趙旭紅，石海強,2,3，張健，李娜，牛梅紅，平清偉

（1 大連工業(yè)大學輕工與化學工程學院，遼寧 大連 116034；2 華南理工大學制漿造紙工程國家重點實驗室，廣東 廣州 510640；3 齊魯工業(yè)大學制漿造紙科學與技術教育部重點實驗室，山東 濟南 250353）

引 言

在傳統(tǒng)制漿之前增加預水解段提取木質(zhì)纖維半纖維素，通過進一步轉化可生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品，如木糖醇、燃料乙醇等[1-3]，預水解后物料可分離制備木素并獲得紙漿。該技術路線復合生物質(zhì)精煉發(fā)展理念，具有技術基礎和成本優(yōu)勢。研究發(fā)現(xiàn)預水解分離半纖維素過程中，部分木質(zhì)素也發(fā)生降解轉化成低分子酚類物質(zhì)進入到水解液中，這部分物質(zhì)在半纖維素水解液的生物轉化過程中對微生物的發(fā)酵行為有很強的活性抑制作用[4-6]。而且這部分木素酚類物質(zhì)分子量小，溶解性強，去除困難[7]。準確快速地定量測定預水解液中的溶解性木素酚類物質(zhì)含量，是預水解液的脫毒處理和降低木素降解溶出新技術研發(fā)過程中亟待解決的一個問題。

木質(zhì)纖維原料和紙漿中木素定量通常采用克拉森法和酸溶木素測定法。目前水溶解性木素一般借鑒酸溶木素方法，采用紫外分光光度計測定[8-9]。與原料木素分析法不同，預水解過程是在高溫熱水體系中進行，預水解液中除了溶解性木素酚類物質(zhì)外，還含有源于半纖維素和木素的降解產(chǎn)物，如糠醛、5-羥甲基糠醛（5-HMF）、甲酸、乙酸和乙酰丙酸等物質(zhì)[10]。研究證實，由戊糖和己糖單元脫水形成的糠醛和羥甲基糠醛（HMF）物質(zhì)，在280 nm附近有紫外特征吸收[11]，柴欣生等[12]采用三波長紫外光譜技術對桉木熱水提取液中糠醛和羥甲基糠醛進行了測定，證明方法的可行性。前期研究還發(fā)現(xiàn)，甲酸和乙酸等物質(zhì)在205 nm 處有顯著吸收，從而干擾溶解性木素酚類物質(zhì)的定量測定。本研究首先對闊葉材相思木和一年生蘆葦在不同預水解條件下的水解液進行190～600 nm 范圍內(nèi)的紫外光譜掃描，研究其光譜特征和吸收峰位置；然后對水解液中可能影響木質(zhì)素測定的物質(zhì)進行了紫外光譜掃描；最后通過硼氫化鈉還原消除糠醛類物質(zhì)的干擾，對水解液中溶解性木素進行了測定，并與傳統(tǒng)酸溶木素測定結果進行比較。同時依據(jù)該方法原理對預水解液中的糠醛類物質(zhì)也進行了定量分析，并與標準物測定結果進行對照。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗原料

實驗中所使用的相思木由亞太森博紙業(yè)提供（產(chǎn)地越南），蘆葦由盤錦振興紙業(yè)提供（產(chǎn)地為遼寧盤錦），貯存期半年左右。

1.2 主要試劑與儀器

試劑：糠醛（furfural）（standard for GC, ≥99.5%，上海晶純生化科技股份有限公司），硼氫化鈉（≥96.0%，國藥集團化學試劑有限公司），甲酸（GR，天津市光復精細化工研究所），冰乙酸（GR，天津市光復精細化工研究所），硫酸(AR，沈陽新興試劑廠)，氫氧化鈉（AR，天津市科密歐化學試劑有限公司）。

儀器：紫外光譜儀（Cary300，VARIAN），1cm石英比色皿，真空旋轉蒸發(fā)儀（RV10，IKA），智能油浴與高壓反應釜(ZKYY-10L)，低溫循環(huán)冷卻裝置（DLSB-5/25），冷凍干燥器（7740070，LABCONCO）。

