張祿捷，李 榮，姜子濤*（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津　300134）

茼蒿葉中總黃酮的提取純化及抗氧化活性分析

張祿捷，李 榮，姜子濤*
（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300134）

采用二次回歸 正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)法優(yōu)化茼蒿葉總黃酮的提取條件，并利用制備色譜對(duì)粗黃酮進(jìn)行純 化，最后通過(guò)不同的方法從4 個(gè)方面評(píng)價(jià)總黃酮的抗氧化活性。結(jié)果表明，茼蒿葉總黃酮的最佳提取工藝條件為：微波溫度73 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)68%、液料比30∶1（mL/g）、微波功率400 W和微波時(shí)間8 min。在此條件下實(shí)際總黃酮提取率為0.554%。優(yōu)化后的總黃酮提取物在總抗氧化活性、羥自由基和DPPH自由基的清除作用，以及對(duì)卵黃脂蛋白脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用方面表現(xiàn)出較高的活性。

茼蒿葉總黃酮；二次回歸正交旋轉(zhuǎn)；制備色譜；抗氧化性

茼蒿（Chrysanthemum coronarium L.）為我國(guó)常見的蔬菜，又名蓬蒿，菊科茼蒿屬，一年生或二年生草本植物。原產(chǎn)于我國(guó)，也有說(shuō)其原產(chǎn)于地中海地區(qū)［1］。莖葉可食用，亦可入藥，具有調(diào)胃健脾、降壓補(bǔ)腦等效用。茼蒿中含有多種氨基酸、膽堿、精油和維生素等多種物質(zhì)，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體代謝、消除水腫及抑制腫瘤轉(zhuǎn)移［2-3］。此外，茼蒿還具有改善記憶力和調(diào)理脾胃等功能［4］。

黃酮類化合物是植物中主要的藥理活性成分，具有降血脂、降血糖、抗腫瘤、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功能。有關(guān)茼蒿中黃酮類成分的分離鑒定已有少量報(bào)道，Anyos等［5］從茼蒿花序中檢測(cè)出槲皮素-7-O-葡萄糖苷、六羥基黃酮、木犀草素和少量的山奈酚糖苷，Ibrahim等［6］發(fā)現(xiàn)茼蒿還含有芹黃素。林丹英等［7］發(fā)現(xiàn)茼蒿黃酮提取液對(duì)羥自由基的清除作用比較明顯，其清除能力隨黃酮質(zhì)量濃度的增加而增大。另外，酚及多酚類也是廣泛存在于茼蒿中的另一類生物活性成分。人們已從茼蒿中檢測(cè)出異阿魏酸［8］、阿魏酸甲酯［9］和對(duì)羥基苯甲酸甲酯［8］等3種酚類化合物，以及綠原酸、異綠原酸和3，5-二咖啡?；鼘幩岬? 種多酚類化合物的存在［10-11］。

近年來(lái)，微波輔助提取技術(shù)在提取多糖、生物堿以及其他活性物質(zhì)等領(lǐng)域已經(jīng)顯露出常規(guī)的提取技術(shù)無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)，并具有廣闊的應(yīng)用前景［12-13］。鑒于不同國(guó)家的地理?xiàng)l件、降雨量、光照時(shí)間等有較大的差異，導(dǎo)致植物成分會(huì)有較大的不同。因此，開展中國(guó)產(chǎn)茼蒿黃酮的研究，具有一定理論和實(shí)際意義。本實(shí)驗(yàn)采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)優(yōu)化了茼蒿葉黃酮的提取條件，然后利用制備色譜對(duì)粗黃酮提取物進(jìn)行了快速純化，并分別從總體抗氧化活性、羥自由基和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的清除以及對(duì)卵黃脂蛋白脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用幾方面對(duì)茼蒿葉黃酮的抗氧化活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，為該植物黃酮在食品及相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

茼蒿葉2014年6月購(gòu)自于天津當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)（天津本地產(chǎn)，食用期），剔除腐爛葉，洗滌并瀝干水分，70 ℃烘干48 h，恒質(zhì)量，粉碎，過(guò)40 目篩。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（分析純）北京化學(xué)試劑公司；甲醇（色譜純）天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；超純水本實(shí)驗(yàn)室自制；石油醚（分析純）天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

