湯恒，黃申，馮旭東，李春,

（1 石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆 石河子 832003；2 北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京 100081）

引 言

甘草酸（glycyrrhizin，GL）是一種五環(huán)三萜皂苷類化合物，同時也是甘草的主要有效成分之一，常作為食品和藥物添加劑，并有抗炎、抗過敏、抗肝毒、抗腫瘤、抗病毒、抗高血壓、抗高血脂及促進(jìn)腎上腺皮激素分泌等作用；可用于人體抗衰老、抗炎癥、降壓、增強機體免疫力、提高生理機能、改善高血脂癥、維持水鹽代謝平衡等[1-2]。另外，其在化妝品和食品添加劑領(lǐng)域也有廣泛的應(yīng)用，是一種重要的精細(xì)化工產(chǎn)品[3]。但是作為藥物，甘草酸極性較強，無法有效透過脂溶性的細(xì)胞膜，限制了其藥效的發(fā)揮。將甘草酸進(jìn)行水解后得到的單葡萄糖醛酸基甘草次酸 (glycyrrhetic acid monoglucuronide, GAMG)和甘草次酸（glycyrrhetinic acid，GA）更易被人體吸收，更好地發(fā)揮其藥理作用，兩者的生物利用度都明顯優(yōu)于甘草酸[4-5]。特別是GAMG 更具有甜度高（甘草酸的5 倍，蔗糖的1000 倍）、溶解性好、便于體內(nèi)運輸以及低毒性等特性[6-7]，使得其應(yīng)用前景更加廣闊。

β-葡萄糖醛酸苷酶（β-glucuronidase，EC：3.2.1.31）是糖苷類水解酶的一種，能催化各種類型的β-葡萄糖醛酸酸苷鍵水解，釋放β-葡萄糖醛酸和相應(yīng)的配基。該酶一般屬于GH1 和GH2 家族，在GH79 家族中也有分布[8-9]。本課題組前期從新疆甘草種植區(qū)篩選到的真菌Penicillium purpurogenum Li-3，能在以甘草酸為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長，特異性催化GL 外側(cè)的糖苷鍵水解，將GL 轉(zhuǎn)化為GAMG。但因野生菌的誘導(dǎo)產(chǎn)酶量較低，本課題組前期構(gòu)建了重組β-葡萄糖醛酸苷酶的大腸桿菌[E.coli BL21（DE3）]表達(dá)體系，簡稱PGUS-E。PGUS-E的酶學(xué)性質(zhì)較原始酶發(fā)生了改變，除了可以將GL催化生成GAMG，還可以進(jìn)一步催化GAMG 生成GA，如圖1 所示。

研究過程中發(fā)現(xiàn)，重組酶的熱穩(wěn)定性較差，不能滿足工業(yè)生產(chǎn)的需要；另一方面，在較高溫度下進(jìn)行反應(yīng)具有反應(yīng)黏度低、微生物污染較少且反應(yīng)速度快等優(yōu)點[10]。因此提高β-葡萄糖醛酸苷酶的熱穩(wěn)定性具有一定現(xiàn)實意義，不僅可以改進(jìn)β-葡萄糖醛酸苷酶的工業(yè)應(yīng)用效果，而且可以此為基礎(chǔ)研究β-葡萄糖醛酸苷酶結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系。蛋白質(zhì)分子理性設(shè)計是在對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的認(rèn)識的基礎(chǔ)上，以定點突變技術(shù)和定點飽和突變技術(shù)為主的，對蛋白質(zhì)進(jìn)行改造的方法[11-13]。隨著X 射線晶體衍射技術(shù)的進(jìn)步，越來越多的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被解析出來。在研究某個目標(biāo)蛋白時，即使沒有其立體結(jié)構(gòu)的信息，也可以同源結(jié)構(gòu)為模板，借助分子模擬技術(shù)預(yù)測其結(jié)構(gòu)[14]。

隨著研究的深入，相繼發(fā)現(xiàn)具有不同熱穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)，其維持熱穩(wěn)定性的機制不斷被了解，使得采用理性設(shè)計對蛋白質(zhì)進(jìn)行改造以提高其熱穩(wěn)定性變得越來越具有理論意義。采用理性設(shè)計策略，一般可在短時間內(nèi)將設(shè)計完成，并獲得性質(zhì)改善的突變體。而通過理性設(shè)計得到的結(jié)果，也將加深對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的理解。