1.3 實驗方法

1.3.1 預水解液的制備 相思木片和蘆葦片按固液比1:4 和1:7 在高壓反應釜中進行預水解，反應條件為：160、170℃，保溫20、60 min。水解結束后立即取出反應罐并冷卻，分離固液兩相，將半料漿用水沖洗至不呈酸性為止，自然風干后測定預水解后半料漿的得率及木素含量。收集水解液并用定量濾紙過濾，密閉置于冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 預水解液與標準物的紫外光譜掃描 參照Tappi205 酸溶木素測定方法，用3%H2SO4將水解液稀釋適當倍數(shù)，本實驗為250 倍，并以3%H2SO4為參比液，在19～600 nm 范圍進行紫外光譜掃描。將色譜級甲酸、冰乙酸、糠醛用3%H2SO4稀釋適當倍數(shù)，分別配制成0.61g·L-1、1.049 g·L-1和5.80 mg·L-1的溶液，以3%H2SO4為參比液,在190～600 nm 范圍進行紫外光譜掃描。

1.3.3 硼氫化鈉還原及還原后水解液的紫外光譜分析 取500 μl 水解液到10 ml 的容量瓶中，用0.1 mol·L-1NaOH 溶液中和。然后取400 μl 中和液轉移到25 ml 容量瓶中，加入10 g·L-1的硼氫化鈉溶液100 μl，室溫下反應2 min。反應結束后，用0.1 mol·L-1NaOH 溶液稀釋至25 ml 定容。使用0.1 mol·L-1NaOH 溶液作為參比溶液進行紫外光譜掃描。同時將未處理水解液使用0.1 mol·L-1NaOH溶液稀釋相同倍數(shù)，進行紫外光譜掃描。

1.3.4 溶解性木素的提取及工作曲線的制定 溶解性木素的提?。簩?70℃、60 min 條件下的預水解液真空濃縮后進行提取。具體方法參考文獻[13]。工作曲線制定：精確稱取上述提取木素0.0100 g，用0.1 mol·L-1NaOH 溶解定容于10 ml 容量瓶中，即1.0 g·L-1的標準液。采用逐級稀釋的方法配制濃度為2、10、20、25、40 mg·L-1的木素溶液，采用光度法測定280 nm 處吸光度值，以濃度c（mg·L-1）為橫坐標，吸光度值A 為縱坐標，作標準工作曲線。

1.3.5 醛類標準曲線的制備[14]移取色譜級糠醛(ρ=1.16 g·ml-1)125 μl 至100 ml 容量瓶，用0.1 mol·L-1NaOH 稀釋定容，即1.45 g·L-1的標準溶液。采用逐級稀釋方法配制濃度為5.800、2.900、1.4500、1.1600、0.7250、0.5800、0.3625 mg·L-1的糠醛溶液，用紫外分光光度計分別記錄280 nm處吸光度值，以濃度c（mg·L-1）為橫坐標，吸光度值A 為縱坐標，作標準曲線。

2 結果與討論

2.1 預水解液的紫外光譜分析

圖1 不同條件下相思木預水解液的紫外光譜圖Fig.1 UV spectra of acacia PHL at different conditions

圖2 不同條件下蘆葦預水解液的紫外光譜圖Fig.2 UV spectra of reed PHL at different conditions

不同條件下預水解液的紫外光譜掃描圖如圖1、圖2 所示。由圖可見，預水解液在205 nm 和280 nm 附近出現(xiàn)明顯特征吸收，這兩個位置是木素的典型吸收，是目前進行木素定量測定的主要依據(jù)。隨著預水解溫度提高和時間的延長，同一種原料的水解液吸光度呈增加趨勢，這可能是由于預水解液 中木素含量的增加，也可能是由于產(chǎn)生的干擾物質(zhì)所致。水解液在280 nm 處的吸收強度隨預水解強度不同而差別顯著，說明在該特征吸收位置處，干擾性物質(zhì)也可能具有顯著吸收，且隨著預水解強度增加這部分物質(zhì)產(chǎn)生速度加快，對木素的定量測定造成較大影響。205 nm 處是目前酸溶木素測定方法所選用的波長，但與原料木素測定方法不同，預水解在高溫水熱條件下會產(chǎn)生較大量甲酸及乙酸等低分子有機酸[11]，研究中發(fā)現(xiàn)這類物質(zhì)在205 nm 處產(chǎn)生顯著吸收，對木素的測定產(chǎn)生影響。

圖3 為甲酸、乙酸和糠醛標準物質(zhì)的紫外光譜圖。由圖可知甲酸、乙酸在205 nm 附近有明顯的紫外吸收，而糠醛則在220 nm 和276 nm 處有特征吸收峰。甲酸、乙酸和糠醛是木質(zhì)纖維高溫預水解液中普遍存在的降解產(chǎn)物，因此，選用205 nm 或280 nm 測定預水解液溶解性木素含量時，都會由于干擾性物質(zhì)的存在而影響準確性。必須選擇適當?shù)腢V 波長并進行方法改進，以獲得更加準確的可溶性木素定量測定。

