陳薇薇，孫海艷*，蔣 赟，郝晨星，李曉林，郭啟高，何 橋，向素瓊，梁國魯*（西南大學園藝園林學院，重慶　400716）

枇杷香氣成分固相微萃取條件的正交試驗優(yōu)化

陳薇薇，孫海艷*，蔣 赟，郝晨星，李曉林，郭啟高，何 橋，向素瓊，梁國魯*
（西南大學園藝園林學院，重慶400716）

探討頂空固相微萃取采集枇杷香氣的最優(yōu)條件，以紅肉枇杷“金華1號”為材料，采用正交試驗研究萃取溫度、萃取時間、樣品量和萃取頭類型4 個因素對枇杷香氣檢出峰數量和總峰面積的影響。以總峰面積為評價指標時，萃取條件最優(yōu)組合為萃取溫度50 ℃、萃取時間40 min、樣品量6 g和萃取頭類型85 μm PA，但檢出峰數偏低。以檢出峰數為評價指標，在保證檢出峰數差異不顯著的前提條件下，選取總峰面積大的萃取條件作為最優(yōu)組合，即萃取條件的最優(yōu)組合為萃取頭類型50/30 μm DVB/CAR/PDMS、萃取時間20 min、萃取溫度50 ℃、樣品量5 g。本研究共檢測到8 類91 種香氣成分，其中醇類物質占17.6%；醛類物質占13.2%；酯類物質占24.2%；烷烴類物質占14.3% ；酮類占9.9%；烯烴類物質占10.9%；酸類物質占6.6%；其他類物質3 種，占3.3%。

枇杷；固相微萃?。粌?yōu)化；香氣

枇杷為薔薇科（Rosaceae）蘋果亞科（Maloideae）枇杷屬（Eriobotry japonica）植物，主要分布在東亞、東南亞等熱帶亞熱帶地區(qū)［1］，是世界上重要的常綠果樹之一。我國主要分布在長江以南的浙江、安徽、江蘇和福建等省。枇杷成熟于初夏，果實甜酸適度，風味獨特，肉質細嫩，風味鮮美，堪稱果中珍品，深受人們喜愛。隨著市場對果品品質的要求越來越高，人們也越來越關注果實風味。而枇杷果實中香氣物質的種類和含量是構成并影響其風味品質的重要因素之一。因此，香氣成分分析已成為枇杷果實成熟期品質鑒別的重要研究內容之一。樣品中香氣成分的提取是進行分析的關鍵環(huán)節(jié)，已有研究提取揮發(fā)性成分多采用蒸汽蒸餾法［2-3］、有機溶劑萃取法［3-4］和動態(tài)頂空法［4-5］等。固相微萃取（solid phase micro-extraction，SPME）法與傳統技術相比，適合萃取小分子質量的揮發(fā)、半揮發(fā)性物質，具有無需有機溶劑、所需樣品量少、靈敏度高、方便快捷等優(yōu)點［5-7］，并可以與氣相色譜（gas chromatography，GC）和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）［8］等技術聯用進行分離檢測，其中SPME-GC是研究最早、也是發(fā)展最成熟的一種聯用技術，已經被廣泛應用于揮發(fā)性物質研究領域［8-10］。如在油桃、杏、百香果、草莓、葡萄、楊梅等果實香氣物質成分分析中已經廣泛運用［2，11-15］。SPME是采用針頭涂敷的吸附劑，對達到氣-液平衡的氣體化學成分進行吸附，在GC高溫進樣口解吸，通過質譜（mass spectrometry，MS）分析即可定性和定量。但在萃取過程中，萃取量、萃取頭類型、萃取溫度、萃取時間、加入的電解質和pH值、試樣混合速率等都是影響萃取效果的重要因素［16-17］。然而，有關枇杷果實香氣固相微萃取條件的優(yōu)化鮮見相關報道。因此，本研究采用多因素正交試驗設計，綜合評價固相微萃取過程中的溫度、時間、樣品量和萃取頭類型4 個因素對枇杷果肉香氣成分的檢出峰數和總峰面積的影響，篩選出最優(yōu)的萃取條件，為枇杷果實香氣組分的檢測及進一步分析提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

