田盼盼，程 超，2，汪興平，2，*

（1.湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施　445000；2.湖北民族學(xué)院 生物資源保護與利用湖北省重點實驗室，湖北 恩施　445000）

逐級鹽析法結(jié)合雙水相萃取純化葛仙米藻藍蛋白

田盼盼1，程 超1，2，汪興平1，2，*

（1.湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施445000；2.湖北民族學(xué)院 生物資源保護與利用湖北省重點實驗室，湖北 恩施445000）

利用逐級鹽析法結(jié)合雙水相萃取對葛仙米藻藍蛋白進行純化，設(shè)計三因素二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗對提取工藝進行優(yōu)化，并應(yīng)用Design-Expert 7.0軟件建立了各影響因素與萃取純度的數(shù)學(xué)回歸模型。結(jié)果顯示最佳的提取工藝為：20% （NH4）2SO4鹽析去沉淀后用40%和50% （NH4）2SO4鹽析得藻藍蛋白，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的聚乙二醇6 000、質(zhì)量分?jǐn)?shù)18%的（NH4）2SO4進行雙水相萃取。所得產(chǎn)物純度可達到8.6，回收率為71.40%。對所得產(chǎn)物進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，得到清晰的兩條條帶（條帶1和條帶2），其分子質(zhì)量分別在35 ku和15 ku左右。通過質(zhì)譜分析可知，條帶2的分子質(zhì)量為15 ku左右，等電點5.35，部分肽的氨基酸序列為TPLTEAVAAADSQGR和DIGYYLR。通過SWISS-MODEL網(wǎng)站模擬蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)得出，條帶2可能是葛仙米藻藍蛋白的α亞基。

葛仙米；藻藍蛋白；逐級鹽析；雙水相萃??；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳；質(zhì)譜分析

SDS-PAGE electrophoresis； mass spectrometry

葛仙米（Nostoc spharoids Kützing），屬藍藻門（Cyanophyta）藍藻綱（Cyanophyceae）念珠藻科（Nostocaceae）念珠藻屬（Nostoc），又名水木耳，古名天仙菜、天仙米［1］，是一種珍貴的食用藻類資源，同時具有藥用價值。據(jù)《本草綱目拾遺》、《本草綱目》記載，葛仙米不僅對燙傷、脫肛、夜盲癥等病癥有療效，還具美容功效［2］。藻膽蛋白是藍藻和紅藻特有的捕光色素蛋白，是一種具有重要生理活性的天然色素。常用于食品、染料、化妝品和醫(yī)療保健等方面。其熒光性還可用于生物工程、免疫化學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域［3］。此外，它還是一種極具開發(fā)潛力的光敏劑，在光合作用的理論研究方面具有重要價值，并可用于腫瘤治療［4］。葛仙米中藻膽蛋白含量豐富，隨著研究的不斷深入，其商業(yè)價值日益凸顯，藻膽蛋白的開發(fā)和最大限度的利用已備受關(guān)注。已知的藻膽蛋白包括藻紅藍蛋白、異藻藍蛋白、藻藍蛋白和藻紅蛋白［5］。目前，通過轉(zhuǎn)基因方法生產(chǎn)藻膽蛋白的技術(shù)尚不成熟，因此獲取該物質(zhì)的主要途徑還停留在直接從藻類植物中提取的階段［6］。對葛仙米藻膽蛋白的提取、分離與純化工作已取得一定程度的進展。汪興平等［7］用反復(fù)凍融法對葛仙米進行細(xì)胞壁破除，將葛仙米在0 ℃條件下放置0.5 h后研磨，重復(fù)3 次后提取，其細(xì)胞壁破除效果良好，蛋白質(zhì)得率高。采用正交旋轉(zhuǎn)組合實驗對藻膽蛋白提取工藝進行優(yōu)化，確定了最佳提取條件為含0.21 mol/L NaCl的pH 7.3的磷酸鹽緩沖液，浸提4.5 h，得率為7.125%［8］。