Multisynth微波合成儀意大利Milestone公司；U-3900型紫外-可見分光光度計(jì)日本Hitachi High-Technologie公司；Lambda25紫外-可見分光光度計(jì)珀金埃爾默儀器有限公司；Grace RevelerisTM全息快速純化色譜系統(tǒng)美國(guó)Alltech公司；1100 Series高效液相色譜儀美國(guó)Agilent公司；FA1104N型電子天平上海精密儀器有限公司；RE52-86A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠；純水器成都超純科技有限公司。

1.3方法

1.3.1茼蒿葉總黃酮的微波輔助工藝

稱取1.0 g茼蒿葉粉末置于微波反應(yīng)器的圓底燒瓶中，以乙醇溶液為溶劑，按照一定的溫度、微波功率、液料比和時(shí)間進(jìn)行提取，待提取液冷卻后采用布氏漏斗進(jìn)行抽濾以除去葉渣，濾液經(jīng)石油醚萃取3 次，棄去石油醚層，濾液即總黃酮提取液用相應(yīng)的乙醇溶液定 容到30 mL。

1.3.2茼蒿葉總黃酮提取率測(cè)定

參照文獻(xiàn)［14］，適當(dāng)修改如下，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，精確稱量20.0 mg，用30%的乙醇溶液溶解，移入100 mL容量瓶中，定容，即為質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密量取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL分別置于10 mL比色管中，依次加入0.40 mL 5%的NaNO2溶液，搖勻后靜置5 min，分別加入0.40 mL 10% Al（NO3）3溶液，靜置6 min，加入4.0 mL 4% 的NaOH溶液，搖勻后定容。靜置10 min，以試劑空白作為參比，于508 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。所得數(shù)據(jù)經(jīng)回歸處理，得到各反應(yīng)體系中蘆丁含量與吸光度的回歸方程為A=10.902 8C－0.000 7（R2=0.999 0），式中：A為508 nm波長(zhǎng)處的吸光度；C為蘆丁質(zhì)量濃度。

取1.0 mL黃酮提取液，稀釋4 倍以確保顯色后吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，取1 mL稀釋液按上述方法，測(cè)定其在508 nm波長(zhǎng)處的吸光度，根據(jù)回歸方程，得到茼蒿葉提取液中黃酮質(zhì)量濃度C，每組做3 次平行實(shí)驗(yàn)，總黃酮提取率見式（1）：

式中：C為由回歸方程計(jì)算的茼蒿提取液中總黃酮的質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.3單因素試驗(yàn)

通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定了各因素對(duì)茼蒿葉總黃酮提取率的影響大小依次為：乙醇體積分?jǐn)?shù)＞液料比＞微波溫度＞微波功率＞提取時(shí)間，其中液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和微波溫度3 個(gè)因素對(duì)總黃酮提取率影響較顯著，其余2 個(gè)因素的影響不顯著。鑒于實(shí)驗(yàn)中所用的Multisynth微波合成儀具有自動(dòng)溫控功能，當(dāng)溫度達(dá)到設(shè)定溫度時(shí)，儀器會(huì)自動(dòng)調(diào)整微波功率使提取液維持在設(shè)定溫度。微波功率越大，達(dá)到設(shè)定溫度的時(shí)間就越短。因此，微波功率和溫度對(duì)總黃酮提取的影響要綜合起來(lái)進(jìn)行考察。

以乙醇溶液作為提取劑，分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)（50%、60%、70%、80%和90%）、微波溫度（60、65、70、75、80 ℃）、液料比（20∶1、25∶1、30∶1、35∶1和40∶1），以及微波功率（300、400、500 W）與微波時(shí)間（7、8、9、10 min）對(duì)茼蒿葉總黃酮提取率的影響。根據(jù)公式（1）計(jì)算總黃酮的提取率。

1.3.4二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)