以西南大學選育的2014年通過重慶市農作物新品種鑒定的紅肉枇杷“金華1號”的成熟果實為材料。

1.2儀器與設備

QP2010型GC-MS聯用儀、AOC-5000自動進樣裝置日本島津公司；3 種類型萃取頭（85 μm聚丙烯酸酯（polyacrylate，PA）、65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯（polydimethylsiloxane/divinylbenzene，PDMS/ DVB）、50/30 μm二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS））美國Supelco公司；頂空進樣瓶（20 mL）中國安普公司。

1.3方法

1.3.1樣品處理

將保存的樣品用液氮研磨至粉末狀，取適量樣品于20 mL頂空萃取瓶，加入5 mL飽和氯化鈉溶液，置于自動萃取裝置的萃取盤，準備進樣。

1.3.2GC-MS操作條件

GC條件：色譜柱：Rtx-5MS（30 m×0.25 μm，0.25 mm）；升溫程序：初始溫度40 ℃，保持2 min，以3 ℃/min的速率升至150 ℃，保持1 min，再以10 ℃/min的速率升至220 ℃，保持1 min，最后以5 ℃/min的速率升至240 ℃保持2 min；載氣為氦氣，流速1 mL/min，恒線速率，進樣方式為不分流進樣。

MS條件：離子源為電子電離（electron ionization， EI）源，離子源溫度230 ℃，接口溫度240 ℃，電子能量70 eV，掃描范圍m/z 35～350。

1.3.3正交試驗設計

采用L9（34）正交試驗設計，選取萃取過程中所涉及的4 個關鍵因素，包括萃取溫度、萃取時間、樣品量和萃取頭類型。根據預實驗及前人單因素試驗確定因素范圍［16-18］，并在每個因素內設置3 個水平，以探尋最佳水平。試驗共9 個處理，重復2 次，以檢出峰數和總峰面積為評價指標，試驗設計見表1。

表1　正交試驗因素及水平Taabbllee 11 　FFaaccttoorrss aanndd lleevveellss uusseedd iinn oorrtthhooggoonnaall aarrrraayy eexxppeerriimmeennttss

1.3.4定性與定量分析

SPME采用自動進樣裝置，枇杷香氣成分分析采用GC-MS聯用儀。數據分析運用計算機檢索并與圖譜庫（NIST 08）的標準質譜圖對照，結合有關文獻，確認香氣物質的化學成分，按峰面積歸一化法算出樣品各個組分的相對含量。

1.4數據處理

對實驗結果按有重復無交互作用資料做方差分析，檢驗各因素對檢出峰數和檢出峰面積的影響。所有計算通過DPS數據分析系統9.50完成。

2.1正交試驗結果

2　結果與分析

表2　正交試驗設計與結果Taabbllee 22 　RReessuullttss aanndd aannaallyyssiiss ooff oorrtthhooggoonnaall aarrrraayy eexxppeerriimmeennttss

表3　色譜峰總峰面積方差分析Taabbllee 33 　AAnnaallyyssiiss ooff vvaarriiaannccee （AANNOOVVAA） ooff tthhee ttoottaall aarreeaass ooff GGCC ppeeaakkss

表 4　不同類型萃取頭對總峰面積的多重比較TTaabbllee 44 　MMuullttiippllee ccoommppaarriissoonn ooff ppeeaakk aarreeaa aammoonngg ddiiffffeerreenntt ttyyppeess ooff extraction fi bbeerr

如表2所示，比較總峰面積極差（R）值得知，因素效應順序為：萃取頭類型＞萃取溫度＞萃取時間＞樣品量，其中，85 μm PA檢出峰總峰面積高于其他2種萃取頭。對表2作方差分析，由表3可知，4 個因素中除不同萃取頭類型間差異達極顯著外，萃取溫度、萃取時間和樣品量間差異均不顯著。不同萃取頭類型的多重比較結果（表4）表明，85 μm PA和50/30 μm DVB/CAR/PDMS間差異顯著，但兩者與65 μm PDMS/DVB間差異達極顯著。不同處理間總峰面積的比較結果顯示（表2），3號處理總峰面積最大，除與1號處理間差異不顯著外，與其他7個處理均差異顯著。使用65 μm PDMS/DVB萃取頭的4、5、6號處理總峰面積普遍偏低，與另外2種萃取頭類型的處理間差異顯著。由此可得檢出峰總峰面積的最優(yōu)萃取條件組合為萃取溫度50 ℃、萃取時間40 min、樣品量6 g、萃取頭類型85 μm PA，即試驗中的3號處理，2個重復峰面積總和為7.571×108。