近年來國內(nèi)外學(xué)者大量運用理性設(shè)計對多種工業(yè)用酶的性能進(jìn)行了改造，取得較好的效果。例如，D 型氨基酸在高溫環(huán)境下對保持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)具有很強的作用。Andersen 課題組[15]將色氨酸籠(Trp-cage)迷你蛋白TC10b 的10 號位氨基酸突變?yōu)镈-丙氨酸，在α螺旋內(nèi)部轉(zhuǎn)角處有效地加強了剛性，該蛋白的溶解溫度(Tm)也由原來的 56℃提升為72℃。對于β-葡萄糖醛酸苷酶的研究，目前國內(nèi)外研究較少，尤其是在β-葡萄糖醛酸苷酶的熱穩(wěn)定性理性設(shè)計研究方面，尚未見相關(guān)報道。

圖1 重組β-葡萄糖醛酸苷酶轉(zhuǎn)化甘草酸示意圖Fig.1 Biotransformation of glycyrrhizin by recombinant β-glucuronidase (PGUS-E)

本研究基于分子模擬的PGUS-E 結(jié)構(gòu)，將通過與其他耐熱β-葡萄糖醛酸苷酶的同源比對，以及對酶結(jié)構(gòu)的分析，利用定點突變技術(shù)對重組β-葡萄糖醛酸苷酶進(jìn)行理性設(shè)計分子改造，以得到熱穩(wěn)定性明顯提高的突變體，并分析熱穩(wěn)定性提高的機理。

1 實驗材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 E.coli DH5α和E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購自北京博邁德科技發(fā)展公司。重組大腸桿菌（E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-pgus）由實驗室前期構(gòu)建[16]。β-葡萄糖醛酸苷酶基因 gus（GenBank 收錄號為：EU095019.1）由課題組構(gòu)建的原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-pgus 中克隆獲得。原核表達(dá)載體pET-28a(+)購自Novagen 公司。

1.1.2 主要試劑 TransStart FastPfu DNA polymerase 購自北京金式金生物技術(shù)有限公司；PCR Master Mix，多功能DNA 純化回收試劑盒，高純質(zhì)粒小量快速提取試劑盒購自北京博邁德生物技術(shù)公司；FastDigest Dpn I 購自Thermo Fisher Scientific；Protein Marker, 14.4×103～116.0×103，購自北京莊盟國際生物基因科技公司；2000 DNA Marker，1 kb DNA Ladder 購自北京特可美生物技術(shù)有限公司；Nucleic Acid Stain 核酸染料購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；瓊脂購自Amresco 公司；酵母提取物，蛋白胨購自O(shè)xford 公司；IPTG，卡那霉素購自北京賽百盛基因有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。Ni-NTA FF 親和層析填料購自德國Qiagen 公司。本實驗用到的引物由金唯智生物科技有限公司合成，測序工作也由金唯智公司完成。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB 培養(yǎng)基 (g·L-1)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉10，瓊脂粉15 (固體培養(yǎng)基)，固體和液體培養(yǎng)基在需要時加入卡那霉素至50 μg·ml-1。

1.2 方法

1.2.1 酶結(jié)構(gòu)同源模擬與突變位點的選擇 在SWISS-MODEL 數(shù)據(jù)庫[17-20](http://swissmodel.expasy.org/workspace) 中輸入β-葡萄糖醛酸苷酶氨基酸序列并選擇β-葡萄糖醛酸苷酶3k46 為模板，生成同源模擬結(jié)構(gòu)。將該結(jié)構(gòu)與GH2 家族中其他耐熱β-葡萄糖醛酸苷酶進(jìn)行同源比對，獲得關(guān)鍵的突變位點。借助PYMOL 蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)分析軟件并根據(jù)預(yù)測的結(jié)構(gòu)信息，采用脯氨酸策略對酶進(jìn)行理性改性。