圖3 甲酸、乙酸、糠醛的紫外光譜圖Fig.3 UV spectra of formic acid，acetic acid and furfural

2.2 硼氫化鈉還原前后水解液的紫外光譜分析

由文獻[15]可知，糠醛類物質(zhì)的干擾可以通過在堿性介質(zhì)中（0.1 mol·L-1NaOH）硼氫化鈉還原反應而消除其在紫外光譜中的特征吸收。由于NaOH 溶液在200 nm 附近有較明顯的吸收，因而本研究選擇280 nm 用以測定木素含量[16]。圖4～圖11 是不同條件的預水解液經(jīng)硼氫化鈉還原前后的紫外吸收光譜。

圖4 相思木預水解液紫外光譜圖（160℃，20 min）Fig.4 UV spectra of acacia PHL at 160℃ for 20 min

圖5 相思木預水解液紫外光譜圖（160℃，60 min）Fig.5 UV spectra of acacia PHL at 160℃ for 60 min

圖6 相思木預水解液紫外光譜圖（170℃，20 min）Fig.6 UV spectra of acacia PHL at 170℃ for 20 min

圖7 相思木預水解液紫外光譜圖（170℃，60 min）Fig.7 UV spectra of acacia PHL at 170℃ for 60 min

圖8 蘆葦預水解液紫外光譜圖（160℃，20 min）Fig.8 UV spectra of reed PHL at 160℃ for 20 min

圖9 蘆葦預水解液紫外光譜圖（160℃，60 min）Fig.9 UV spectra of reed PHL at 160℃ for 60 min

圖10 蘆葦預水解液紫外光譜圖（170℃，20 min）Fig.10 UV spectra of reed PHL at 170℃ for 20 min

圖11 蘆葦預水解液紫外光譜圖（170℃，60 min）Fig.11 UV spectra of reed PHL at 170℃ for 60 min

由圖可知，水解液經(jīng)硼氫化鈉還原后的紫外吸收在280 nm 附近均有不同程度的下降，說明水解液中糠醛類物質(zhì)對木素測定影響不同。因此，可以根據(jù)充分還原后水解液在280 nm 處的吸光度值計算出水解液中木素含量。另外，還可由還原前后的吸光度差值(ΔA)計算得出糠醛類物質(zhì)的含量[17]。

由圖還可以發(fā)現(xiàn)同一原料，隨著預水解溫度提高和時間的延長還原前后280 nm 處吸光度差值增大，說明預水解條件的加劇導致糠醛類物質(zhì)產(chǎn)生速度加快。兩種原料相比，蘆葦在較弱的水解條件即有顯著糠醛類物質(zhì)生成，說明其反應速率較木材類原料快，這一點與其他研究結果相似[18-19]。

圖12 再處理相思木預水解液紫外光譜圖（170℃，60 min）Fig.12 UV spectra of retreated acacia PHL at 170℃ for 60 min

280 nm 處吸收值最大的170℃，60 min 預水解液，增加硼氫化鈉用量后的紫外吸收光譜圖如圖12和圖13 所示。加量還原后未見280 nm 處吸收值進一步降低，驗證了實驗中所采用的還原劑用量可將水解液中糠醛充分還原，在本實驗范圍內(nèi)是適用的。

隨機取蘆葦170℃、60 min 下的水解液，向還原后的水解液重新加入不同濃度的糠醛后進行紫外光譜掃描，在280 nm 的吸光度值有不同程度的增大，如圖14 所示，進一步表明糠醛對水解液中木素測定造成的干擾是顯著的，通過還原處理去除糠醛影響后測定可溶性木素是可行的。

圖13 再處理蘆葦預水解液紫外光譜圖（170℃，60 min）Fig.13 UV spectra of retreated reed PHL at 170℃ for 60 min

圖14 蘆葦預水解液不同處理后的紫外光譜圖 （170℃，60 min）Fig.14 UV spectra of reed PHL at 170℃ for 60 min

2.3 溶解性木素的定量測定

圖15 和圖16 分別為相思木、蘆葦預水解液提取木素不同濃度在280 nm 處吸光度工作曲線。由線性回歸方程可知，提取木素NaOH 溶液濃度與吸光度之間線性相關性較高，分別達到0.9994 和0.9997，可用于外標法定量測定。

