黃　濤陳　錕李小強(qiáng)譚龍益

（1.上海市第一人民醫(yī)院寶山分院，上海　200940；2.上海市華山醫(yī)院北院，上?！?01900；3.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院，上海　200032）

姜黃素對(duì)IL-1β?lián)p傷的大鼠海馬神經(jīng)元的功能性保護(hù)作用及機(jī)制

黃濤1陳錕2李小強(qiáng)3譚龍益1

（1.上海市第一人民醫(yī)院寶山分院，上海200940；2.上海市華山醫(yī)院北院，上海201900；3.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院，上海200032）

目的：探討姜黃素對(duì)IL-1β?lián)p傷的大鼠海馬神經(jīng)元的功能性保護(hù)作用及其機(jī)制。方法：應(yīng)用離體腦片記錄技術(shù)，記錄大鼠海馬CA1區(qū)的興奮性突觸后電位（EPSP），給予Schaffer側(cè)支高頻電刺激（HFS）誘發(fā)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（LTP），觀察不同藥物處理組EPSP起始斜率的變化情況。結(jié)果：與對(duì)照組相比，IL-1β和N-甲基D-天冬氨酸（NM-DA）對(duì)大鼠海馬腦片的LTP產(chǎn)生明顯的抑制作用（P＜0105）；而姜黃素可部分拮抗IL-1β和NMDA對(duì)海馬腦片LTP的抑制作用，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；IL-1β、姜黃素和NMDA對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元的基礎(chǔ)突觸傳遞無影響。結(jié)論：姜黃素對(duì)海馬神經(jīng)元具有功能性保護(hù)作用，其機(jī)制可能是作用于神經(jīng)元細(xì)胞膜上的NMDA受體，拮抗IL-1β引起神經(jīng)元功能異常。

HIV-1相關(guān)癡呆（HAD）；姜黃素；白介素1β（IL-1β）；長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（LTP）；N-甲基-D-天門冬氨酸（NMDA）

HIV感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)后可導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，其中艾滋病病毒相關(guān)認(rèn)知障礙（human immunodeficiencyvirus-associatedneurocognitive disorders，HAND）表現(xiàn)為認(rèn)知、運(yùn)動(dòng)和行為障礙。是最為顯著的并發(fā)癥之一，而高效抗逆轉(zhuǎn)錄酶治療（highly activeantiretroviral therapy，HAART）不能減輕HAD患者腦病變程度，也不能阻斷疾病的進(jìn)展，對(duì)臨床癥狀的改善也無幫助［1］。HIV-1及病毒蛋白可以直接損傷神經(jīng)元，但其激活的巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的炎癥介質(zhì)如白細(xì)胞介素1β、腫瘤壞死因子α（TNFα）、白細(xì)胞介素6等引起的免疫炎癥反應(yīng)在HAND發(fā)病過程中起著更為重要的作用。離體研究證實(shí)IL-1β不僅是星形膠質(zhì)細(xì)胞的強(qiáng)效激活劑，而且可以誘導(dǎo)產(chǎn)生TNFα、IL-6和一氧化氮（NO）［2］。整體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IL-1可以刺激膠質(zhì)細(xì)胞活化、增殖、神經(jīng)元芽生、癱痕結(jié)構(gòu)形成、新生血管產(chǎn)生、NGF合成等；［3］這一切都表明IL-1在神經(jīng)元損傷后的愈合和修復(fù)中起重要作用。白細(xì)胞介素1β毒性和腫瘤壞死因子α毒性最大，通過激活星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，持續(xù) 釋放谷氨酸濃度，神經(jīng)細(xì)胞膜上的NAMD受體激活，從而造成神經(jīng)元的中毒損傷。姜黃素為一種天然提取的酚類色素，可降低氧化應(yīng)激、抑制細(xì)胞凋亡、抑制NMDA受體介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流，進(jìn)而減輕興奮性中毒的損傷而起到細(xì)胞保護(hù)作用［4］。已有研究表明姜黃素可以可拮抗HIV包糖蛋白gp120引起的神經(jīng)毒性以及學(xué)習(xí)記憶障礙［5］，并可通過提高NMDA2B受體的表達(dá)進(jìn)而拮抗gp120所致的興奮性中毒作用。因此，我們應(yīng)用離體腦片記錄技術(shù)，觀察姜黃素對(duì)IL-1β引起的海馬腦片長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng) （longterm potentiation，LTP）抑制的影響并探討其機(jī)制。