1.2.2 定點突變 采用全質(zhì)粒PCR 構(gòu)建目標(biāo)突變，將突變設(shè)計在引物上。PCR 體系如表1 所示。

表1 質(zhì)粒克隆體系Table 1 Plasmid-cloning system

1.2.3 模板消除 用FastDigest Dpn1 酶，在37℃下酶解PCR 產(chǎn)物，以去除模板鏈，酶切時間為1 h。酶切體系如表2 所示。

表2 模板消除體系Table 2 System for eliminating template

將酶切產(chǎn)物直接用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α，涂布卡那霉素 (50 mg·L-1) 抗性平板篩選陽性克隆。測序正確后將質(zhì)粒再次轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coli BL21(DE3)進(jìn)行表達(dá)。

1.2.4 目標(biāo)蛋白的純化 純化過程全部在4℃下進(jìn)行，離心收集重組菌，充分倒盡培養(yǎng)基。將菌體重懸于 10 ml 高滲緩沖液[500 g·L-1蔗糖, 50 mmol·L-1Tris-HCl (pH 9.0), 2.5 mmol·L-1EDTA]，冰浴中放置30 min。4℃ 8000 r·min-1離心10 min，倒盡上清。加入10 ml 低溫凍存的冰水，渦旋振蕩使細(xì)胞懸浮后持續(xù)振蕩5 min。4℃ 12000 r·min-1離心20 min，分別收集上清即為粗酶液。為方便蛋白純化，在構(gòu)建pET-28a(+)-pgus 載體時，在β-葡萄糖醛酸苷酶的N 端引入6×His-tag。采用AKTA Purifier 10 (GE Healthcare)層析系統(tǒng)和 HisTrap affinity column 親和層析獲得目標(biāo)蛋白，純酶液稀釋至同一濃度后用于后續(xù)實驗。

1.2.5 酶活力的測定 取200 μl 2 g·L-1pH 5.0 甘草酸溶液，加入50 μl 一定濃度的純酶液，37℃水浴中反應(yīng)30 min，立即取100 μl 反應(yīng)液，加入至裝有900 μl 甲醇的1.5 ml 離心管，樣液經(jīng)孔徑為0.45 μm 的有機濾膜過濾至樣品池中。用高效液相色譜檢測GL、GAMG 和GA 的含量。檢測儀器參數(shù)設(shè)置以及GL、GAMG 和GA 的標(biāo)準(zhǔn)曲線參考文獻(xiàn)[21]。在此條件下，底物GL、產(chǎn)物GAMG 和GA的保留時間分別為7.5、15.9 和22.7 min。β-葡萄糖醛酸苷酶活力定義為：在上述反應(yīng)條件下，每分鐘轉(zhuǎn)化1 μmol 甘草酸所需要的β-葡萄糖醛酸苷酶量即為一個活力單位。

1.2.6 野生酶和熱穩(wěn)定性提高突變體的熱穩(wěn)定性測定 純化得到的酶液分別在60℃的水浴中熱變性30、60、90、120、150min，再立即放入冰浴20 min，測定酶活力。將酶溶液不經(jīng)熱變性處理時的酶活力作為100%，以不同溫度對相應(yīng)的殘余酶活力百分比作圖。定義β-葡萄糖醛酸苷酶60℃下酶活丟失一半的時間為其半衰期，記為T1/2。

1.2.7 野生酶和熱穩(wěn)定性提高突變體的Michaelis-Menten 動力學(xué)分析 用50 mmol·L-1pH 4.2 乙酸-乙酸鈉緩沖液配制0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 g·L-1的甘草酸溶液，在37、60、70℃下反應(yīng)30 min 后，檢測酶活，采用Lineweaver-Burk作圖法計算酶動力學(xué)參數(shù)。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 酶結(jié)構(gòu)的同源模擬及對比分析

將PGUS-E 的氨基酸序列（Genebank 登錄號為EU095019）提交SWISS-MODEL，以大腸桿菌K-12 MG1605 的β-葡萄糖醛酸苷酶3k46 (0.25 nm)為PDB 模板，同源性達(dá)到55.97%，得到該酶的三維模擬結(jié)構(gòu)，如圖2 所示。同源建模的結(jié)果由PROCHECK 驗證。