圖15 相思木木素的標準曲線Fig.15 Relation between absorbance and acacia lignin concentration

圖16 蘆葦木素的標準曲線Fig.16 Relation between absorbance and reed lignin concentration

根據(jù)水解液還原后280 nm 處的吸光度值和標準曲線計算各水解液中木素含量，并與傳統(tǒng)酸溶木素測定結果進行了比較，結果見表1。通過對比可知，預水解液經(jīng)硼氫化鈉還原后測定280 nm 處吸光度值，通過工作曲線計算的木素濃度值低于相同預水解液采用酸溶木素的A205方法測定吸光度的計算值。說明預水解液中低分子酸性物質(zhì)對A205酸溶木素測定法定量測定預水解液中溶解性木素含量存在干擾。

2.4 糠醛的定量測定

由圖3 可知糠醛標準物的最大吸收波長為276 nm，與文獻[12]報道的272 nm 非常接近，因此可以將醛類物質(zhì)在該波長處的貢獻從水解液吸光度中扣除，在實現(xiàn)對木素進行更精確的定量之外，還可以通過吸光度值的降低定量測定預水解液中糠醛的含量。不同濃度的糠醛與276 nm 處吸光度值的對應關系如圖17 所示。

表1 Tappi 205 和NaBH4 還原法測定預水解液中 木素含量的比較Table 1 Comparison of lignin content in PHL measured with method of Tappi 205 and reduction of NaBH4

圖17 糠醛標準曲線Fig.17 Relation between absorbance and furfural concentration

由圖可見該工作曲線的線性相關系數(shù)較高，達到0.9987。由直線的斜率計算出糠醛在276 nm 處的摩爾吸光系數(shù)為13958 L·mol-1·cm-1，這與文獻[20]所報道的14100 L·mol-1·cm-1接近。

在糠醛類物質(zhì)和木素共存的溶液體系，由硼氫化鈉還原前后紫外光譜特定波長處吸收的差異，根據(jù)朗伯-比爾定律，可以計算求得醛類化合物的含量，具體見式(1)和式(2)

式中，A1、A2分別為還原前后276 nm 處的水解液吸光度值；A木為水解液中木素的吸光度值；ε為糠醛工作曲線的斜率0.1454；c1、c2分別為還原前后水解液中糠醛類物質(zhì)的濃度，mg·L-1；b 為實驗系統(tǒng)誤差。式（1）、式（2）作差，得ΔA=ε（c1-c2）。由前文知該方法可以將水解液中糠醛充分還原，故c2=0。則

由式（3）及不同處理條件預水解液還原前后吸光度差值計算糠醛類物質(zhì)含量如表2 所示。各原料預水解過程中，糠醛類物質(zhì)在170℃條件下濃度明顯高于160℃，且隨著保溫時間的延長，濃度增速加快。

為驗證該方法的準確性，隨機取蘆葦170℃、60 min 下的水解液，通過加標的方法將一系列體積（1～3 ml）的糠醛稀釋液分別加入到充分還原后的預水解液中測定276 nm 處吸光度值，分別讀數(shù)5次取平均值，計算糠醛濃度和平均回收率，如表3所示。其中計算濃度為根據(jù)式（3）計算得到的，回收率為計算濃度與實測濃度的比值。3 種加標濃度下，平均回收率大于98%，說明方法準確度較高，可用于預水解液中糠醛類物質(zhì)的測定要求。

表2 由NaBH4 還原前后ΔA 計算的糠醛含量Table 2 Results of furfural content measured with ΔA before and after reduction of NaBH4

表3 精確度和RSD 計算Table 3 Results of accuracy and RSD

3 結 論

（1）木質(zhì)纖維高溫預水解液中普遍產(chǎn)生的降解產(chǎn)物甲酸、乙酸和糠醛，分別會干擾205 nm 和280 nm 處預水解液溶解性木素測定的準確性。硼氫化鈉還原后水解液在280 nm 處紫外吸光度值均有不同程度的下降，且水解條件越高，還原前后的吸光度差值越大，通過充分還原去除糠醛影響后，以280 nm 為特征吸收位置定量測定可溶性木素可行。

（2）預水解液經(jīng)硼氫化鈉充分還原前后在280 nm 處吸光度差值可用于定量測定預水解液中糠醛的含量，通過充分還原后加標的方法，計算糠醛的平均回收率為98.14%～99.88%，精確度較高，相對標準偏差為0.17%～0.35%。

[1]Zhang Y P.Reviving the carbohydrate economy via multi-product lignocellulose biorefineries [J].J.Ind.Microbiol.Biotechnol., 2008, 35(5): 367-375.

[2]Liu Shijie, Zhang Zisheng, Scott G M.The biorefinery: sustainably renewable route to commodity chemicals , energy, and materials//The Second International Biorefinery Conference[C].Syracuse, New York, 2009: 541-542.

