張 月，韓丙軍，趙方方（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心，海南省熱帶果蔬產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，海南 ?？凇?711 01）

超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法測定木瓜中聯(lián)苯肼酯及其代謝產(chǎn)物

張 月，韓丙軍，趙方方
（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心，海南省熱帶果蔬產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，海南 ?？?711 01）

建立木瓜中聯(lián)苯肼酯及其代謝產(chǎn)物聯(lián)苯肼酯烯的超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。樣品用乙腈和0.25%乙酸溶液勻漿提取，鹽析，分取上清液，同時加入0.25%抗壞血酸溶液于離心管中，衍生60 min后待測。目標化合物經(jīng)Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）分離，采用三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測模式進行定性定量分析。結(jié)果表明，在1.0～10.0 ng/kg添加量時，聯(lián)苯肼酯及聯(lián)苯肼酯烯的回收率分別為86.2%～109.8%和78.3%～97.3%，相對標準偏差分別為4.0%～7.0%和4.5%～8.8%（n=5）。方法的 線性范圍為0.25～2.0 ng/m L，相 關(guān)系數(shù)（r）為0.99 9 8。該方法對聯(lián)苯肼酯的定量限均為1×10－6mg/kg，能滿足木瓜中聯(lián)苯肼酯的殘留檢測要求。

超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜；木瓜；聯(lián)苯肼酯；聯(lián)苯肼酯烯；殘留

聯(lián)苯肼酯是聯(lián)苯肼類殺螨劑，是一種新型選 擇性殺螨劑。其純品外觀為白色固體結(jié)晶。美國科聚亞公司2008年在我國獲得登記。其作用機理為對螨類的中樞神經(jīng)傳導(dǎo)系統(tǒng)的γ-氨基丁酸受體的獨特作用，也有研究表明聯(lián)苯肼酯作用于螨類線粒體，抑制細胞色素bQo位點復(fù)合物Ⅲ的合成，具有殺卵活性和對成螨的擊倒活性，且持效期長［1-8］。主要用于果樹、棉花、蔬菜和茶葉上害螨的防治［9］，很多國家和地區(qū)在不同作物上均制定了不同的殘留限量標準，其中美國［10］為0.05～15 mg/kg，加拿大［10］為0.01～1.5 mg/kg，澳大利亞［10］為0.01～2 mg/kg，歐盟［11］為0.01～2 mg/kg，日本［12］為0.01～10 mg/kg。根據(jù)2006年聯(lián)合國糧農(nóng)組織及世界衛(wèi)生組織農(nóng)藥殘留聯(lián)合專家會議報告［13］中 的殘留定義為聯(lián)苯肼酯及其代謝產(chǎn)物聯(lián)苯肼酯烯之和，聯(lián)苯肼酯烯以聯(lián)苯肼酯計，因此檢測聯(lián)苯肼酯及其代謝產(chǎn)物具有重要的意義。

近年來有關(guān)聯(lián)苯肼酯的文獻報道大多是關(guān)于牛奶、葡萄酒、干花、濃縮果蔬汁、草莓、柑橘等中聯(lián)苯肼酯的殘留分析研究［14-20］。曹巍等［21］采用高效液相色譜分析聯(lián)苯肼酯原藥，肖崢［22］、張燕［23］等采用高效液相色譜法對聯(lián)苯肼酯懸浮劑含量的測定，未見其在木瓜中殘留檢測的報道。本實驗采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜電噴霧正離子模式檢測，建立了木瓜中 聯(lián)苯肼酯及其代謝產(chǎn)物聯(lián)苯肼酯烯的殘留檢測，結(jié)果滿足農(nóng)藥殘留檢測的要求［24］。

1　　材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

木瓜鮮果，采于海南省臨高縣國營紅華農(nóng)場，樣品采集時間為2014年7月，樣品分裝后在－20 ℃冷凍貯藏。

聯(lián)苯肼酯及聯(lián)苯肼酯烯標準品（純度≥99%）農(nóng)業(yè)部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（天津）；乙腈（色譜極）美國Fisher公司；抗壞血酸、乙酸（分析純）廣州化學(xué)試劑廠。

超高效液相色譜儀美國Waters公司；API4000+三重四極桿質(zhì)譜儀美國AB公司；IKAT25勻漿機上海萬捷科技有限公司；HH-6恒溫水浴鍋常州賽普實驗儀器廠。