表5　色譜檢出峰數方差分析Taabbllee 55 　AAnnaallyyssiiss ooff vvaarriiaannccee （AANNOOVVAA） ooff tthhee ttoottaall nnuummbbeerr ooff GGCC ppeeaakkss

表6　不同類型萃取頭對檢出峰數的多重比較TTaabbllee 66 　MMuullttiippllee ccoommppaarriissoonn ooff ppeeaakk nnuummbbeerr aammoonngg ddiiffffeerreenntt ttyyppeess ooff extraction fi bbeerr

對檢出峰數影響最大的因素仍為萃取頭類型，且遠高于萃取溫度、萃取時間和樣品量。各處理檢出峰數的方差分析結果（表5）表明，萃取頭類型對檢出峰數有極顯著影響（P＜0.01），而萃取時間、萃取溫度和樣品量影響不顯著。對萃取頭類型進一步多重比較，結果（表

6和表2）表明，采用65 μm PDMS/DVB和50/30 μm DVB/ CAR/PDMS萃取頭的處理出峰數差異不顯著，但都顯著高于使用85 μm PA萃取頭的處理組合。

2.2 枇杷香氣成分分析

表7　9 種正交試驗組合枇杷香氣成分及其相對含量TTaabbllee 77 　AArroommaa ccoommppoonneennttss aanndd rreellaattiivvee ccoonntteennttss iinn llooqquuaatt ffrroomm nniinnee orthogonal array ruunnss

續(xù)表7

續(xù)表7

由表7可知，9種處理檢測出匹配度大于85%的香氣成分共8 類91 種，其中醇類物質16 種，占17.6%；醛類物質12 種，占13.2%；酯類物質22 種，占24.2%；烷烴類物質13 種，占14.3%；酮類9 種，占9.9%；烯烴類物質10 種，占10.9%；酸類物質6 種，占6.6%；其他類物質3 種，占3.3%。本研究中相對含量較高的為醛類和酯類類物質，醛類主要為C6～C15的醛類物質，其中C8～C13的中級醛具有果香味，C6醛則是具有“青香型”的香氣物質［19］；同時，酯類物質一般也具有使人愉快的水果香氣［20］。9 種處理香氣成分，僅有兩種共有成分癸醛和（E）-壬烯醛，處理4和處理5兩者的相對含量均在1%以上。

3　討論與結論

與單因素試驗相比，正交試驗具有工作量小、數據分析簡便直觀、獲得信息豐富等特點，在化學分析條件的優(yōu)化中應用價值很高［21］。本研究從3 個不同水平上系統比較了萃取溫度、萃取時間、樣品量和萃取頭類型4 個因素對枇杷香氣成分分析中總峰面積和檢出峰數量的影響，對SPME條件進行了優(yōu)化。綜合本研究的分析結果，萃取頭類型對總峰面積和檢出峰數有極顯著的影響。以總峰面積為評價指標時，最優(yōu)萃取條件組合（3號處理）的總峰數則偏低。以檢出峰數為指標評價時，由表2可知，處理4～9號的出峰總數較高，但差異不顯著，在保證檢出峰數差異不顯著的前提下，選取總峰面積大的萃取條件（7號處理）作為最優(yōu)萃取條件組合，即萃取頭類型50/30 μm DVB/CAR/PDMS、萃取時間20 min、萃取溫度50 ℃、樣品量5 g。