參照文獻(xiàn)［15］的方法，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果分析，確定以乙醇體積分?jǐn)?shù)（X1，變化范圍為50%～80%）、液料比（X2，變化范圍為20∶1～40∶1）、微波溫度（X3，變化范圍為60～80 ℃）為影響因素，按照1.3.2節(jié)方法測(cè)定黃酮含量，進(jìn)行二次回歸正交組合試驗(yàn)。由于因素?cái)?shù)m=3，故選用正交表L8（27）進(jìn)行變換，二水平試驗(yàn)次數(shù)mc為8，星號(hào)試驗(yàn)次數(shù)mγ為2，m為6，零水平試驗(yàn)次數(shù)m0為4，依照星號(hào)臂長(zhǎng)γ的計(jì)算公式得γ=1.414。水平編碼表見表1［16-18］。

表1　水平取值及編碼表Taabbllee 11 　CCooddeedd lleevveellss ooff iinnddeeppeennddeenntt vvaarriiaabblleess cchhoosseenn ffoorr qquuaaddrraattiicc regression orthogonal rotary desiggnn

1.3.5制備色譜純化茼蒿葉總黃酮及純化效果檢測(cè)

按照1.3.4節(jié)在最佳工藝條件下得到的總黃酮提取液，經(jīng)減壓旋蒸至無(wú)乙醇后，冷凍干燥。稱取冷凍干燥后的茼蒿葉粗黃酮粉末5 g，溶于200 mL甲醇后轉(zhuǎn)移到500 mL容量瓶，蒸餾水定容，得到質(zhì)量濃度為10 mg/mL的總黃酮溶液，為制備樣品液。

制備色譜純化條件：柱填料為12g RevelerisTMRP C18Cartridge，流動(dòng)相為1%乙酸溶液（A）和甲醇（B），流速為10 mL/min，進(jìn)樣量為15 mL，檢測(cè)波長(zhǎng)為UV 272 nm，梯度洗脫條件為：0～15 min：0～70% B，15～20 min：70%～80% B，流動(dòng)相A始終保持10%不變，設(shè)置儀器收集峰所對(duì)應(yīng)洗脫液得制備色譜純化總黃酮溶液。將上述制得純化后茼蒿葉總黃酮溶液，減壓旋蒸至無(wú)乙醇后，冷凍干燥，得到純化后茼蒿葉總黃酮粉末。

高效液相色譜條件：Zorbax SB-C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇（A）、水（B）和1%乙酸溶液（C），流速為0.9 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，洗脫條件為0～30 min，10%～80% A，1%乙酸溶液一直保持10%，檢測(cè)波長(zhǎng)為272 nm。

總黃酮得率計(jì)算見式（2）：

1.3.6茼蒿葉總黃酮的抗氧化活性的測(cè)定

參照文獻(xiàn)［19-20］方法采用磷鉬絡(luò)合物法并稍加改進(jìn)。配制質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL經(jīng)制備色譜純化并凍干成粉末的茼蒿葉總黃酮溶液和VC溶液。在一系列10 mL比色管中分別加入4.0 mL磷鉬試劑（終濃度0.6 mol/L硫酸、4.0 mmol/L鉬酸銨和28.0 mmol/L磷酸鈉）和0.4 mL總黃酮樣品液，迅速搖勻后置于95 ℃水浴中恒溫90 min，在695 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)量不同樣品液的吸光度A，對(duì)照組為4.0 mL磷鉬試劑和0.4 mL 70%乙醇溶液。

1.3.7茼蒿葉總黃酮清除DPPH能力的測(cè)定

參照文獻(xiàn)［21］方法改進(jìn)，分別配制質(zhì)量濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL純化后的茼蒿葉總黃酮及VC溶液，在一系列10 mL比色管中分別加入3.5 mL 1.0×10－4mol/L的DPPH溶液，后加入0.5 mL無(wú)水乙醇，搖勻閉光反應(yīng)30 min，以無(wú)水乙醇為參比，測(cè)定其在517 nm波長(zhǎng)處吸光度A1；同時(shí)用同樣方法測(cè)定3.5 mL 1.0×10－4mol/L的DPPH溶液和0.5 mL樣品液的吸光度A；測(cè)定3.5 mL無(wú)水乙醇與0.5 mL樣品液在517 nm波長(zhǎng)處的吸光度A0，則樣品液對(duì)DPPH自由基的清除率計(jì)算見式（3）：

