何夢秀，陳芳艷，鐘楊生，林健榮 （華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510642）

谷氨酸脫羧酶（Glutamic acid decarboxylase，GAD）是一種吡哆醛類裂解酶，廣泛分布于動植物、微生物等各種有機體活細胞中。該酶能專一性催化L-谷氨酸（L-Glutamic acid，L-Glu）的α-羧基，發(fā)生脫羧反應(yīng)，生成一種四碳非蛋白質(zhì)氨基酸 γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）和 CO2。GABA是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，能與相應(yīng)受體結(jié)合，在人體中發(fā)揮重要的生理功能［1］，如降血壓［2－3］、調(diào)節(jié)生長激素的分泌、健肝利腎、促進睡眠、增強記憶力、改善腦機能、對癲癇的預(yù)防和治療作用、鎮(zhèn)痛安神、抗焦慮和抗衰老等［4］。這是由Roberts和Frankel于1950年首次在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)。γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶（7-Aminobutyrate transaminase，GABA-T）在GABA分解代謝中起轉(zhuǎn)氨基作用，在生物體內(nèi)通常以磷酸吡哆醛為輔基，使GABA與丙酮酸發(fā)生α位的氨基轉(zhuǎn)移，有利于GABA的分解。GAD和GABA-T是GABA代謝中的關(guān)鍵限速酶，受到人們的廣泛關(guān)注。學(xué)者們對GAD的結(jié)構(gòu)性質(zhì)、分離純化和在細胞中的定位與分布以及在哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中所起作用進行廣泛、深入的研究。目前，該酶在生物體中的其他作用成為科學(xué)家的研究熱點［5］。筆者對GAD的結(jié)構(gòu)、酶學(xué)性質(zhì)及其與GABA-T在GABA代謝過程中的作用進行綜述。通過激活或抑制GABA代謝過程中的關(guān)鍵酶，使得材料中富集高含量的GABA。這對富含高GABA相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)利用提供參考。

1 γ-氨基丁酸的合成代謝

GAD催化Glu在α-位上的脫羧反應(yīng)是合成GABA的主要途徑。該反應(yīng)是不可逆的，其具體過程［6］如下:GlutamateDG

ABA+CO2。在細菌和哺乳動物大腦中，GABA首先在GABA-T的催化下與丙酮酸反應(yīng)生成琥珀酸半醛（SSA）和丙氨酸，然后琥珀酸半醛脫氫酶（Succinate semlalehyde dehydrogenase，SSADH）氧化SSA形成琥珀酸進入三羧酸循環(huán)。這些反應(yīng)共同構(gòu)成α-酮戊二酸氧化生成琥珀酸的代謝途徑，即三羧酸循環(huán)的另一條支路，稱為GABA支路（GABA shunt）。

從圖1可以看出，GABA和SSA是該旁路的2個重要底物，對代謝調(diào)控起著重要作用。GAD、GABA-T和SSADH三種酶在GABA代謝旁路中起十分重要的作用，其中GABA的積累主要受GAD的調(diào)控，因此通過提高GAD酶活性或抑制GABA-T的酶活性均有利于GABA的富集。

2GAD的生物學(xué)性質(zhì)

目前，科學(xué)家在微生物、植物、昆蟲和哺乳動物中均發(fā)現(xiàn)GAD，例如微生物中的大腸桿菌［8－9］（E．coli）、曲霉［10］、乳酸菌［11－12］、酵母、變形桿菌屬（Proteus vulgaris，P．morganii）及梭狀芽孢桿菌屬等都存在GAD［13］。由于微生物中富集GABA不受空間、環(huán)境和資源的限制，并且具有成本低、無化學(xué)殘留和產(chǎn)量高等顯著優(yōu)勢，進而被廣泛地研究，并且被應(yīng)用于材料GABA的積累。

2．1 GAD的結(jié)構(gòu)特征 已有學(xué)者對真核生物和原核生物中的GAD結(jié)構(gòu)進行研究，并且就其結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)的差異進行探討。研究表明，不同來源種屬或亞種之間GAD結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的關(guān)系存在一定差異。