雙水相萃?。╝queous two-phase extration，ATPE）技術(shù)始于20世紀(jì)60年代，由Albertsson最早發(fā)現(xiàn)。因其具有容易操作、適于放大生產(chǎn)且能充分保證成分的生物活性等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用［9］。國內(nèi)外關(guān)于雙水相萃取的報道很多，不少學(xué)者通過雙水相萃取出了純度較高的蛋白質(zhì)。如甘林火［10］、劉清新［11］、劉楊［12］、王巍杰［13］等都做了雙水相萃取技術(shù)純化蛋白質(zhì)的研究。對于雙水相萃取中各種條件的確定也有不少的研究，有研究指出降低上下相體積比可以使目標(biāo)蛋白純度和產(chǎn)量提高［14］。Pati等［15］發(fā)現(xiàn)逐漸提高結(jié)線長度，可在結(jié)線長度為33.53%時，提高蛋白總產(chǎn)量，最大產(chǎn)量可達97.47%。且結(jié)線長度的持續(xù)增加會導(dǎo)致界面中的蛋白質(zhì)不斷沉淀，使藻膽蛋白產(chǎn)量下降。Benavides等［16］研究發(fā)現(xiàn)，用低相對分子質(zhì)量（1 000和1 450）的聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）對B-藻紅蛋白分離效果較好。本研究結(jié)合鹽析的方法對葛仙米藻藍蛋白進行雙水相萃取，旨在為葛仙米藻藍蛋白的純化提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)基礎(chǔ)。并對純化后的產(chǎn)物進行電泳分析和質(zhì)譜分析，意在為后續(xù)的深入研究提供一定的參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

葛仙米鶴峰縣走馬鎮(zhèn)鶴峰縣葛仙米開發(fā)公司。

PEG、（NH4）2SO4、磷酸二氫鉀、三水合磷酸氫二鉀、氯化鈉、甘氨酸、考馬斯亮藍G250、溴酚藍國藥集團化學(xué)試劑有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）Biosharp生物科技公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）美國Amresco公司；過硫酸銨中國醫(yī)藥上海化學(xué)試劑公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；fermentas蛋白標(biāo)準(zhǔn)品上海澤邁生物技術(shù)有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

RT-02A型2兩裝粉碎機榮聰精密科技有限公司；SHY-2A數(shù)顯水浴恒溫振蕩器金壇市科興器廠；ALPHA1-4型真空冷凍干燥機德國Christ公司；Avanti J-30I冷凍高速離心機美國Beckman公司；WFJ7200紫外-可見光分光光度計尤尼柯（上海）儀器有限公司；FA 2140電子天平上海天平儀器公司；透析袋（3 500）Biosharp生物科技公司；Infinite 200PRO多功能酶標(biāo)儀瑞士Tecan公司；TDL-60B飛鴿牌低速臺式離心機上海右一儀器有限公司；IKA旋渦混勻器北京中科星宇商貿(mào)有限公司；DYCZ-24D型電泳槽、DYY型三恒電泳儀北京市六一儀器廠；STS-2型脫色搖床上海琪特分析儀器有限公司；GENEX單道可調(diào)移液槍芬蘭百得實驗室儀器（中國）有限公司。

1.3方法

1.3.1葛仙米藻膽蛋白粗提液的制備

稱取100 g干燥的葛仙米，粉碎，蒸餾水4 ℃充分溶脹，反復(fù)凍融3 次使細(xì)胞壁充分破除，用pH 7.3的0.5 mol/L磷酸緩沖液（含0.2 mol/L NaCl）浸提4.3 h，4℃、10 000 r/min離心20 min得藻膽蛋白粗提液。