[3]Yang Mingni(楊明妮), Chai Lianzhou(柴連周), Zhang Guiqin(張桂琴), et al.Microwave irradiation promoting acid hydrolysis of straw pole into reducing sugar in ionic liquid [Bmin]Cl [J].CIESC Journal(化工學報), 2011, 62(S2): 90-96.

[4]Alterthum F, Ingram L O.Efficient ethanol production from glucose, lactose, and xylose by recombinant Escherichia coli [J].Applied and Environmental Microbiology, 1989, 55(8): 1943-1948.

[5]Zaldivar J, Martinez A, Ingram L O.Effect of alcohol com-pounds found in hemicellulose hydrolysate on the growth and fermentation of ethanologenic Escherichia coli [J].Biotechnol.Bioeng., 2000, 68: 524-530.

[6]Zaldivar J, Ingram L O.Effect of organic acids on the growthand fermentation of ethanologenic Escherichia coli LY01 [J].Biotechnol.Bioeng., 1999, 66: 203-210.

[7]Shi Haiqiang, Fatehi Pedram, Xiao Huining, Ni Yonghao.A combined acidification /PEO flocculation process to improve the lignin removal from the pre-hydrolysis liquor of kraft-based dissolving pulp production process [J].Bioresource Technology, 2011, 102(1): 5177-5182.

[8]TAPPI Test Method T222om-88.Acid-insoluble lignin in wood and pulp[S].Atlanta, GA: TAPPI Press, 1988.

[9]Liu Bingyue(劉秉鉞), Shi Haiqiang(石海強), Li Xingqiang(李興強).Analysis of lignin content in waste liquor of rice straw pulp by ultraviolet spectrophotomer [J].China Pulp & Paper(中國造紙), 2003, 22(6): 19-22.

[10]Gong C S, Cao N J, Du J, et al.Ethanol production from renewable resources [J].Advances in Biochemical Engineering and Biotechnology, 1999, 65: 209-241.

[11]Sjostrom E, Haglund P.Spectrophotometric determination of the dissolution of lignin during sulfite cooking [J].Tappi, 1964, 47(5): 286-291.

[12]Zhang Cui(張翠), Chai Xinsheng(柴欣生), Luo Xiaolin(羅小林), et al.Rapid method for determination of furfural and 5-hydroxymethyl furfural in pre-extraction stream of biomass using UV spectroscopy [J].Spectroscopy and Spectral Analysis(光譜學與光譜分析), 2010, 30(1): 247-252.

[13]Romualdo S Fukushima, Ronald D Hatfield.Extraction and isolation of lignin for utilization as a standard to determine lignin concentration using the acetyl bromide spectrophotometric method [J].J.Agric.Food Chem., 2001, 49(7): 3133-3139.

[14]Shi Haiqiang(石海強), He Beihai(何北海).Measurement of triglyceride content of resin in masson pulp by UV spectral method [J].Spectroscopy and Spectral Analysis(光譜學與光譜分析), 2007, 27(1): 135-138.

[15]Mikhail Iakovlev, Adriaan van Heiningen.SO2-ethanol water (SEW) pulping (I): Lignin determination in pulps and liquors [J].J.Wood Chem.Technol., 2011, 31 (3): 233-249.

[16]Moritz Leschinsky, Gerhard Zuckerst?tter, Hedda K Weber, Rudolf Patt, Herbert Sixta.Effect of autohydrolysis of Eucalyptus globules wood on lignin structure (Ⅰ): Comparison of different lignin fractions formed during water prehydrolysis [J].Holzforschung, 2008, (62): 645-652.

[17]Susana R Pereira, Diogo J Portugal-Nunes, Dmitry V Evtuguin, Luísa S Serafim, Ana M R B Xavier.Advances in ethanol production from hardwood spent sulphite liquors [J].Process Biochemistry, 2013, 48(2): 272-282.

[18]Zhuang Xinshu(莊新姝).The study of biomass hydrolysis under extremely low acids for ethanol production[D].Hangzhou: Zhejiang University, 2005.

[19]Wang Shurong( 王 樹 榮), Zhuang Xinshu( 莊 新 姝), Luo Zhongyang(駱仲泱), et al.Experimental study and products analysis of lignocellulosic biomass hydrolysis under extremely low acids [J].Journal of Engineering Thermophysics(工程熱物理學報), 2006, 27(5): 741-744.

[20]Liu Zhiping(劉志平).Improvement of high temperature sulfonation of wheat straw alkali lignin and its precipitation mechanism on fiber surface[D].Guangzhou: South China University of Technology, 2012.