1.2方法

1.2.1標準溶液的配制

標準溶液：分別準確稱取0.050 g（精確至0.001 g）聯(lián)苯肼酯及聯(lián)苯肼酯烯標準品于2 個50 mL容量瓶中，乙腈溶解并定容，得到1 000 μg/mL標準儲備液，于－18 ℃保存。

基質(zhì)標準溶液：按樣品前處理方法將空白樣品（未有目標農(nóng)藥檢出的樣品）制成聯(lián)苯肼酯基質(zhì)溶液，用基質(zhì)溶液稀釋標準儲備液制備成所需的定量標準溶液，臨用現(xiàn)配。

1.2.2樣品前處理

供試木瓜采自海南島（經(jīng)測定不含目標化合物）。取全果樣品采用四分法縮分，用食品料理機攪碎，混勻，留250 g樣品。分別準確稱取樣品5.00 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，分別加入5.0 mL 0.25 %乙酸溶液和10.0 mL乙腈，提取過程依據(jù)NY/T 761—2008《蔬菜和水果中有機磷、有機氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留的測定》［25］標準方法進行。分取5 mL上層清液于15 mL離心管中，分別加入5 mL 0.25 %抗壞血酸于離心管中，充分混勻，于50 ℃水浴中衍生60 min，冷卻，充分混勻，于40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮，用乙腈定容至5 mL，上機待測。

1.2.3色譜條件

Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流速0.30 mL/min；流動相乙腈-水，洗脫梯度見表1；進樣量2 μL。

表1　梯度洗脫條件Table 1　Gradient elution parameterss

1.2.4質(zhì)譜條件

電噴霧正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測模式進行檢測。碰撞氣（氮氣）壓力：6mtorr；氣簾氣壓力：137.9 kPa；霧化氣壓力：344.75 kPa；噴霧電壓：4 500 V；離子源溫度：600.0 ℃。選擇性離子監(jiān)測見表2。

表2　多反應(yīng)監(jiān)測模式下的保留時間、定性、定量離子、去簇電壓及碰撞能量TTaabbllee 22 　　RReetteennttiioonn ttiimmee， qquuaalliittaattiivvee aanndd qquuaannttiittaattiivvee iioonnss， ddeecclluusstteerriinngg ppootteennttiiaall， aanndd ccoolllliissiioonn eenneerrggyy iinn mmuullttiippllee rreeaaccttiioonn mmoonniittoorriinngg （MMRRMM） mmooddee

2　　結(jié)果與分析

2.1樣品前處理條件的優(yōu)化

提取劑的選擇：比較了2 種提取劑乙腈和乙腈中加入乙酸混合提取劑的回收率，結(jié)果表明：乙腈提取劑的提取率偏低，致使回收率低于70%，而使用乙腈中加入乙酸混合提取劑的回收率能達到農(nóng)藥殘留檢測的要求，并最終確定采用乙腈中加入0.25%的乙酸提取。

2.2質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用0.05 mg/L的聯(lián)苯肼酯標準溶液，以10 μL/min的流速進行Q1掃描，確定母離子，在電噴霧正負離子模式下分別進行全掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在電噴霧正離子模式下，響應(yīng)較好，故選擇在電噴霧正離子掃描模式下進行檢測，可滿足靈敏度要求。用蠕動泵儀10 μL/min的流速連續(xù)注射，對聯(lián)苯肼酯進行一極質(zhì)譜分析（Q1掃描），得到準確分子離子峰；對準確分子離子峰進行二極質(zhì)譜分析（子離子掃描）得到碎片離子信息，優(yōu)化碰撞能量（圖1）。

圖 1　多反應(yīng)監(jiān)測模式下聯(lián)苯肼酯標準品（a）、木瓜空白樣品（bb）、聯(lián)苯肼酯加標樣品（2.0 ng/kg）（c）、聯(lián)苯肼酯烯加標樣品（dd）總離子及定量離子流（ee）圖Fig.1　Total and quantitative ion current chromatograms of b ifenazate standard （a）， blank papaya sample （b）， sample spiked with bifenazate （c），and sample spiked with bifenazate-diazene （d）， under multiple reaction monitoring mode （e）