1.3.2逐級鹽析法制取葛仙米藻膽蛋白

在1.3.1節(jié)所得粗提液中加入一定質(zhì)量的（NH4）2SO4，使溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)達到20%，鹽析過夜后冷凍離心（4 ℃、10 000 r/min離心20 min）除去沉淀得上清液。逐次在所得上清液中緩慢加入（NH4）2SO4（注意低溫條件下緩慢加入且不斷攪拌，以防止因部分（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高導(dǎo)致蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和活性變化），使（NH4）2SO4溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次達到30%、40%、50%、60%、70%。低溫靜置過夜，高速冷凍離心，透析，真空冷凍干燥得不同鹽析條件下的蛋白質(zhì)粉末。

1.3.3雙水相萃取體系的優(yōu)化

1.3.3.1雙水相體系相圖的繪制

參考Albertsson［17］濁點法，分別配制40%的PEG 1 500、4 000、6 000、8 000溶液和40%的（NH4）2SO4溶液，稱取0.700 g的PEG于大試管中，加0.5 mL水，然后向內(nèi)滴入（NH4）2SO4溶液，直到溶液剛好變渾濁，記下滴定體積，重復(fù)以上加水和滴定操作，分別計算出每次達到渾濁時溶液中PEG和（NH4）2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)［18］。以（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)，PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)繪制相圖。

1.3.3.2葛仙米藻藍蛋白的雙水相萃取體系

取1.3.2節(jié)40%和50%鹽析所得產(chǎn)物作為雙水相萃取實驗材料進行雙水相萃取實驗。

稱取一定質(zhì)量（NH4）2SO4和PEG于15 mL帶刻度試管中，加蒸餾水漩渦混勻使其完全溶解，加入10 mg/mL的葛仙米藻膽蛋白粗提液2 mL，蒸餾水調(diào)至體系總質(zhì)量為10 g?；靹蚝蟊芄廨腿?0 min，2 000 r/min離心5 min，待徹底分層后讀取上下相體積，多功能酶標(biāo)儀分別測定上下相在波長280、568 nm和615 nm處的吸光度，據(jù)公式（1）～（5）［10］計算藻藍蛋白的回收率和純度。

式（1）～（5）中：C、Ct、Cb分別為藻藍蛋白、上相藻藍蛋白和下相藻藍蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%；K為分配系數(shù)；R為相比；Vt為上相體積/mL；Vb為下相體積/mL；Ep為藻藍蛋白純度；A280 nm和A615 nm分別為相應(yīng)波長條件下的吸光度；Y為藻藍蛋白回收率/%。

1.3.3.3PEG相對分子質(zhì)量對葛仙米藻藍蛋白萃取效果的影響

依據(jù)1.3.3.1節(jié)方法所得相圖，選取一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG和（NH4）2SO4組成雙水相體系。取40%和50%鹽析所得藻膽蛋白作為雙水相萃取實驗材料，按照1.3.3.2節(jié)方法進行雙水相萃取。以葛仙米藻藍蛋白的純度和回收率為主要參考指標(biāo)，分別考察相對分子質(zhì)量為1 500、4 000、6 000、8 000的PEG對雙水相萃取效果的影響。

1.3.3.4PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)對葛仙米藻藍蛋白萃取效果的影響

在1.3.3.3節(jié)基礎(chǔ)上選取相對分子質(zhì)量最優(yōu)的PEG，并分別配制成6%、8%、10%、12%、14%的PEG溶液，和一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)（NH4）2SO4構(gòu)成雙水相體系，得出PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)對雙水相萃取藻藍蛋白效果的影響。

1.3.3.5（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對葛仙米藻藍蛋白萃取效果的影響

參考1.3.3.4節(jié)結(jié)果，選用最優(yōu)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PEG，分別和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%、14%、16%、18%、20%的（NH4）2SO4溶液構(gòu)成雙水相體系，得出（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對雙水相萃取效果的影響。

1.3.3.6中心組合試驗設(shè)計

基于單因素試驗結(jié)果，運用中心組合試驗設(shè)計原理，對顯著影響雙水相萃取藻藍蛋白純度的3 個因素PEG相對分子質(zhì)量（X1）、PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)（X2）、（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)（X3）做三因素三水平響應(yīng)面分析試驗（表1）。

