王亞杰，朱順妮，王忠銘，袁振宏

（1 中國科學院廣州能源研究所，中國科學院可再生能源與天然氣水合物重點實驗室，廣東 廣州 510640； 2 中國科學院大學，北京 100039）

引 言

近年來微藻作為生物燃料已成為當下的研究熱點。脂肪和淀粉是微藻細胞中兩種重要的儲能物質[1-2]。研究表明：在環(huán)境脅迫時，如缺氮、高光、高鹽的情況下，微藻細胞進行儲能，促進這些物質合成[3]。

微藻中脂肪和淀粉的合成途徑如圖1所示，二氧化碳經過卡爾文循環(huán)產生 3-磷酸甘油醛（glyceraldehyde-3-P），在淀粉合成途徑中，3-磷酸甘油醛再進一步轉化為葡萄糖-6-磷酸（glucose-6-P）和葡萄糖-1-磷酸（glucose-1-P）。之后由關鍵酶ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)催化轉化成ADP-葡萄糖，再經過一系列反應催化成淀粉[4]。在脂肪合成途徑中，3-磷酸甘油醛通過糖酵解途徑生成丙酮酸（pyruvate），之后被第一個關鍵限速酶乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)催化生成丙二酰輔酶A，再經過一系列反應最終合成脂肪[5-7]。

圖1 脂肪和淀粉合成途徑Fig.1 Lipid and starch synthesis pathway

由此可見，微藻中淀粉的合成與脂肪的合成擁有共同的前體物質3-磷酸甘油醛，有可能存在一定的競爭關系。已有研究表明[8-9]在植物中淀粉和脂肪的合成途徑存在相互關系，但它們之間的調控機制還不清楚。如油菜胚胎的淀粉合成受到抑制會導致脂肪的合成速率減慢，最終成熟種子中的總脂肪含量沒有明顯改變[9]。然而通過失活淀粉分支酶導致不產淀粉的豌豆Pisum sativum突變體卻可以顯著提高種子的脂肪含量。在微藻中，這方面的研究較缺乏，且主要集中在模式生物Chlamydomonas reinhardtti。Wang 等[10]和Li 等[11]分別報道了不產淀粉的突變藻株C.reinhardtiiBAFJ5 在缺氮后含油量比野生型有明顯增加。這些研究表明淀粉和脂肪合成之間可能存在競爭。

前期研究發(fā)現(xiàn)，在脅迫條件下小球藻Chlorellasp.快速積累淀粉作為短期應急響應，而隨著氮脅迫時間的延長，小球藻轉而積累能量密度更高的脂肪作為長期儲能物質[1-2]，但是這兩者的關系還不清楚。因此本文在前期研究的基礎上，在氮脅迫的條件下分別添加淀粉合成途徑關鍵酶AGPase 的抑制劑Pi（無機磷酸鹽）[12-13]或脂肪合成途徑關鍵酶ACCase 的特異性抑制劑稀禾定[14]，原位解析小球藻淀粉和脂肪之間的相互關系。研究結果可以為調控微藻脂肪和淀粉合成提供理論指導[15]，對微藻生物燃料的開發(fā)和應用有著至關重要的意義。

1 材料與方法

1.1 藻種與培養(yǎng)條件

小球藻Chlorellasp.保存在BG-11 培養(yǎng)基中。反應器采用柱狀玻璃管（裝液量為1 L），培養(yǎng)溫度約 25 ℃，24 h 連續(xù)光照，光照強度為 150 μmol·m-2·s-1，在反應器底部持續(xù)通入富加CO2（1%，體積比）的壓縮空氣。

1.2 實驗設計

1.2.1 淀粉合成的抑制實驗 將種子液在BG-11 培養(yǎng)基中通氣培養(yǎng)4 d 至對數(shù)生長期后，分別接種至對照組（缺氮培養(yǎng)基）和實驗組（缺氮培養(yǎng)基加入5 mmol·L-1Pi）中，初始OD750約為0.8，每組實驗設3 個平行，連續(xù)培養(yǎng)6 d，第0、1、2、4、6 d取樣。