糖苷酶家族的活性中心大多在(α/β)8TIM-barrel 的中心[22-23]，糖苷酶催化水解糖苷鍵過程中一般通過兩個催化氨基酸（一般為谷氨酸或天冬氨酸）進(jìn)行催化：一個是質(zhì)子供體（又稱親核試劑），另一個是酸性/堿性基團。Henrissat 等[24]已通過定點突變的方法證實β-葡萄糖醛酸苷酶3k46 的活性位點為451 位的谷氨酸和540 位的谷氨酸。

圖2 PGUS-E 的三維模擬結(jié)構(gòu)Fig.2 3D structure of PGUS-E based on homology modeling

借助PYMOL 蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)分析軟件，通過與已經(jīng)得到晶體結(jié)構(gòu)的β-葡萄糖醛酸苷酶3k46 進(jìn) 行同源比對，發(fā)現(xiàn)PGUS-E 的414 位的谷氨酸和505位的谷氨酸與β-葡萄糖醛酸苷酶3k46 的451 位的谷氨酸和540 位的谷氨酸重疊，推測PGUS-E 活性中心區(qū)是以414 位的谷氨酸和505 位的谷氨酸為核心的(α/β)8TIM-barrel 結(jié)構(gòu)域，見圖3。

2.2 突變位點的選擇

有研究表明，引入脯氨酸可以降低蛋白質(zhì)去折疊時的骨架熵，提高蛋白質(zhì)的剛性。脯氨酸包含一個亞氨基，一個羧基及一個吡咯烷環(huán)側(cè)鏈。脯氨酸由于自身吡咯烷環(huán)的束縛，因而具有更小的構(gòu)象自由度，并且還可以將與其相連的其他氨基酸固定在較小的構(gòu)象空間內(nèi)，說明脯氨酸的引入可以降低蛋白質(zhì)去折疊時的骨架熵，即增加蛋白質(zhì)的剛性。因此有研究表明，在蛋白質(zhì)構(gòu)象中柔性較大的區(qū)段引入脯氨酸，可以提高蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性[25-27]。并非所有的脯氨酸引入都會改善熱穩(wěn)定性，選擇正確的突變位點是理性設(shè)計的關(guān)鍵。酶的核心在于活性中心，如果選擇的突變位點距離活性中心過遠(yuǎn)，則熱穩(wěn)定性可能提高的并不顯著；如果選擇過近，則可能影響到酶的活性。本實驗選擇了(α/β)8TIM-barrel 結(jié)構(gòu)域桶型結(jié)構(gòu)底部的Gly280 進(jìn)行脯氨酸置換，該位點處于距離活性中心區(qū)距離適中（3.0～4.0 nm）的不穩(wěn)定的區(qū)段β-轉(zhuǎn)角處（圖3）。

圖3 PGUS-E 的催化活性中心和突變位點Fig.3 Active sites and mutation sites in catalytic domain of PGUS-E

同時，應(yīng)用同源比對策略，將PGUS-E 的蛋白序列與糖苷酶家族2 的其他嗜熱蛋白進(jìn)行同源比對，如圖4 所示。首先進(jìn)行位置篩選，挑選距離活性中心區(qū)適中（3.0～4.0 nm）的位點，再分析這些位點的突變效應(yīng)，最終選擇了將Ile130 置換為Val（圖3）。其原因可能是替換后的纈氨酸增加蛋白質(zhì)內(nèi)部活性中心附近的疏水包裝密度。由于疏水側(cè)鏈避開水的需要而相互接近，蛋白質(zhì)的折疊總是傾向于把疏水殘基包裹在內(nèi)部，但是分子量越大的蛋白質(zhì)，其疏水包裝密度就越難達(dá)到100%，因為總會有疏水的氨基酸暴露在蛋白質(zhì)表面[28]。所以在蛋白質(zhì)內(nèi)部更換疏水氨基酸就有可能通過調(diào)節(jié)內(nèi)部空穴的體積來容納更多的疏水氨基酸，并提高整體的疏水包裝密度，有效增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。