表1　響應(yīng)面設(shè)計因素水平表Taabbllee 11 　FFaaccttoorrss aanndd lleevveellss uusseedd iinn tthhee cceenntteerr ccoommppoossiittee ddeessiiggnn

1.3.4藻膽蛋白的質(zhì)量及純度分析

分別稱量1.3.2節(jié)各鹽析條件下所得葛仙米藻膽蛋白，并按式（6）計算得率。

分別稱取1.3.2節(jié)鹽析所得藻膽蛋白及1.3.3節(jié)雙水相萃取所得藻藍蛋白，配成1 mg/mL溶液，于紫外-可見光分光光度計下進行光譜掃描，掃描波長250～750 nm，得光譜掃描曲線。

1.3.5SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE）分析

配制溶液：3.0 mol/L pH 8.9的Tris-HCl分離膠緩沖液；0.5 mol/L pH 6.7的Tris-HCl濃縮膠緩沖液；pH 8.3的Tris（0.05 mol/L）-甘氨酸（0.384 mol/L）電極緩沖液；50%甲醇溶液和冰醋酸按一定比例混合成固定液；考馬斯亮藍G-250染色液；樣品溶解液；甲醇和冰醋酸混合配制成脫色液。

制膠：按一定要求和比例分別配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的濃縮膠和12.5%的分離膠［19］。

樣品處理：稱取雙水相萃取所得葛仙米藻藍蛋白粉末，配成2 mg/mL溶液，樣品溶解液溶解，煮沸5 min冷卻后上樣，上樣量20 μL，標(biāo)準(zhǔn)蛋白上樣量5 μL。

電泳：連接電泳裝置，放入適量電極緩沖液后開始電泳。初始電流穩(wěn)定在10 mA左右，待樣品完全進入分離膠后，電流調(diào)至20～30 mA。待染料前沿距離膠片底部1.5 cm時停止電泳。小心取出膠片，蒸餾水浸泡10 min以除去殘留的SDS，放入固定液中固定1 h，染色液染色1 h，脫色液中脫色（前期每隔0.5 h換一次脫色液）直到膠帶清晰透明為止。

1.3.6葛仙米藻藍蛋白的質(zhì)譜鑒定

切下電泳膠片上的條帶1和條帶2，經(jīng)除鹽、濃縮，于2 μL基質(zhì)（含5 mg/mL的α-4-羥基肉桂酸的50%硝酸鈰銨，0.1%三氟乙酸溶液）中混合溶解后點樣。利用質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜分析。紫外波長為355nm，重復(fù)速率為200 Hz，加速電壓為20 000 V，最優(yōu)質(zhì)量分辨率為1 500 D，掃描質(zhì)量范圍為700～3 200 D［20-21］。

利用軟件Mascot distiller過濾基線峰、識別信號峰。利用Matrixscience公司的Mascot軟件搜索IPI_mouse數(shù)據(jù)庫，尋找匹配的相關(guān)蛋白質(zhì)，同時查詢其功能，來明確鑒定的蛋白質(zhì)種類。

2　結(jié)果與分析

2.1逐級鹽析法所得藻膽蛋白分析

2.1.1逐級鹽析所得藻膽蛋白得率和藻藍蛋白純度分析

表2　逐級鹽析所得純度和得率Taabbllee 22 　TThhee ppuurriittyy ooff pphhyyccoobbiilliipprrootteeiinn ssaalltteedd oouutt wwiitthh ddiiffffeerreenntt concentrations of ammonium sulfattee