1.2.2 脂肪合成的抑制實驗 將種子液在BG-11 培養(yǎng)基中通氣培養(yǎng)4 d 至對數(shù)生長期后，分別接種至對照組（缺氮培養(yǎng)基）和實驗組（缺氮培養(yǎng)基加40 μmol·L-1稀禾定）中，初始OD750約為0.8，每組實驗設3 個平行，在氣升光反應器中通入富加CO2的壓縮空氣（1% CO2），培養(yǎng)溫度24℃，24 h 連續(xù)光照，光照強度為150 μmol·m-2·s-1。連續(xù)培養(yǎng)6 d，第0、1、2、4、6 d 取樣。

1.3 細胞生長測定

在實驗周期內，測定指定天數(shù)的藻細胞干重、細胞計數(shù)。

藻細胞干重：取10 ml 藻液抽濾，于80℃烘箱烘至恒重，冷卻后稱重。

細胞計數(shù)：取少量樣品，加至血球計數(shù)板，在光學顯微鏡下讀取25 個4×4 格中的細胞個數(shù)，進行計算，以107cells·ml-1為單位計數(shù)。

1.4 淀粉的測定

稱取2～4 mg 藻粉，裝入10 ml 玻璃離心管中，向玻璃離心管中加入0.25 ml 超純水和約0.5 ml 的酸洗玻璃珠，在2700 r·min-1下渦旋4 min，進行破壁。加入4 ml 濃度為80%乙醇溶液和轉子(直徑10 mm)，于68℃水浴15 min。水浴后4000 r·min-1離心6 min 去上清，去除色素，重復3 次。加入3.3 ml 30%高氯酸溶液，在25℃下攪拌15 min。攪拌后4000 r·min-1離心6 min，取上清裝入10 ml 容量瓶中，淀粉充分水解，重復3 次。定容至10 ml[16]。采用苯酚-硫酸法測定淀粉含量[17]。

1.5 脂肪的測定

本研究使用一步提取+酯交換反應[18]來進行微藻中脂質轉化為FAMEs，并結合氣相色譜對FAME進行定量。具體方法如下。

藻粉中加入2.5 ml 含2%硫酸的甲醇溶液，80℃下攪拌加熱2.5 h 完成脂肪酸的甲酯化。樣品冷卻至室溫后加入1 ml 飽和NaCl 溶液和1 ml 正己烷，振蕩后靜置分層，通過無水硫酸鈉過濾，加入正十七烷酸甲酯作為內標，定容1 ml。脂肪酸甲酯利用島津GC2010 氣相色譜進行定量分析，檢測器為FID。升溫程序為：190℃保持5 min，以10℃·min-1升溫至250℃，再保持7 min。色譜柱為：DB-WAX，厚度0.25 μm，長度30 m，內徑0.25 μm。

脂肪酸甲酯標樣為購自Sigma 公司正十七烷酸甲酯。

2 結果與討論

2.1 淀粉途徑被抑制

2.1.1 Pi 對細胞生長的影響 小球藻Chlorellasp.在不同培養(yǎng)條件下的生長曲線如圖2所示。小球藻Chlorellasp.初始濃度為0.21 g·L-1，在對照組缺氮培養(yǎng)下，到第4 d 時生物量達到0.70 g·L-1，之后增長放緩，第6 d 生物量達到0.80 g·L-1，生物量總共增長了4 倍。實驗組缺氮加Pi 條件培養(yǎng)下，第4 d 時生物量可達到0.75 g·L-1，之后增長放緩，第6 d 生物量達到0.82 g·L-1，生物量總共增長了4.1 倍，生物量相比對照組變化不明顯，但總體生長趨勢較對照組好。對照組細胞個數(shù)接種時為1.56(107cells)·ml-1，第2 d 達到4.77(107cells)·ml-1，之后增長緩慢甚至略有下降，第 6 d 為5.49(107cells)·ml-1。實驗組在第 2 d 達到4.90(107cells)·ml-1，之后增長緩慢甚至略有下降，第6 d 為5.91(107cells)·ml-1。細胞個數(shù)在第2 d 后緩慢增長甚至略有下降，較對照組而言5 mmol·L-1Pi 可促進細胞的增長，這與Xie 等[19]、Vezie 等[20]的研究報道相一致。

圖2 小球藻在對照組和添加Pi 抑制劑條件下 生物量及細胞個數(shù)曲線Fig.2 Curves of dry weight(DW),cell number (CN) in Chlorella sp.under control and (-N+Pi) conditions