本研究香氣成分分析結果共有8 類91 種，其中醇類物質16 種，占17.6%；醛類物質12種，占13.2%；酯類物質22 種，占24.2%；烷烴類物質13 種，占14.3%；酮類9 種，占9.9%；烯烴類物質10 種，占10.9%；酸類物質6 種，占6.6%；其他類物質3種，占3.3%。在所檢測到的91種物質中，相對含量較高的的為酯類和醛類物質，同時酯類物質和醛類物質的閾值很低，低達10－9級別［22］，由此可見，酯類和醛類物質為枇杷的主要香氣成分。此外，盡管醇類物質的相對含量較低，但其閾值通常較高為10－6級別［22］，因此，醇類物質是否為枇杷的主要香氣成分有待進一步驗證。本研究中酮類和烯烴類物質的相對含量較低，但其閾值也較低，大部分為10－9級別［23-27］，比如具有紫羅蘭花香的β-紫羅蘭酮香氣閾值為7 μg/L［28］，α-蒎烯香氣閾值為4.6 μg/L［23］，因此，酮類和烯烴類也為枇杷主要的香氣成分。與其他枇杷香氣成分研究相比，付婷婷［29］對大五星枇杷的香氣成分分析研究中共檢測到6 類116 種香氣成分，含量最高的的為酯類物質，其次為醚類和醇類物質，而本研究中，僅檢測到1 種醚類物質，且相對含量在0.525%～0.97%之間；在付婷婷的研究中還檢測到烷烴類物質的種類和含量也很高，但該研究認為烷烴類物質不構成果實的香氣成分，未在文中列出。蔣際謀等［30］對香鐘枇杷和解放鐘枇杷及兩者雜交子代優(yōu)系果實的香氣成分分析研究中共檢測到了11 類91 種香氣成分，含量最高的為萜類物質中的D-檸檬烯（62.59%～68.32%），其次為醛類物質；而本研究中萜類物質的含量則較低（0.5%～5.65%）。此外，Chen Faxing等［31］的研究報道了酮、酸、酸、烷類為“早鐘6號”中含量最高的香氣成分。本研究與其他研究的差異可能與選用的品種、栽培條件等有關，同時也表明了枇杷果肉具有豐富的香氣成分。

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Orthogonal Array Optimization of Solid Phase Micro-Extraction Conditions for Loquat Aroma Compounds

CHEN Weiwei， SUN Haiyan*， JIANG Yun， HAO Chenxing， LI Xiaolin， GUO Qigao， HE Qiao， XIANG Suqiong， LIANG Guolu* （College of Horticulture and Landscape Architecture， Southwest University， Chongqing400716， China）

This study aimed to explore the optimal conditions of head space solid phase micro-extraction （HS-SPME） for the analysis of aroma compounds in “Jinhua 1” red-fl eshed loquats. An orthogonal array design was applied to establish the optimum conditions of extraction temperature， extraction time， sample weight and fi ber. The results showed that based on peak area， the optimal conditions were determined as follows: 6 g of sample was extracted at 50 ℃ for 40 min using an 85 μm PA fi ber， under which， however， a smaller number of peaks were separated， while those determined based on the total number of peaks without producing signifi cant differences in this parameter were determined as follows: 5 g of sample was extracted at 50 ℃ for 20 min using a 50/30 μm DVB/CAR/PDMS fi ber. A total of 91 aroma components were identifi ed in loquat， which belonged to eight chemical classes including alcohols （17.6%）， aldehyde （13.2%）， esters （24.2%）， alkane （14.3%）， ketone （9.9%）， olefi ns （10.9%）， acids （6.6%） and three other substances （3.3%）.

loquat； headspa ce-solid-phase micro extraction （HS-SPME）； optimization； aroma

S667.3

A

1002-6630（2015）24-0035-05

10.7506/spkx1002-6630-201524006

2015-05-26

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2013BAD02B02）；中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項（XDJK2014D046；XDJK2015C054）；西南大學本科生創(chuàng)新基金項目（1319001）

陳薇薇（1990—），女，碩士研究生，研究方向為果樹遺傳育種與生物技術。E-mail：253482217@qq.com

孫海艷（1975—），女，助理研究員，博士研究生，研究方向為果樹遺傳育種與生物技術。

E-mail：sunhaiyan1975@126.com

梁國魯（1960—），男，研究員，博士，研究方向為果樹遺傳育種與生物技術。E-mail：lianggl@swu.edu.cn