如表2所示，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)（NH4）2SO4鹽析所得蛋白質(zhì)得率不同，其中60%鹽析蛋白質(zhì)得率最大。（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)在30%～50%范圍內(nèi)逐級鹽析時，藻膽蛋白的得率隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大而增大。實驗觀察發(fā)現(xiàn)，30%鹽析產(chǎn)物呈紅棕色，60%鹽析產(chǎn)物呈淡藍色，70%鹽析產(chǎn)物呈淡粉色，40%和50%鹽析產(chǎn)物呈深藍色。由產(chǎn)物顏色推斷：30%鹽析產(chǎn)物可能大部分是雜蛋白；40%和50%鹽析產(chǎn)物中可能含有較大量的藻藍蛋白；60%鹽析產(chǎn)物中可能僅含少量藻藍蛋白；70%鹽析產(chǎn)物中可能幾乎不含藻藍蛋白。40%和50%鹽析產(chǎn)物中藻藍蛋白純度可達到1以上。與先20%后60%鹽析的方法比較，逐級鹽析法可以逐級除去粗提液中的雜質(zhì)，得到純度較高的藻藍蛋白。

2.1.2逐級鹽析藻膽蛋白紫外-可見掃描圖譜

圖 1　逐級鹽析藻膽蛋白紫外-可見光譜掃描曲線Fig.1　UV-Vis spectra of phycobiliprotein purifi ed by stepwise salting-out

如圖1所示，40%和50%鹽析產(chǎn)物在波長280 nm處有較高峰值，在可見光區(qū)有明顯的兩個峰，且615 nm波長處（藻藍蛋白）的峰值高于波長568 nm處（藻紅蛋白）的峰值。說明這部分鹽析產(chǎn)物中含有大量藻膽蛋白，且前者含量高于后者。30%鹽析產(chǎn)物在波長280 nm處有較高的吸收峰，但568 nm和615 nm波長處的峰值較小，表明這部分物質(zhì)中雖含有較多的蛋白質(zhì)，但藻紅蛋白和藻藍蛋白的含量較低，也可能是藻藍蛋白和藻紅蛋白在處理過程中丟失了色基基團。60%和70%鹽析產(chǎn)物在波長280 nm處的吸收很少，說明這兩部分物質(zhì)中蛋白質(zhì)含量少。結(jié)合表2各質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐級鹽析產(chǎn)物質(zhì)量判斷，主要雜質(zhì)可能在60%鹽析時被除去。通過以上比較可以看出，逐級鹽析方法可有效除去蛋白質(zhì)中的其他成分，得到純度較高的藻藍蛋白和藻紅蛋白。

2.2葛仙米藻藍蛋白的雙水相萃取

圖 2　PEG 1 500、4 000、6 000、8 000和（NH4）2SSOO4雙水相相圖Fig.2　Two-phase aqueous diagrams with PEG 1 500， 4 000，6 000 or 8 000/（NH4）2SO4

2.2.1PEG-（NH4）2SO4雙水相系統(tǒng)相圖圖2為4 種不同相對分子質(zhì)量PEG和（NH4）2SO4組成雙水相體系的相圖。曲線下方各點為均勻混合體系，曲線上各點為臨界點，曲線上方各點為兩相區(qū)。從圖2可以看出，PEG相對分子質(zhì)量越小，體系分相需要（NH4）2SO4和

PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高。當(dāng)PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定時，PEG相對分子質(zhì)量越小，形成雙水相所需的（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)越大。實驗過程中發(fā)現(xiàn)，PEG相對分子質(zhì)量越高，越難在水中溶解，且溶解分相后PEG相黏度越大。這可能是由于PEG相對分子質(zhì)量越大憎水能力越強所致。

2.2.2雙水相萃取單因素試驗結(jié)果

2.2.2.1PEG相對分子質(zhì)量對雙水相萃取效果的影響

圖 3　PEG相對分子質(zhì)量對萃取效率的影響Fig.3　Infl uence of PEG molecular weight on the extracting effi ciency

選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%的PEG和16%的（NH4）2SO4組成雙水相體系。萃取分層后藻藍蛋白富集在上相PEG相，上相為藍綠色，下相無色。如圖3所示，純度和回收率呈現(xiàn)相反的變化趨勢，純度高時回收率低，回收率高時純度低。各體系的回收率均在50%以上，PEG 6 000與（NH4）2SO4形成雙水相體系萃取出的藻藍蛋白純度可達3.5以上，比其他體系的純度高出2 倍以上。故選擇PEG 6 000為最佳的相對分子質(zhì)量。

