GUU，GUA，GCA，GAU，CGU密碼子使用情況均為1.0.

2.2.3ND4基因

大鱗副泥鰍ND4基因的序列長(zhǎng)度為383 bp（表2）.堿基T、C、A、G含量分別為26.9%、31.9%、27.2%、14.1%；密碼%第三位上堿基T、C、A、G含量分別為27.6%、30.7%、29.9%、11.8%（表3）.比較ND4基因總的堿基組成和第一、二、三位點(diǎn)的堿基組成，發(fā)現(xiàn)C的含量都比較高，第一位點(diǎn)C含量很高，為35.9%，存在反G偏移，含量為18.0%；第二位點(diǎn)A含量最高，C為28.8%，存在反G偏移，含量為12.5%；第三位點(diǎn)C含量最高，為30.7%，G為11.8%，存在反G偏移.

將大鱗副泥鰍ND4基因核苷酸序列翻譯為氨基酸序列時(shí)，在所有密碼子中，CCG，CGG，AUU，AGU，AGC，AUG，ACG，AGG，GGC，GUA，GUG，GCG，GAG，GGG，UCG，UGA，CGU都沒(méi)有使用到.使用頻率最高的是CAA，CCC密碼子（6.0），其次是CUA，CCA密碼子（5.0）；CUC，AUA，AAA，AAG，GCA，GAA，CGC，CGA，GGU密碼子使用情況均為1.0.

2.2.4ND4L基因

大鱗副泥鰍ND4L基因的序列長(zhǎng)度為197 bp（表2）.堿基T、C、A、G含量分別為29.9%、31.5%、19.8%、18.8%；密碼子第三位上堿基T、C、A、G含量為46.2%、29.2%、9.2%、15.4%（表3）.比較ND4L基因總的堿基組成和第三位點(diǎn)的堿基組成，發(fā)現(xiàn)C的含量都比較高.比較ND4L基因三個(gè)位點(diǎn)的堿基組成，發(fā)現(xiàn)第一位點(diǎn)C含量很高，為30.3%，存在反G偏移，含量為10.6%；第三位點(diǎn)T含量最高，為46.2%，C為29.2%，存在反G偏移，含量為15.4%.

將大鱗副泥鰍ND4L基因核苷酸序列翻譯為氨基酸序列時(shí)，在所有密碼%中，UUU，UCC，UUA，UUG，UCG，UAG，CAU，CGU，CCC，CUA，CAA，CGA，CGG，AGU，AUA，AAA，AUG，ACG，AAG，GUU，GGU，GUC，GCC，GAC，GUA，GCA，GAA，GGA，GUG，GCG，GAG，GGG都沒(méi)有使用到.使用頻率最高的是CCU密碼子（8.0），其次是AUU密碼子（5.0）；UUC，CUU，CUC，UCA，CCA，CCG，ACC，ACA，CAG，AAC，GAU，UGU，UGG，AGA密碼子使用情況均為1.0.

2.2.5ND6基因

大鱗副泥鰍ND6基因的序列長(zhǎng)度為522 bp（表2）.各堿基T、C、A、G含量分別為18.2%、30.8%、38.1%、12.8%；密碼子第三位上堿基T、C、A、G含量為23.0%、28.7%、40.2%、8.0%（表3）.比較ND6基因總的堿基組成和第二、三位點(diǎn)的堿基組成，發(fā)現(xiàn)C的含量都比較高.第二位C含量最高，為40.8%，存在反G偏移，含量為12.1%；第三位A含量最高，為40.2%，C的含量為28.7%，存在反G偏移，含量為4.9%.

將大鱗副泥鰍ND6基因核苷酸序列翻譯為氨基酸序列時(shí)，在所有密碼子中，UUU，UGU，UGC，UGA，CGU，CUG，CCG，CAG，ACG，GUA，GUG，GG%都沒(méi)有使用到.使用頻率最高的是AAA密碼子（13.0），其次是AUU和CCC密碼子（都是11.0）；UCU，UUC，UUA，UUG，UGG，CUU，CAU，CUC，CGG，AGU，AUC，AUG，AGG，GAU，GUC，GGC，GGA，GCG密碼子使用情況均為1.0.