大腸桿菌是最早發(fā)現(xiàn)的含有GAD酶的原核微生物。該菌具有較高的GAD酶活力，因此具有較高的富集GABA的能力。大腸桿菌GAD是由6個相同亞基組成的六聚體。每個亞基含1分子磷酸吡哆醛（PLP），輔酶與多肽鏈的賴氨酸殘基共價結(jié)合組成的寡聚酶（一種六聚體［14］）。有研究表明，GAD存在2種同工酶［15］，分別被命名為GADα和GADβ。這些同工酶具有相似的一級結(jié)構(gòu)，因N-末端的100個殘基存在差異，使其在細胞定位和生理功能也有某些差異。Ueno等［16］在短乳桿菌IFO12005中研究發(fā)現(xiàn)純GAD的N-末端氨基酸序列為M-N-K-N-D-Q-E-Q-T，與E．coliN-末端的M-DQ-K-L-L-T-D-F-R沒有密切的相似之處，它們的分子量和Km存在差異，進而在生理功能上也有不同之處。根據(jù)GAD基因一級結(jié)構(gòu)序列［17］，GAD單體由C末端結(jié)構(gòu)域、5＇-磷酸吡哆醛結(jié)合區(qū)域以及N末端結(jié)構(gòu)域三部分組成（圖2）。

在植物體中GAD的結(jié)構(gòu)與細菌中GAD的結(jié)構(gòu)序列同源性較高，但結(jié)構(gòu)分析顯示，植物體GAD帶有特殊的C-末端區(qū)域（鈣調(diào)蛋白區(qū)域，CaM）。在逆境條件（如熱刺激、缺氧和鹽脅迫等）下，該末端可與CaM結(jié)合，調(diào)節(jié)GAD酶活性，大量積累GABA以促進植物生長［15］。據(jù)報道，具有底物抑制作用的大腸桿菌GAD殘基上有L-絲氨酸-O-硫酸鹽、R-y-4-氨基己-5-炔酸和一氟甲基－谷氨酸3個靶位點［18］。研究表明，靶點L-絲氨酸-O-硫酸鹽的作用機制與天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶相同。這為通過底物抑制酶系統(tǒng)應(yīng)用于藥物開發(fā)作出重要貢獻［19］。

GAD在哺乳動物中存在GAD67與GAD65兩種基因組，相應(yīng)分子量分別為67和65 kDa，分別由Gad1和Gad2編碼。相應(yīng)的抗原性、細胞及亞細胞分布和與磷酸吡哆醛（PLP）相互作用等方面存在差異。

2．2 GAD的酶學(xué)性質(zhì) 據(jù)報道，通常微生物來源的GAD最適pH為3．8～5．0，在酸性介質(zhì)中GAD的酶活力較強，當(dāng)pH呈中性或偏堿性時其酶活力將消失。在原核微生物中，GAD與細胞生長的耐酸機制有關(guān)［15］。大腸桿菌具有酸誘導(dǎo)的氧化代謝系統(tǒng)、谷氨酸依賴型和精氨酸依賴型3種不同耐酸系統(tǒng)［20］，其中依賴谷氨酰胺酶YbaS和氨基酸反向轉(zhuǎn)運蛋白GadC，可確保大腸桿菌在極酸性環(huán)境下生存［21］。Sanders等［22］研究發(fā)現(xiàn)，GadA、GadB和GadC是大腸桿菌抗酸系統(tǒng)中的重要組成部分。Lc．LactisGAD 在酸性（pH 3．6 ～5．4）條件下具有較高的酶活力，當(dāng)pH為4．7時谷氨酸脫羧反應(yīng)能力最高，當(dāng)pH為6．0以上時其酶活力消失。這與GAD酶的誘導(dǎo)機制緊密相關(guān)［23］。酶與化學(xué)催化劑一樣，其活性與溫度有一定的依賴關(guān)系。不同微生物GAD的最適溫度差異較大。這與其生長溫度范圍相關(guān)，大多在30～50℃之間。當(dāng)溫度低于最適溫度時，酶促反應(yīng)速度隨溫度的升高而增加;當(dāng)溫度超過最適溫度時，反應(yīng)速度隨溫度升高而下降［24］。在已報道的微生物GAD中Lc．LactisGAD的熱穩(wěn)定性相對較好。徐建軍等［23］對乳酸菌GAD進行耐熱性研究，發(fā)現(xiàn)在pH 4．7條件下處理5 h后，60℃時該酶仍能保持80%以上的活性，80℃以上則迅速失活。同時，試驗還對微生物GAD酶具有高度的底物專一性進行檢驗，測試Lc．LactisGAD對18種常見氨基酸的脫羧作用，結(jié)果表明只有L-谷氨酸可作為其脫羧底物。來自植物、動物和微生物中的GAD盡管分子結(jié)構(gòu)有較大差異，但同樣具有很強的底物專一性。在一定的底物和PLP濃度下，體系中PLP的含量與反應(yīng)速度呈正比。Km值是GAD與PLP的親和力的反映，也是GAD的一個重要酶學(xué)特性常數(shù)［25］。