2.2.2.2PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)對雙水相萃取效果的影響

圖 4　PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)對雙水相體系萃取效果的影響Fig.4　Effect of PEG percentage on the purity and recovery of phycobiliprotein

用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PEG 6 000和16%（NH4）2SO4形成雙水相體系，萃取藻藍蛋白。結(jié)果如圖4所示，隨著PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高，藻藍蛋白純度和回收率均逐漸提高。14%的PEG 6 000和（NH4）2SO4形成體系萃取所得藻藍蛋白的純度和回收率均明顯高于其他體系，純度可達到4以上，回收率近60%。所以選擇14%為PEG 6 000的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.2.2.3（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對雙水相萃取效果的影響

圖5?。∟NHH4）2SSOO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對雙水相體系萃取效果的影響Fig.5　Effect of （NH4）2SO4concentration on the purity and recovery of phycobiliprotein

用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的（NH4）2SO4和14% PEG 6 000構(gòu)成雙水相體系，如圖5所示，（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)在14%～18%變化時，體系萃取藻藍蛋白的純度和回收率隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大而提高。18% （NH4）2SO4和14%的PEG 6 000形成體系萃取出的藻藍蛋白純度和回收率優(yōu)于其他組，但是試驗過程中發(fā)現(xiàn)，18% （NH4）2SO4與PEG形成雙水相體系時，由于（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)太大不易溶解，且形成的體系黏度較大不易分相，不利于實際操作，故選擇16%為（NH4）2SO4的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)，該體系萃取藻藍蛋白的純度在4左右，回收率可達到90%以上。

2.2.3葛仙米藻藍蛋白雙水相萃取回歸模型的建立

在單因素試驗基礎(chǔ)上，根據(jù)中心組合試驗設(shè)計原理［22］設(shè)計了17 組試驗，分別測定并計算各組藻藍蛋白的純度和回收率，試驗結(jié)果見表3。

表3　中心組合試驗設(shè)計及結(jié)果Taabbllee 33 　EExxppeerriimmeennttaall ddeessiiggnn mmaattrriixx wwiitthh eexxppeerriimmeennttaall rreessuullttss

用Design-Expert 7.0軟件對表3結(jié)果進行分析，得出各影響因素的效應(yīng)及其交互效應(yīng)的關(guān)聯(lián)方程［23］。利用軟件對雙水相萃取工藝條件進行優(yōu)化，得出響應(yīng)面圖。本研究重點考慮葛仙米藻藍蛋白的純度，因此多元回歸擬合主要以葛仙米藻藍蛋白純度作為響應(yīng)值，分析得到葛仙米藻藍蛋白純度與各因素變量的二次方程模型為：y=－696.63+ 0.02X1+37.03X2+47.65X3－5.45×10－4X1X2－2.30×10－4X1X3－1.41X2X3－7.70×10－7X12－0.41X2

2－0.83X32。2.2.4最佳雙水相萃取工藝方差分析及響應(yīng)面優(yōu)化

表 4　響應(yīng)面法方差分析Taabbllee 44 　AAnnaallyyssiiss ooff vvaarriiaannccee （AANNOOVVAA） ffoorr qquuaaddrraattiicc rreessppoonnssee ssuurrffaaccee mmooddeell

由表4的方差分析可知，各因素中，一次項X1、X2、X3不顯著，X2X3顯著，X12極顯著。由此可見，各影響因素與響應(yīng)值之間不呈簡單的線性相關(guān)關(guān)系。由方差分析結(jié)果看出，回歸模型也是顯著的，相關(guān)系數(shù)R2=61.457/70.793=0.868，說明響應(yīng)值（藻藍蛋白純度）有86.8%的變化由試驗各影響因素決定，即PEG相對分子質(zhì)量、PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)和（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)。因此，該方程可以對試驗各因素與響應(yīng)值之間的真實關(guān)系進行較好的描述，可利用此回歸模型對實驗可能產(chǎn)生的真實結(jié)果進行預(yù)測和分析［24］，得出最佳雙水相萃取工藝條件。