2.1.2 Pi 對淀粉合成的影響 小球藻Chlorellasp.在對照和缺氮加Pi 條件下淀粉濃度和單位細胞淀粉含量隨時間的變化如圖3所示。在對照組，淀粉濃度在第1 d 迅速升高，從初始的30 mg·L-1達到154 mg·L-1。第2 d 有一個小的增幅達178 mg·L-1，之后開始略微下降到第6 d 達154 mg·L-1。對比加Pi組，淀粉濃度在第1 d 也是迅速升高到162 mg·L-1。第2 d 略有升高之后開始緩慢下降，第6 d 達到138 mg·L-1[圖3(a)]。對照單位細胞淀粉含量第1 d 從19.4 μg·(107cells)-1達到32.3 μg·(107cells)-1，第2 d 略微增加然后開始下降，到第6 d 達到27.8 μg·(107cells)-1。實驗組單位細胞淀粉含量第1 d 迅速增至33 μg·(107cells)-1，第2 d 略微增加然后開始下降，到第6 d 達到22.7 μg·(107cells)-1[圖3(b)]。對比Chlorellasp.在兩種條件下的變化，加入Pi 以后，在前2 d 淀粉濃度變化不明顯，淀粉濃度在第2、4、6 d 分別降低了3%、19%、9%。單位細胞淀粉含量在2、4、6 d 分別降低了13%、25%、18%。Lloyd 等[21]發(fā)現(xiàn)在馬鈴薯接種AGPase 可分別與3-磷酸甘油酸（3-PGA）和無機磷（Pi）結合，實現(xiàn)對AGPase 的活性的調控，3-PGA 是該酶激活因子，后者是抑制因子，能夠抑制淀粉合成。Li 等[12]的研究結果表明1 mmol·L-1Pi 即可對Pseudochlorococcumsp.的AGPase 酶活性產生顯著影響，能明顯抑制淀粉的合成。

圖3 小球藻在對照條件和加抑制劑(-N+Pi)條件下淀粉濃度（a）和單位細胞淀粉含量（b）的變化Fig.3 Variations of starch in culturesChlorella sp.under control and (-N+Pi) conditions

2.1.3 Pi 對脂肪合成的影響 小球藻Chlorellasp.在對照和缺氮加Pi 條件下脂肪酸濃度和單位細胞脂肪酸含量隨時間的變化如圖4所示。對照條件下，脂肪酸濃度呈現(xiàn)一直增長的趨勢，在對照組，脂肪 酸濃度從初始28 mg·L-1到第6 d 達到191 mg·L-1。實驗組脂肪酸濃度在第6 d 達到197 mg·L-1[圖4(a)]。對照組單位細胞脂肪酸含量從初始的18.2 μg·(107cells)-1達到34.9 μg·(107cells)-1。加了抑制劑Pi 的實驗組，單位細胞脂肪酸含量在第6 d 達到32.4 μg·(107cells)-1[圖4(b)]。

對比Chlorellasp.在兩種條件下的淀粉和脂肪酸含量變化，表明在本實驗期(6 d)Pi 抑制淀粉合成的同時并沒有同時促進脂肪的積累。Siaut 等[22]對Chlamydomonas reinhardtii的研究結果表明，不產淀粉的突變藻株CW15 sta1-2 等在缺氮后TAG 含量較野生型并沒有明顯增加，反而降低了。Li 等[12]對Pseudochlorococcumsp.的研究表明，加入 1 mmol·L-1的Pi 后AGPase 酶活性第2 d 降低了39.2%，對淀粉的合成有明顯的抑制作用，同時也導致脂肪含量的降低。但是Chlorella pyrenoidosa82T 通過紫外誘變獲得的不產淀粉的突變株，在缺氮條件下積累脂肪酸的含量明顯高于野生型[23]。要想更準確地解析抑制淀粉途徑對脂肪酸途徑的影響，還需要進一步的實驗來驗證。

圖4 小球藻在對照和添加抑制劑(-N+Pi)條件下脂肪酸濃度（a）和單位細胞脂肪酸含量（b）的變化Fig.4 Variations of total fatty acids（TFA） in culturesChlorella sp.under control and (-N+Pi) conditions