根據(jù)吸光度分別計(jì)算樣品液對(duì)DPPH自由基的清除率。

1.3.8茼蒿葉總黃酮對(duì)羥自由基的清除率 測(cè)定

參照文獻(xiàn)［22］方法改進(jìn)。采用結(jié)晶紫法，配制0.05 mg/mL的 VC和純化后茼蒿葉總黃酮溶液。在10 mL比色管中加入0.2 mL結(jié)晶紫（0.4 mmol/L），后加入3 mL磷酸氫二鉀-檸檬酸緩 沖溶液（pH 4.0），繼續(xù)添加2 mL FeSO4溶液（15 mmol/L）和2 mL H2O2（15 mmol/L）溶液，緩沖溶液定容至10 mL，搖勻放置30 min，在58 0 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度A0，同時(shí)測(cè)定不加H2O2時(shí)，其吸光度為Ab。實(shí)驗(yàn)組中，加入H2O2之前，加入不同體積純化后茼蒿黃酮樣品液，測(cè)定其吸光度為Ax。則樣品液對(duì)羥自由基的清除率計(jì)算見式（4）：

1.3.9Fe2+誘發(fā)卵黃脂蛋白過(guò)不飽和脂肪酸過(guò)氧化體系中抗氧化活性的測(cè)定

分別配制質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.3 mg/mL純化后茼蒿葉總黃酮溶液和VC溶液。將卵黃懸浮液（pH 7.45）與0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液按1∶1的比例混合，磁力攪拌10 min后，進(jìn)一步用磷酸鹽緩沖液稀釋至1∶25，適當(dāng)攪拌后得到的懸浮液。吸取配好的卵黃懸浮液0.2 mL、茼蒿葉總黃酮溶液0.6 mL、25 mmol/L的 FeSO40.2 mL于離心管中，用磷酸鹽緩沖液補(bǔ)充至 2.0 mL，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，取出后加入0.5 mL質(zhì)量濃度為 20%三氯乙酸溶液，搖勻，靜置10 min，放入離心機(jī)中，以 3 500 r/min的速率離心10 min。離心后取2.0 mL 上清液，在其中加入1.0 mL 0.8%硫代巴比妥酸溶液，沸水浴15 min。冷卻后于532 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度Ax?？瞻坠転榱姿猁}緩沖液。對(duì)照管Ao操作步驟同上，只是不加樣品液。按照式（5）計(jì)算樣品液對(duì)卵黃脂蛋白脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制率：

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

分別測(cè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、60%、70%、80%和90%時(shí)茼蒿葉總黃酮的提取率。由圖1A可知，茼蒿葉總黃酮的提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高而逐漸增大，乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到一定值時(shí)，提取率反而降低，原因可能是在一定乙醇體積分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)黃酮類化合物的溶解度會(huì)升高，但過(guò)高時(shí)會(huì)促使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固，導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)不易溶出［23］。所以選擇進(jìn)一步優(yōu)化茼蒿總黃酮的乙醇體積分?jǐn)?shù)在50%～80%之間。

選擇乙醇的體積分?jǐn)?shù)70%、微波溫度75 ℃，固定其他條件，選擇不同液料比20∶1、25∶1、30∶1、35∶1及40∶1（mL/g）時(shí)，分別測(cè)定茼蒿葉黃酮提取率。由圖1B可知，隨著乙醇溶液體積的增加，黃酮類化合物溶出增多，30∶1時(shí)提取率最大，隨后減小。選擇進(jìn)一步優(yōu)化提取茼蒿葉總黃酮的液料比為20∶1～40∶1。