圖 6　各因素交互作用的響應(yīng)面與等高線Fig.6　Response surface plot and contour plot showing the effects of process conditions on phycobiliprotein purity

由圖6響應(yīng)面3D圖和等高線分析圖可以直觀地看出各個因素的交互作用［25］。PEG相對分子質(zhì)量與（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)交互作用較強，在因素所選范圍內(nèi)響應(yīng)值存在極值，即響應(yīng)面的最高點，也是等高線最小橢圓的中心點，較大的X1、X3反而使響應(yīng)值趨于減小。這可能是由于PEG相對分子質(zhì)量過大或者（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)過大反而阻止了蛋白質(zhì)分子進入體系上相PEG相，從而分離效果變差。X1、X2之間也有交互作用，但是相對于X1、X3的交互作用較弱，X2、X3之間沒有明顯的交互作用。

由Design-Expert 7.0軟件擬合二次回歸模型預(yù)測得到最佳萃取工藝為PEG相對分子質(zhì)量6 000、（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)18.29%、PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%，藻藍蛋白純度為8.6，回收率為71.40%?？紤]到實際操作和生產(chǎn)的便利，最佳工藝確定為PEG相對分子質(zhì)量6 000、（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)18%、PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%。

2.2.5雙水相萃取藻藍蛋白純度分析

2.2.5.1雙水相萃取藻藍蛋白光譜掃描分析

圖 7　雙水相萃取藻藍蛋白紫外-可見光譜掃描曲線Fig.7　UV-Vis spectra of phycocyanin extracted by aqueous two-phase system

由圖7可知，雙水相萃取可以純化粗提液，去除雜質(zhì)成分，從而得到純度較高的藻藍蛋白。

2.2.5.2雙水相萃取藻藍蛋白的SDS-PAGE

雙水相萃取得到的蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE電泳，如圖8所示，圖譜上有清晰的顏色很深的兩條帶，其他條帶較少且顏色較淺。說明經(jīng)過雙水相萃取，得到了葛仙米藻藍蛋白中雜質(zhì)含量少，純度較高。且由圖8可知，蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE得到兩條帶（條帶1和條帶2），條帶1的分子質(zhì)量在35 ku左右，條帶2的分子質(zhì)量在15 ku左右。

圖 8　雙水相萃取蛋白質(zhì)的SDS-PAGGEE圖Fig.8　SDS-PAGE analysis of phycocyanin extracted by aqueous two-phase system

2.2.5.3萃取后的藻藍蛋白的質(zhì)譜鑒定

通過質(zhì)譜儀進行分析，并與Synpcc7942_1048數(shù)據(jù)進行對比，可知條帶2的分子質(zhì)量約為15 ku，等電點為5.35。匹配肽的氨基酸序列（斜體加黑表示）見圖9a。

利用SWISS-MODEL網(wǎng)站對其蛋白結(jié)構(gòu)進行模擬，結(jié)果見圖9b，通過結(jié)構(gòu)模擬得出，此氨基酸序列可能是藻藍蛋白的α亞基。

圖 9　條帶2的氨基酸序列（a）和模擬蛋白結(jié)構(gòu)（bb）Fig.9　Amino acid sequence （a） and simulated protein structure （b） of band 2

33　結(jié) 論

本研究首先用（NH4）2SO4逐級鹽析法獲得葛仙米藻膽蛋白，然后在此基礎(chǔ)上用雙水相萃取技術(shù)對所得產(chǎn)物進一步純化，并對所得產(chǎn)物的質(zhì)量和純度進行分析。實驗發(fā)現(xiàn)，通過逐級鹽析的方法，可有效除去雜質(zhì)成分，明顯提高產(chǎn)物中藻藍蛋白純度。與先用20%后用60%鹽析方法相比，通過20% （NH4）2SO4鹽析除雜后對上清液采用30%、40%、50%、60%、70% （NH4）2SO4逐級鹽析法，可使藻藍蛋白純度提高近1倍，產(chǎn)物的純度可達1.1左右。用雙水相萃取法對逐級鹽析所得純度在1.1左右葛仙米藻膽蛋白進一步純化，并通過中心組合試驗設(shè)計，對實驗結(jié)果進行響應(yīng)面分析，從而對萃取工藝進行優(yōu)化，得到最佳工藝條件為：PEG相對分子質(zhì)量6 000、（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)18%、PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%。按照此工藝所得藻藍蛋白純度為8.6，回收率為71.40%。