2.2 脂肪途徑被抑制

2.2.1 稀禾定對細胞生長的影響 小球藻Chlorellasp.在缺氮和缺氮加稀禾定（sethoxydim）對比條件下的生長曲線如圖5所示。小球藻Chlorellasp.初始濃度為0.19 g·L-1，在對照組，細胞個數(shù)和生物量的長勢與圖1中的對照組一致。而在加稀禾定的實驗組條件下，生物量到第4 d 時已達到0.7 g·L-1，之后增長放緩，第6 d 生物量達到0.74 g·L-1，生物量較對照組沒有顯著變化。說明40 μmol·L-1的稀禾定對細胞生物量的積累影響不大。細胞個數(shù)在第2 d 后就一直低于對照組，到培養(yǎng)的第6 d 較對照組降低了7.3%。結果顯示，加入稀禾定在一定程度上抑制了細胞個數(shù)的增長，而對生物量的影響較小。Zhekisheva 等[24]對Heamatococcus pluvialis的研究 結果發(fā)現(xiàn)20 μmol·L-1和50 μmol·L-1稀禾定對微藻細胞的生長無顯著影響。

圖5 小球藻在對照組和添加稀禾定抑制劑條件下 生物量及細胞個數(shù)曲線Fig.5 Curves of dry weight(DW),cell number(CN) in Chlorella sp.under control and (-N+XHD) conditions

圖6 小球藻在對照和添加抑制劑稀禾定條件下脂肪酸濃度（a）和單位細胞脂肪酸含量（b）的變化Fig.6 Variations of total fatty acids（TFA） in culturesChlorella sp.under control and (-N+XHD) conditions

2.2.2 稀禾定對脂肪合成的影響 有研究表明，稀禾定直接作用位點是ACCase 的羧基轉移酶(CT)功能域[25]。ACCase 是脂肪酸合成途徑的關鍵酶，可以作為稀禾定的靶標位點[14,26]。所以，稀禾定能在一定程度上抑制脂肪酸的合成。加入稀禾定后脂肪酸含量的變化趨勢如圖6所示。前4 d 與對照組相比無明顯變化，第6 d 相比對照組脂肪酸濃度降低了18.8%，單位細胞的脂肪酸含量降低了13.4%。由于缺氮條件下脂肪合成速率較慢[1]，稀禾定對脂肪酸合成的抑制到后期才表現(xiàn)出來。本實驗的結果表明，40 μmol·L-1的稀禾定能夠在一定程度上抑制脂肪的合成。Zhekisheva 等[24]對Heamatococcus pluvialis加入10～50 μmol·L-1稀禾定的研究結果顯示稀禾定能夠很好地抑制脂肪酸的合成，尤其是中性脂（NL）的合成。

圖7 小球藻在對照和添加稀禾定抑制劑條件下淀粉濃度（a）和單位細胞淀粉含量（b）的變化Fig.7 Variations of starch in culturesChlorella sp.under control and (-N+ XHD) conditions

2.2.3 稀禾定對淀粉合成的影響 小球藻Chlorellasp.在加入稀禾定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，淀粉合成的變化趨勢如圖7所示。與對照組相比淀粉合成趨勢相同，都是前2 d 增長迅速，第2 d 以后緩慢增長甚至略有下降。對照組第2 d 淀粉濃度和單位細胞淀粉含量分別是229 mg·L-1和43 μg·(107cells)-1。加入稀禾定的實驗組，第2 d 淀粉濃度和單位細胞淀粉含量分別是200 mg·L-1和41 μg·(107cells)-1。

本實驗的結果表明，抑制脂肪途徑對淀粉無明顯作用，可能因為淀粉是快速積累的產物，脂肪是一個長期緩慢積累的產物。這與Recht 等[18]對Haematococcus pluvialis的研究結果相似，他們用蘋 果酸脫氫酶特異性抑制劑芝麻酚成功抑制了脂肪酸的合成，總糖濃度也略有降低，碳水化合物含量（占干重的百分比）并沒有顯著影響。

3 結 論

（1）缺氮條件下加入Pi 能在一定程度上促進小球藻的生長，對淀粉的合成具有明顯的抑制效應，脂肪酸濃度有所增長，但對單位細胞脂肪酸含量的促進效應不是很明顯。

（2）缺氮條件下加入稀禾定對小球藻細胞的生長有一定的抑制作用，對脂肪酸的合成只在第6 d開始受到明顯抑制，淀粉濃度降低，但單位細胞淀粉含量無顯著影響，可能是由于稀禾定抑制了細胞的生長導致的。

（3）小球藻淀粉和脂肪的合成可能并不是簡單的競爭關系，抑制一方的合成似乎并不能促進另一方合成的增強，需要更進一步的研究。

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