最后，將兩個突變位點進(jìn)行組合，構(gòu)建了I130V+G280P 雙點突變體。

2.3 野生酶和熱穩(wěn)定性提高的突變酶的熱穩(wěn)定性測定

純化得到的酶液在60℃的水浴中分別保溫30～150min，立即冰浴20 min，按照1.2.5 節(jié)描述方法測定酶活力。記酶溶液不經(jīng)過熱處理時的酶活力為100%，以不同溫度對相應(yīng)的殘余酶活力百分比作圖。β-葡萄糖醛酸苷酶在60℃下酶活丟失一半的時間為其半衰期T1/2(60℃)。實驗結(jié)果表明 (圖5)，突變酶I130V，G280P 和I130V+G280P 在60℃下的半衰期T1/2分別比野生酶23 min 提高3.5 倍、5 倍和5.5 倍，達(dá)到82 min、117 min 和128 min。該結(jié)果要優(yōu)于文獻(xiàn)中先前的報道，例如，Liu 等[29]對堿性α-淀粉酶進(jìn)行理性設(shè)計，獲得了有組合效應(yīng)的3 組雙點突變體，這些突變體在60℃下的半衰期T1/2分別比野生酶3 min 提高了1.5 倍、2.5 倍和3倍，達(dá)到5 min、7 min 和11 min。

2.4 野生酶和熱穩(wěn)定性提高突變體的Michaelis- Menten 動力學(xué)分析

通過理性設(shè)計，酶的熱穩(wěn)定性和催化活性同時得到提高[30]，但以活性的損失來換取熱穩(wěn)定性的提高在定向進(jìn)化中非常普遍。Fang 等[31]對細(xì)菌漆酶Lac15 進(jìn)行理性設(shè)計，突變酶在45℃下的半衰期T1/2比野生酶72 min 提高2 倍，達(dá)到150 min，但突變酶的Kcat/Km較野生酶下降了10%。因為酶的活性是依靠其活性中心的柔性，而酶的熱穩(wěn)定性需要活性中心外圍區(qū)域具有剛性，以抵御高溫作用的破壞[32]。所以理性設(shè)計的選點要求，在盡量小地影響酶的活性中心的同時，提高維持活性中心構(gòu)象的外圍區(qū)域的剛性。

圖4 PGUS-E 與糖苷酶家族2 的其他嗜熱蛋白氨基酸序列比對Fig.4 Sequence alignment of PGUS-E and other thermophilic proteins in GH2

表3 PGUS-E 及其突變體動力學(xué)參數(shù)Table 3 Kinetic parameters of PGUS-E and its mutants

用50 mmol·L-1pH 4.2 乙酸-乙酸鈉緩沖液配制0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 g·L-1的甘草酸溶液，在37、60、70℃下反應(yīng)30 min 后，檢測酶活，采用Lineweaver-Burk 作圖法計算酶動力學(xué)參數(shù)，結(jié)果如表3 所示。突變體I130V 和G280P 距離活性中心均超過3.0 nm，將對活性中心的影響降到了最低，在37℃下，突變體對底物的親和力和催化效率與PGUS-E 基本相同很好地證明了這一點。隨著溫度的提高，酶與底物的親和力有所提高，催化效率逐漸下降，但突變體的催化效率下降的幅度較小，這也從另一方面證明了突變體的熱穩(wěn)定性得到了提高。

3 結(jié) 論

通過同源比對替換策略和脯氨酸替換策略，得到3 株β-葡萄糖醛酸苷酶突變體I130V、G280P 和I130V+G280P，其熱穩(wěn)定性較野生型分別提高了3.5倍、5 倍和5.5 倍。酶學(xué)性質(zhì)及動力學(xué)性質(zhì)分析表明，突變體在熱穩(wěn)定性提高的同時，對底物的親和力基本不變，穩(wěn)定β-葡萄糖醛酸苷酶的工業(yè)應(yīng)用效果，進(jìn)一步適應(yīng)了工業(yè)生產(chǎn)的要求。同時，成功將同源比對替換策略和脯氨酸替換策略應(yīng)用于理性設(shè)計β-葡萄糖醛酸苷酶，一方面，為研究β-葡聚糖酶結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系提供了基礎(chǔ)，另一方面，也為同源比對替換和脯氨酸替換理性設(shè)計策略的應(yīng)用提供了參考。

圖5 PGUS-E 及其突變體在60℃下的半衰期以及熱穩(wěn)定性 Fig.5 Thermostability and T1/2 of PGUS-E and its mutants at 60℃

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