選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，固定其他條件，測(cè)定微波溫度在60、65、70、75、80 ℃時(shí)，測(cè)定茼蒿葉總黃酮的提取率。由圖1C可知，在 60～80 ℃范圍內(nèi)，隨著微波溫度的升高，茼蒿葉總黃酮提取率逐漸升高，但隨著溫度的升高提取率會(huì)下降。由于5 個(gè)溫度條件下黃酮提取率相差不大，故選擇優(yōu)化時(shí)的溫度范圍為60～80 ℃。

當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、微波溫度為70 ℃、液料比為30∶1時(shí)，選擇不同的微波功率及時(shí)間，根據(jù)方法1.3.1節(jié)提取茼蒿葉總黃酮。由圖1D可知，微波功率300 W時(shí)的提取率較400 W和500 W稍低，400 W和500 W的提取率相當(dāng)，根據(jù)試驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，當(dāng)微波溫度達(dá)到設(shè)定溫度時(shí)，功率就不再升高，只需數(shù)十瓦即可維持設(shè)定溫度，所以選取微波功率400 W條件下提取8 min為最佳提取條件。

圖 1　單因素對(duì)茼蒿葉總黃酮提取率的影響Fig.1　Effect of process conditions on the extraction effi ciency of total fl avonoids

2.2二次回歸正交旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)與處理

2.2.1二次回歸正交旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)方法1.3.4節(jié)，二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2　二次回歸正交組合設(shè)計(jì)表及結(jié)果TTaabbllee 22 　OOrrtthhooggoonnaall rreeggrreessssiioonn ddeessiiggnn wwiitthh eexxppeerriimmeennttaall rreessuullttss

2.2.2二次回歸正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析與處理

運(yùn)用SAS 9.2軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算，各項(xiàng)方差分析和參數(shù)估計(jì)及顯著性分析的主要結(jié)果歸納分別見表3、4。由表3二次回歸模型F=13.38，P=0.000 6＜0.001；失擬性檢驗(yàn)的F=0.67，P=0.674 9＞0.05，說(shuō)明該模型擬合得很好。一次項(xiàng)、二次項(xiàng)和交互項(xiàng)的P值分別P＜0.05、P＜0.001和P=0.224 6，說(shuō)明3 個(gè)因素均對(duì)提取率有顯著影響，而交互作用的影響則不顯著。

表3　總黃酮提取條件的回歸正交試驗(yàn)方差分析表TTaabbllee 33 　AAnnaallyyssiiss ooff vvaarriiaannccee ooff tthhee eexxttrraaccttiioonn eeffffi i cciieennccyy ooff ttoottaall fl avonoids with extraction conditionss

表 4　提取試驗(yàn)二次回歸模型參數(shù)Taabbllee 44 　PPaarraammeetteerrss ooff qquuaaddrraattiicc rreeggrreessssiioonn oorrtthhooggoonnaall mmooddeell

由表4可知，各因素的影響程度由大到小依次為X1＞X3＞X2，即乙醇體積分?jǐn)?shù)＞微波溫度＞液料比。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合，去除X1X2、X1X3、X2X3交互項(xiàng)以及X2項(xiàng)，得到優(yōu)化后的茼蒿葉總黃酮提取率（y）的 二次多項(xiàng)回歸方程為：

y=－63.914 5+0.899 1X+0.974 8X－0.008 6X2－

1310.007 59X2－0.008 0X223

對(duì)回歸方程進(jìn)行優(yōu)化后整個(gè)模型（P=0.000 6＜0.001）極為顯著；失擬項(xiàng)（F=0.67，P=0.674 9＞0.05）不顯著，說(shuō)明試驗(yàn)無(wú)其他顯著因素的影響，試驗(yàn)條件合適［24］，該回歸方程與實(shí)際情況擬合的較好，其中R2=0.937 7。通過(guò)回歸模型預(yù)測(cè)的茼蒿葉總黃酮的最佳提取條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)68.17%、液料比29.76∶1、溫度73.19 ℃，微波功率400 W和微波時(shí)間8 min。在此條件下總黃酮提取率的預(yù)測(cè)值為0.575%，考慮到實(shí)際可操作性，將工藝參數(shù)修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)68%、液料比30∶1、溫度73 ℃、微波功率400 W和微波時(shí)間8 min。在此條件下驗(yàn)證后實(shí)際總黃酮提取率為0.554%，相對(duì)誤差為－3.65%，與預(yù)測(cè)值差異較小，證明此方法可以較好地對(duì)茼蒿葉總黃酮的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，并且是真實(shí)可靠的。2.3茼蒿葉總黃酮純化效果