2.2.6Cytb基因

大鱗副泥鰍Cytb基因的序列長(zhǎng)度為1142 bp（表2）.各堿基T、C、A、G含量分別為30.6%、27.0、27.3、15.1%（表3）.比較Cytb基因總的堿基組成和第一、二位點(diǎn)的堿基組成，發(fā)現(xiàn)C的含量都比較高.比較Cytb基因三個(gè)位點(diǎn)的堿基組成，發(fā)現(xiàn)第一位點(diǎn)C含量很高，為25.7%，存在反G偏移，含量為13.4%；第二位點(diǎn)C含量明顯高于G，為29.4%，存在反G偏移，含量為7.6%.

將大鱗副泥鰍Cytb基因核苷酸%列翻譯為氨基酸序列時(shí)，在所有密碼子中，GUC，GUA，GCG，CGU，AGG，GGC都沒(méi)有使用到.使用頻率最高的是UUC密碼子（19.0），其次是AUU密碼子（5.0）；CGC，CGA，CGG，AGU，AGC，GGA密碼子使用情況均為1.0.

2.3基于Cytb的大鱗副泥鰍系統(tǒng)分類分析

2.3.1大鱗副泥鰍Cytb與其他物種的同源性比較

利用DNAMAN5.0軟件，將大鱗副泥鰍Cytb的DNA序列與泥鰍，丘氏益秀朝鮮鰍，洛東江高麗鰍，俄羅斯泥鰍，后鰭花鰍和斑馬魚(yú)6個(gè)物種分別進(jìn)行比對(duì)，得到大鱗副泥鰍與其他物種的同源性系數(shù).從表10中可知，大鱗副泥鰍與其他幾種鰍科魚(yú)類的堿基同源性均在為85%～88%之間，以洛東江高麗鰍同源性最高，丘氏益秀朝鮮鰍同源性最低.

2.3.2不同物種間的遺傳距離

利用MEGA5.1軟件計(jì)算出各個(gè)物種間的遺傳距離，結(jié)果見(jiàn)表11（左下角為遺傳距離，右上角為同源性系數(shù)）.由表可知，大鱗副泥鰍與洛東江高麗鰍之間的遺傳距離最小，為0.147，其次是俄羅斯泥鰍，為0.159；與斑馬魚(yú)的遺傳距離最大，為0.303. 2.%.3基于大鱗副泥鰍Cytb序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

利用ClustalX1.83和MEGA5.1軟件，將大鱗副泥鰍Cytb序列與其他6個(gè)物種進(jìn)行比對(duì).再用MEGA5.1軟件中的NJ法構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)（圖1）.以斑馬魚(yú)為外類群，其余6個(gè)物種為內(nèi)群，從所構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)可以看出，內(nèi)群的6個(gè)物種分為2個(gè)支系，第1支系由丘氏益秀朝鮮鰍、后鰭花鰍和泥鰍組成；第2支系由大鱗副泥鰍、俄羅斯泥鰍和洛東江高麗鰍組成，這六種魚(yú)類都是鰍科，但分屬于不同的屬.大鱗副泥鰍與洛東江高麗鰍的親緣關(guān)系最近，與丘氏益秀朝鮮鰍親緣關(guān)系最遠(yuǎn).

3　討論

表10　大鱗副泥鰍與其他物種Cytb同源性比較

3.1MtDNA編碼基因的序列特征分析

NADH還原酶復(fù)合體亞單位ND1、ND2、ND4、ND4L和ND6以及Cytb蛋白質(zhì)編碼基因中，都很明顯存在反G偏移.ND1的第一、三位，ND2第一、三位，ND4第一、二、三位，ND4L第一、三位，ND6第二、三位，分析這幾個(gè)基因的堿基組成發(fā)現(xiàn)，C的含量比較高，G的含量相對(duì)較低.分析這個(gè)基因三個(gè)位點(diǎn)的堿基組成發(fā)現(xiàn)，第一、二、三位存在的反G偏移概率較高，第四位堿基反G概率較低，說(shuō)明第一、二、三位點(diǎn)對(duì)核苷酸有使用偏好.在脊椎動(dòng)物中，第三位的反G偏移主要是因?yàn)樵撐坏膲A基在進(jìn)化上選擇壓力比其他兩位小，表現(xiàn)出明顯的反G偏倚和堿基組成偏好性.