3 γ-氨基丁酸的富集

3．1 提高GAD酶活性的GABA富集 測定酶活性中心組成和結(jié)構(gòu)是研究酶催化作用的重要課題。目前，常用化學(xué)修飾法、反應(yīng)動力學(xué)法和X-射線衍射法等激活或抑制酶活性。在GAD催化Glu合成GABA的代謝途徑中，底物谷氨酸取代GAD上的賴氨酸殘基，與5＇-磷酸吡哆醛輔因子形成一種醌結(jié)構(gòu)，再通過質(zhì)子化途徑生成GABA及5＇-磷酸吡哆醛的再生。該合成途徑需H+，被認(rèn)為是一種pH調(diào)節(jié)機制。離體以及活體研究證實胞質(zhì)的pH下降可激活GAD酶活性，并且有別于GABA的積累。金屬離子常作為輔助因子參與酶促反應(yīng)，在一定的濃度下對酶有激活和抑制作用，特別是重金屬離子易使酶失活［26］。近年來，較多的研究發(fā)現(xiàn)Ca2+和Mg2+對GAD有較強的激活作用［27－28］。有研究表明，在pH 3．8的條件下，0．6 mol/L Ca2+和7．5 mol/L Mg2+對 GAD 酶活力有顯著的提高作用（相對酶活分別為174%和164%），但兩者為拮抗效應(yīng)［29］。楊勝遠等［27］在爬山虎莖中分離到5株內(nèi)生菌，其中的菌株EJC-1具有GAD酶活性，且發(fā)現(xiàn)2．5 mmol/L Mg2+對GAD酶活力有顯著的促進作用，其活力提高13．85%，但Ca2+對GAD酶活力影響并不大。這與王朝［29］研究結(jié)果有所差異。李云等［26］研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+對GAD有顯著的激活作用，Mg2+和Mn2+在較高濃度時激活作用明顯，Co2+在較低濃度時激活作用較好。然而，F(xiàn)e2+、Fe3+、Ag+、Cu2+和Zn2+對GAD 有抑制作用［27－28］，其中Cu2+和Zn2+對其酶活力的抑制作用顯著［30］。據(jù)報道，Na+和Cl-既不是GAD的激活劑又不是抑制劑，而Li+和K+對GAD活性有輕微的抑制作用［31］。由此可知，不同來源的GAD酶活性差異較大。因此，不同金屬離子對GAD酶活力的影響力均不同，但Ca2+和Mg2+均可激活GAD的酶活性，并且增強其酶促反應(yīng)，有利于GABA含量的積累。對于GAD酶抑制劑，它可在酶促反應(yīng)中添加絡(luò)合劑，使其與金屬離子形成螯合物，減少金屬離子含量，從而緩解其對GAD酶的抑制作用。

微生物具有代謝快的特征，因此其壽命較短暫。這一缺陷限制了酶促反應(yīng)的廣泛應(yīng)用。在20世紀(jì)60年代發(fā)展起來的酶和活細胞的固定化技術(shù)可以提高酶的穩(wěn)定性，延長半衰期，在較長時間內(nèi)反復(fù)使用，有利于生產(chǎn)上工藝的連續(xù)化和管道化，避免自由酶在應(yīng)用上的缺陷。目前，已有較多采用固定化GAD轉(zhuǎn)化制備GABA的研究報道［32－34］。陳蔚青等［35］以海藻酸鈉與明膠的協(xié)同作用為載體包埋固定化GAD，以谷氨酸為底物，以固定化GAD為催化劑，采取生物轉(zhuǎn)化法連續(xù)制備GABA 60 h，使得GAD酶活性持續(xù)時間延長，其穩(wěn)定性顯著增加，Glu轉(zhuǎn)化率高達98．7%。王筱婧等［36］用海藻酸鈉固定米糠中的GAD，固定化后GAD的最適溫度由40℃左右上調(diào)至45℃左右，但其性質(zhì)未發(fā)生改變，酶活力大大升高，經(jīng)固定化米糠GAD方法制備得到的制備液中GABA含量占可溶性固形物含量的3．06%，與未固定化米糠GAD制備的GABA含量2．84%相比明顯提高，且可溶性蛋白和總糖含量大為下降。固定化細胞是在固定化酶的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的技術(shù)。與固定化酶相比，固定化細胞可省去酶的分離手續(xù)，進行連續(xù)發(fā)酵，同時細胞生長快，對污染因子的抵抗力增加。韓雪［37］采用海藻酸鈉－氯化鈣包埋法對從酸菜中分離、純化的植物乳桿菌進行固定化。固定化細胞在一定程度上能減小底物的抑制作用，與游離細胞中GAD的最適pH 4．7相比固定化細胞在pH為4～5時均有較高活性，擴大了GAD酶發(fā)生作用的pH范圍，經(jīng)連續(xù)7次轉(zhuǎn)化后固定化細胞中GAD的活力仍為初始酶活力的68．3%，且菌液中GABA的積累量可達7．065 g/L。