2.3.1純化得率和純度

根據(jù)公式（5）計(jì)算，純化前粗黃酮粉末為5 g， 純化后冷凍干燥粉末0.89 g，則純化得率為17.8%。分別稱取純化前的茼蒿葉粗黃酮粉末和純化后的茼蒿葉黃酮粉末各10 mg，分別溶于10 mL 70%乙醇溶液，得到質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液，取1 mL溶液與比色管中，按1.3.2節(jié)方法顯色，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算茼蒿葉粗黃酮粉和純化后黃酮粉中茼蒿葉總黃酮的含量，結(jié)果如表5所示。

表5　茼蒿葉粗黃酮粉經(jīng)制備色譜純化前后結(jié)果對(duì)比Table 5　Total fl avonoid contents of Chrysanthemum coronariiuumm L. leeaaff eexxttrraacctt bbeeffoorree aanndd aafftteerr ppuurriiffi i ccaattiioonn bbyy pprreeppaarraattiivvee cchhrroommaattooggrraapphhyy

由表5可知，茼蒿葉粗黃酮粉末經(jīng)純化后總黃酮含量是純化前的3.8 倍，純化效果較好。

2.3.2純化前后茼蒿葉總黃酮成分的高效液相色譜圖

如圖2所示，茼蒿葉粗黃酮純化前圖譜中14～20 min時(shí)響應(yīng)值偏離零線較高，這可能是由于提取液存在雜質(zhì)引起的，而在純化后的圖譜中則未見此情況，說(shuō)明利用制備色譜得到的成分比較純凈，雜質(zhì)大大減少且純度明顯提高。制備色譜在較短的時(shí)間內(nèi)完成了5 g茼蒿葉粗黃酮的純化，表明制備色譜高效快速，具有大孔樹脂不可比擬的優(yōu)勢(shì)［25］。

圖 2　茼蒿葉粗黃酮純化前（A）和純化后（B）的高效液相色譜圖Fig.2　HPLC profi les of fl avonoids from Chrysanthemum coronarium L. leaves before and after purifi cation by preparative chromatography

2.4茼蒿葉總黃酮的抗氧化活性

2.4.1總抗氧化能力

圖 3　吸光度與樣品液質(zhì)量濃度的關(guān)系Fig.3　Relationship between absorbance and fl avonoid concentration

具有抗氧化能力的物質(zhì)能將磷鉬絡(luò)合物中的Mo （+6價(jià)）還原為綠色的Mo（+5價(jià)），這種絡(luò)合物在695 nm波長(zhǎng)處有最大吸收波長(zhǎng)，并且其吸光度與它具有的抗氧化活性呈正相關(guān)。由圖3可知，隨著樣品液質(zhì)量濃度的增加，吸光度越大，說(shuō)明茼蒿葉總黃酮具有抗氧化活性，與VC溶液趨勢(shì)基本一致，但相比之下茼蒿葉總黃酮抗氧化能力較VC弱。

圖 4　DPPH自由基清除率與樣品液質(zhì)量濃度的關(guān)系Fig.4　Relationship between DPPH radical scavenging activity and fl avonoid concentration

2.4.2清除DPPH自由基能力由圖4可知，茼蒿葉總黃酮成分具有清除DPPH自由基的作用，且隨質(zhì)量濃度增加清除率增大。但與VC這種人工抗氧化劑相比，其清除效果仍然低于同質(zhì)量濃度的VC。

2.4.3清除羥自由基能力

圖 5　羥自由基清除率與樣品液質(zhì)量濃度的關(guān)系Fig.5　Relationship between hydroxyl radical scavenging and fl avonoid concentrations