通過Design-Expert 7.0軟件分析并建立了響應(yīng)值（葛仙米藻藍蛋白純度）與各因素之間的數(shù)學(xué)模型y=－696.63+ 0.02X1+37.03X2+47.65X3－5.45×10－4X1X2－2.30×10－4X1X3－1.41X2X3－7.70×10－7X12－0.41X22－0.83X32，該模型回歸顯著，且對試驗有較好的擬合度，可用于指導(dǎo)生產(chǎn)。

對雙水相萃取所得藻藍蛋白進行SDS-PAGE分析，得到清晰的兩條條帶（條帶1和條帶2），其分子質(zhì)量分別在35 ku（條帶1）和15 ku（條帶2）左右。通過質(zhì)譜分析可知，條帶2的分子質(zhì)量為15 ku左右，等電點5.35，部分肽的氨基酸序列為TPLTEAVAAADSQGR和DIGYYLR。通過SWISS-MODEL網(wǎng)站模擬蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)得出，條帶2可能是葛仙米藻藍蛋白的α亞基。

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Purifi cation of Phycocyanin from Nostoc spharoids Kützing by Stepwise Salting-out and Aqueous Two-Phase Extraction

TIAN Panpan1， CHENG Chao1，2， WANG Xingping1，2，*
（1. School of Biological Science and Technology， Hubei University for Nationalities， Enshi445000， China； 2. Key Laboratory of Biological Resources Protection and Utilization of Hubei Province， Hubei University for Nationalities， Enshi445000， China）

In this paper， stepwise salting-out combined with aqueous two-phase extraction was used to purify phycocyanin from Nostoc spharoids Kützing. The extraction process was optimized by using a three-factor quadratic regression orthogonal rotation combination design. Using the Design-Expert 7.0 software， a mathematical regression model was established indicating the effect of various extraction conditions on phycocyanin purity. The optimal extraction process was determined as follows: after discarding of the precipitate salted out by 20% （NH4）2SO4， phycobiliproteins were salted out from the supernatant by 40% and 50% （NH4）2SO4before being subjected to aqueous two-phase extraction with 10% PEG 6 000 and 18% （NH4）2SO4. The purity （the absorbance ratio at 615 nm and 280 nm） and recovery of the purified product under the optimized conditions were 8.6 and 71.40%， respectively. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis （SDS-PAGE） analysis of the product revealed two clear bands having molecular weights of about 35 and 15 ku， respectively. Mass spectrometry （MS） analysis confi rmed that the molecular weight of band 2 was about 15 ku . Its isoelectric point was 5.35 and its partial amino acid sequences were TPLTEAVAAADSQGR and DIGYYLR， respectively. Through simulation of protein structure according to the SWISS-MODEL website， we speculated that band 2 might be the α-subunit of phycocyanin from Nostoc spharoids Kützing.

Nostoc spharoids Kützing； phycocyanin； stepwise salting-out； aqueous two-phase extraction；

TS201.1

A

1002-6630（2015）24-0016-07

10.7506/spkx1002-6630-201524003

2015-06-24

國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項目（31260365）；湖北省教育廳團隊項目（T201312）

田盼盼（1989—），女，碩士研究生，研究方向為天然產(chǎn)物開發(fā)與利用。E-mail：1003939513@qq.com

汪興平（1963—），男，教授，博士，研究方向為生物資源的開發(fā)與利用。E-mail：hbmywxp@163.com