3．2 抑制GABA-T酶活性的GABA富集 與GAD不同，GABA-T被廣泛分布于各種組織中，并且與PLP的結(jié)合更加緊密。研究表明，被純化GABA-T的最適pH為8．2，且不耐熱，在25℃時90 min開始失活，在30℃時60 min開始失活，但酶失活前反應(yīng)溫度30℃比25℃酶活性高［38］，但該酶需要PLP作為輔酶，其對 GABA的Km值為1．1 mmol/L。朱莉等［39］利用酶活法測定蘇云金芽孢桿菌GO3菌株中的GabT和GabD蛋白，發(fā)現(xiàn)這2種蛋白分別呈現(xiàn)出GABA-T和SSADH的活性。γ-氨基丁酸可利用丙酮酸或α-酮戊二酸作為氨基接受體，催化GABA和琥珀酸半醛之間的可逆轉(zhuǎn)變。GABA-T是GABA代謝的關(guān)鍵限速酶，也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物的靶點，其活力的改變直接影響GABA水平。當(dāng)GABA-T受到抑制時中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)GABA含量顯著升高，進而有利于多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療。為了增加GABA濃度，可設(shè)計一種通過血腦屏障的GABA-T抑制劑［40］，目前，GABA-T抑制劑主要是GABA類似物，也包括少量的特殊結(jié)構(gòu)的化合物?，F(xiàn)已合成大量的抑制劑，包括競爭性抑制劑和基于機制的不可逆抑制劑，如Vigabatrin類似物、取代氨基戊酸類似物和取代氨基丁烯酸類似物等。有研究表明，乙體氯氰菊酯可顯著降低小鼠腦組織中GABA-T的酶活力，促使GABA含量增多，導(dǎo)致Glu/GABA 平衡紊亂［41－42］。黃酮類化合物也能明顯地以劑量依賴的方式抑制GABA-T和SSADH酶活力，屬于非競爭性抑制，并且表現(xiàn)出不同的構(gòu)效關(guān)系［40］。

GAD和GABA-T是維持腦中GABA含量的2個主要代謝酶。兩者的協(xié)同作用對保持神經(jīng)遞質(zhì)GABA濃度有重要意義［43］。梁統(tǒng)等［44］以丙戊酸鈉為原料，對大鼠大腦皮層4個腦區(qū)中GAD、GABA和GABA-T含量的變化進行研究。研究表明，丙戊酸鈉既是GABA-T的抑制劑，又能激活GAD，可顯著提高GABA含量。

4 展望

GAD在真菌孢子的萌發(fā)過程中起代謝調(diào)節(jié)作用［45］。GAD酶活力的提高有利于催熟香蕉［46］，并且可促進GABA的積累以緩解低氧脅迫對植物的傷害［47］。研究表明，在醫(yī)學(xué)上，GAD抗體是反映1型糖尿病胰島B細胞自身抗體的免疫學(xué)指標(biāo)，具有重要的臨床意義［48］。在生產(chǎn)應(yīng)用上，通過激活GAD或抑制GABA-T酶活力合成GABA，其生物合成條件溫和、原材料廉價、工藝簡單、生產(chǎn)周期短、安全性高且不受資源、環(huán)境和空間的限制，因此采取生物合成法富集GABA被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食品和藥品行業(yè)，具有廣闊的市場前景。γ-氨基丁酸茶在日本已被大力開發(fā)，其產(chǎn)品受到廣大消費者特別是高血壓患者的親睞，已開發(fā)出葉茶、袋泡茶和灌裝茶飲料等系列產(chǎn)品。隨著廣大消費者對保健品需求的日益增長以及對GABA的藥理功效的了解深入，目前開發(fā)出的富含γ-氨基丁酸的產(chǎn)品必定具有廣闊的市場前景。然而，在動植物中GABA含量很少，且隨著年齡的增長，人體所含的GABA含量有所降低，因此科學(xué)家們需要進一步地研究、探索富集高γ-氨基丁酸的技術(shù)。該實驗室通過物理和微生物學(xué)的方法來富集GABA，為生產(chǎn)高含量γ-氨基丁酸產(chǎn)品提供參考。

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