表11　幾種鰍科魚(yú)類遺傳距離比較

3.2大鱗副泥鰍Cytb在系統(tǒng)分類中的適用性

從表11的各個(gè)物種間的遺傳距離可知，大鱗副泥鰍與洛東江高麗鰍、俄羅斯泥鰍、后鰭花鰍泥鰍、泥鰍、丘氏益秀朝鮮鰍的遺傳距離較接近（分別是0.147、0.159、0.163、0.178、0.188），與斑馬魚(yú)遺傳距離較遠(yuǎn)（0.305）.另外表10中計(jì)算出的大鱗副泥鰍與洛東江高麗鰍、俄羅斯泥鰍、后鰭花鰍泥鰍、丘氏益秀朝鮮鰍的堿基同源性分別為88%、87%、86%、85%、85%，顯示大鱗副泥鰍與洛東江高麗鰍、俄羅斯泥鰍、后鰭花鰍泥鰍、丘氏益秀朝鮮鰍的關(guān)系較近，與斑馬魚(yú)的堿基同源性為68%，關(guān)系較遠(yuǎn).認(rèn)為這是基于兩種算法有所差別所致，且相差很小.

圖1　由鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)（基于Cytb序列）

進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示：以斑馬魚(yú)為外群，其余6個(gè)物種為內(nèi)群，主要分為2個(gè)支系，第1支系由大鱗副泥鰍與洛東江高麗鰍首先聚為一群，再與俄羅斯泥鰍聚合，BCL值均為80%；第2支系由后鰭花鰍泥鰍、丘氏益秀朝鮮鰍、泥鰍組成，首先由后鰭花鰍泥鰍、丘氏益秀朝鮮鰍組成一群，再與泥鰍聚合，BCL值為72%.

隨著研究的深入，以mtDNA中完整的基因序列或多個(gè)基因序列協(xié)同作用而獲得的遺傳信息來(lái)探討魚(yú)類的系統(tǒng)發(fā)育，將是今后研究的發(fā)展方向，它已在多種魚(yú)類的系統(tǒng)發(fā)育中得到應(yīng)用［15-16］.本研究基于CYTB的幾種魚(yú)系統(tǒng)分類與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類結(jié)果相符［1-2］，可見(jiàn)Cytb基因與mtDNA中16SrRNA、12SrRNA和D-loop區(qū)等是魚(yú)類系統(tǒng)進(jìn)化中有效的分子標(biāo)記手段.

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Sequence Analysis of Several Mitochondrial Genes in Paramisgurnus dabryanus

HAN Xiao-lei1，WANG Dan2，XU Tao1，ZHU Lv-ding3，WANG Fu-kai1，HAN Yao-ping1，ZHU Qing-hua3
（1.School of Biology and Food Engineering,Changshu Institute of Technology,Changshu 215500,China；2.Qianhuang Town Agricultural Machinery Station of Wujin District,Changzhou 213100,China；3.Qiuyu Aquiculture Professional Cooperative,Changzhou 213100,China）

This research obtained a total of 11556bp fragment of the Paramisgurnus dabryanus mitochondrial gene by using PCR method and analyzed the base composition and codon usage of protein genes in this frag?ment.The sequence contains 5 protein-encoding genes（ND1,ND2,ND4,ND4L and ND6）and one tRNA gene 14tRNA gene.The results showed that the average contents of A,T,C and G bases were 28.9%、27.7%、15.7% and 27.7%respectively,indicating a clear preference for base composition.The codon usage,base composition of ND1,ND2,ND4,ND4L,ND6 and Cytb genes and amino acid composition of the encoded proteins were ana?lyzed in this study,providing a basis for the study of genetic variation on P.dabryanus.

Paramisgurnus dabryanus；Mitochondrial DNA；NADH dehydrogenase；Cytb

Q959.468

A

1008-2794（2015）02-0110-06

2014-12-09

常州市科技支撐計(jì)劃（農(nóng)業(yè)）項(xiàng)目“泥鰍種質(zhì)資源保存與提純復(fù)壯技術(shù)研究”（CE20132014）

通訊聯(lián)系人：韓曉磊，實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向：淡水水生生物學(xué)，E-mail：hanxiaolei0724@163.com.