2.3方法的線性方程、精密度和回收率

2.3.1線性方程

將一定質(zhì)量濃度的基質(zhì)標準工作溶液按1.2.3節(jié)所述條件測定，以聯(lián)苯肼酯的定量離子峰面積（y）為縱坐標，以其質(zhì)量濃度（x）為橫坐標繪制標準曲線，得到線性方程及相關(guān)系數(shù)（表3）。結(jié)果表明：在0.25～2.0 ng/mL范圍內(nèi)，方程的線性關(guān)系良好。在此條件下，聯(lián)苯肼酯的保留時間為2.35 min。

表3　聯(lián)苯肼酯的線性方程及其相關(guān)系數(shù)TTaabbllee 33 　　LLiinneeaarr eeqquuaattiioonn wwiitthh ccoorrrreellaattiioonn ccooeeffffi i cciieenntt ffoorr bbiiffeennaazzaattee

2.3.2檢出限和定量限

根據(jù)3 倍信噪比計算，木瓜中聯(lián)苯肼酯的檢出限為5.89×10－6mg/kg，通過實際添加回收實驗確定木瓜中聯(lián)苯肼酯的定量限為1.0×10－6mg/kg。

2.3.3精密度和回收率

在1.0、2.0 ng/kg和10.0 ng/kg 3 個添加量下進行回收率實驗，平均回收率在78.3%～109.8%之間，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）在4.0%～8.8%之間，均滿足定量分析要求，結(jié)果見表4。

表 4　聯(lián)苯肼酯及聯(lián)苯肼酯烯添加平均回收率及相對標準偏差（n==55）Taabbllee 44 　　AAvveerraaggee rreeccoovveerriieess aanndd rreellaattiivvee ssttaannddaarrdd ddeevviiaattiioonnss （RRSSDD） ffoorr bifenazate and bifenazate-diazenee （n = 55）%

3　　結(jié) 論

本研究采用超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，以電噴霧正離子掃描和多反應(yīng)監(jiān)測模式，建立了木瓜中聯(lián)苯肼酯及聯(lián)苯肼酯烯的殘留檢測方法。對其前處理條件進行了考察，并優(yōu)化了質(zhì)譜條件，采用基質(zhì)匹配保準曲線外標法定量，保證了定量的準確性。該方法對供試農(nóng)藥的定量限為1.0×10－6mg/kg，出峰時間為2.35 min，整個檢測時間為5 min，與傳統(tǒng)液相色譜相比，節(jié)省了檢測時間，提高了檢出限。串聯(lián)質(zhì)譜的檢測方法能夠避免雜質(zhì)的干擾，能很好地排除基質(zhì)干擾，提高分析的選擇性和檢測靈敏度，該方法的線性、靈敏度、準確度和精密度均能滿足殘留分析的要求。

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Determining of Bifenazate and Its Metabolite Residues in Papaya by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHANG Yue， HAN Bingjun， ZHAO Fangfang
（Hainan Provinc ial Key Laboratory of Quality and Safety for Tropical Fruits and Vegetables， Analysis and Testing Center，Chinese Academy of Tropical Agriculture Science， Haikou571101， China）

An ultra performance liquid chromatography-tan dem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） method for the determination of residues of bifenazate and its metabolite bifenazate-diazene in papaya was established. The sample was extracted with acetonitrile and acetic a cid （0.25%） after being homogenized. The organic phase was then separated fro m water phase b y adding sodium chloride and derivatized for 60 min after the addition of 0.25%. Finally， the target analytes were separated by a Waters ACQUITY UPLC BEH C18column （50 mm × 2.1 mm， 1.7 μm）. A tandem quadrupole mass spectrometer operated in MS/MS mode for multiple-reaction monitoring （MRM） was used for the qualitative and quantitative analyses of the const itue nts. The results showed that the av erage recoveries of bifenazate and bifenazate-diazene ranged from 78.3% to 109.8% with relative standard deviation （ RSDs） of 4.0%-8.8% at spiked levels from 1.0 to 10.0 ng/kg （n = 5）. The calibration curves showed good li nearity in the range of 0.25-2.0 ng/mL， with correlation coeffi cient over 0.999 8. The limit of quantifi cation （LOQ） was 1×10-6mg/kg for both bifenazate and its metabolite. The method is applicable for the determination of bifenazate pesticide residues in papaya.

ultra per formance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）； papaya； bifenazate；bifenazate-diazene； residue

O657.72；S482.3

A

1002-6630（2015）24-0270-04

10.7506/spkx1002-6630-201524050

2015-02-04

張月（1981—），女，助理研究員，碩士，主要從事農(nóng)藥殘留登記研究。E-mail：ghzy_0708@163.com