如圖5所示，隨總黃酮溶液質(zhì)量濃度增大羥自由基清除率也逐漸升高，說(shuō)明茼蒿葉總黃酮成分具有清除羥自由基的能力，但較VC的清除能力低。

2.4.4卵黃脂蛋白體系中抗氧化活性

圖 6　樣品質(zhì)量濃度對(duì)卵黃脂蛋白脂質(zhì)的抑制率Fig.6　Inhibitory rate of fl avonoids from Chrysanthemum coronarium L. leaves at different concentrations on lipid peroxidation of yolk lipoprotein

由圖6可知，茼蒿葉總黃酮和VC對(duì)Fe2+引發(fā)的卵磷脂脂質(zhì)體過(guò)氧化均有抑制作用。茼蒿葉總黃酮的抑制率隨著質(zhì)量濃度的增加而逐漸增大，雖然低質(zhì)量濃度時(shí)，VC較茼蒿葉總黃酮抑制率高，但其隨質(zhì)量濃度增大抑制率沒有明顯變化，茼蒿葉總黃酮?jiǎng)t在質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL時(shí)抑制率達(dá)到73.7%，VC在0.6 mg/mL時(shí)的抑制率最高為67.2%，表明茼蒿葉總黃酮具有良好的抗脂質(zhì)氧化能力。

33　結(jié) 論

采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)對(duì)茼蒿葉黃酮微波提取條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)提取條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)68%、液料比30∶1、微波溫度73 ℃、微波功率400 W和微波時(shí)間8 min，在此條件下茼蒿葉總黃酮的提取率為0.554%。利用制備色譜實(shí)現(xiàn)了對(duì)茼蒿葉粗黃酮的快速純化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，茼蒿葉黃酮類物質(zhì)表現(xiàn)出較好的抗氧化活性，在自由基的清除以及卵黃脂蛋白脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制方面均有一定的作用。研究［26］表明，沒有一種單一的方法能夠充分地評(píng)價(jià)一種物質(zhì)的抗氧化能力，需采用多種方法從不同角度對(duì)其進(jìn)行，在本次實(shí)驗(yàn)中茼蒿葉黃酮提取液在總抗氧化性、清除羥自由基和DPPH自由基方面略遜于VC，但在卵黃脂蛋白脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制方面比其稍強(qiáng)，因此也可以作為一種天然抗氧化劑在食品工業(yè)領(lǐng)域得到開發(fā)利用。但實(shí)驗(yàn)對(duì)所提取的黃酮類物質(zhì)的組分結(jié)構(gòu)目前還不清楚，需要進(jìn)一步研究確定。

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Extraction， Purifi cation and Antioxidant Activity of Total Flavonoids from Chrysanthemum coronarium L. Leaves

ZHANG Lujie， LI Rong， JIANG Zitao*
（Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology， College of Biotechnology and Food Science，Tianjin University of Commerce， Tianjin300134， China）

The extraction conditions of total flavonoids from Chrysanthemum coronarium L. leaves were optimized using quadratic regression o rthogonal rotary method. The flavonoids extracted were purified by preparative chromatography. Their antioxidant activities were evaluated by four different methods. The optimal extraction conditions were determined as follows：extraction temperature， 73 ℃； ethanol concentration， 68%； ratio of solvent to sample， 30:1； microwave power， 400 W； and extraction time， 8 min. Under the optimal extraction conditions， the extraction rate of total flavonoids was 0.554%. The fl avonoids showed high total antioxidant activity， radical scavenging activity against hydroxyl and 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical （DPPH） free radicals， and inhibitory effect on lipid peroxidation of yolk lipoprotein.

flavonoids from Chrysanthemum coronarium L. leaves； quadratic regression orthogonal rotary method；preparative chromatography； antioxidant activity

TS218

A

1002-6630（2015）24-0040-06

10.7506/spkx1002-6630-201524007

2015-04-25

天津市自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（12JCZDJC34100）

張祿捷（ 1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称诽砑觿?。E-mail：362235435@qq.com

姜子濤（1956—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称诽砑觿┘笆称贩治?。E-mail：ztjiang@tjcu.edu.cn