1.材料

1.1動(dòng)物健康成年SD大鼠45只，上海西普爾-摘要司提供，合格證編號(hào)：2008001647154。

1.2主要試劑姜黃素、TL-1β和 N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA），購(gòu)于 Sigma；NaCl、CaCl2、NaH2PO4、NaHCO3、KCl、MgCl2、葡萄糖和戊巴比妥鈉購(gòu)于上?；瘜W(xué)試劑廠。

2.方法

2.1實(shí)驗(yàn)分組采用隨機(jī)數(shù)字表發(fā)將50只 SD大鼠平均分為9組（每組5只）：1）對(duì)照組:腦片僅孵育于人工腦脊液（artificial cerebrospinal fluid，ACSF）中；2）TL-1β基線組：腦片孵育于含1×10-7mol/ L的TL-1β的ACSF中，僅給予腦片基礎(chǔ)刺激；3）NMDA基線組：腦片孵育于含0.5mmol/L NMDA的ACSF中，僅給予腦片基礎(chǔ)刺激，不給于HFS；4）NMDA組：腦片孵育于含0.5mmol/L NMDA的ACSF中，孵育完成后給予HFS進(jìn)行LTP記錄；5）姜黃素基線組：腦片孵育于含1μmol/L姜黃素的ACSF中，孵育完成后僅給予腦片基礎(chǔ)刺激；6）姜黃素組：腦片孵育于含濃度為1μmol/L姜黃素的ACSF中，孵育完成后進(jìn)行LTP記錄；7）IL-1β組：腦片孵育于含1×10-7mol/L的ACSF中，孵育完成后進(jìn)行LTP記錄；8）IL-1β失活組：先將從母液中取出的IL-1β放在恒溫水浴箱中，70℃水浴30分鐘，使IL-1β失活。再稀釋于ACSF中使其終濃度為1×10-7mol/L，腦片孵育完成后進(jìn)行LTP記錄；9）姜黃素加IL-1β組：腦片孵育于含1μmol/L姜黃素和含1×10-7mol/ LIL-1β的ACSF中，孵育完成后進(jìn)行LTP記錄；10）姜黃素加NMDA組：腦片孵育于含1μmol/L姜黃素和含0.5mmol/L NMDA的ACSF中，給予HFS。

2.2腦片的制備 SD大鼠用戊巴比妥鈉麻醉后快速斷頭取腦，腦組織放入冰凍4℃通氧人工腦脊液環(huán)境中，分離海馬并用組織切片機(jī)切成橫面400μm厚的切片，在潮濕加氧的槽中室溫保存1h后，根據(jù)各組要求在ACSF中加入相應(yīng)的藥物繼續(xù)孵育30min。最后腦片轉(zhuǎn)入記錄槽。在記錄槽中單個(gè)海馬腦片完全浸入在以 2mL/min恒定流速，持續(xù)灌注的ACSF液中。ACSF（mmol/L）:NaCl 124.0，KCl 3.0，MgCl22.0，CaCl2，NaH2PO41.25，NaHCO326.0，glucose 10.0，ACSF用95%O2和CO2平衡。pH值調(diào)到7.3-7.4。

2.3電生理記錄使用絕緣的雙極鎢電極作為刺激電極，每隔30秒給予恒定電流刺激（50-400μA）Schaffer側(cè)支，刺激強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間以能產(chǎn)生 30%-40%最大反應(yīng)為宜，此為基礎(chǔ)刺激。記錄電極是充以ACSF中的玻璃微電極，尖端直徑 1-3μm，中的ACSF阻抗為2-5MΩ。將一記錄電極插入CA1區(qū)錐體細(xì)胞樹突層 100-200μm，記錄的電活動(dòng)是給予電刺激后 CA1區(qū)錐體細(xì)胞樹突層的興奮性突觸后電位 （EPSP），經(jīng)放大器放大后，通過數(shù)模轉(zhuǎn)換器在2.5KHz頻率下數(shù)字化電信號(hào)，并貯存在電腦上。

2.4LTP的誘發(fā) 30min基礎(chǔ)刺激后，用高頻電刺激（HFS）Schaffer側(cè)支軸突，在海馬CA1區(qū)記錄，共進(jìn)行30min細(xì)胞外記錄。頻率100Hz持續(xù)1s串間隔20s，共兩串，在海馬CA1區(qū)記錄EPSP的變化，進(jìn)行60min記錄。其中第45minEPSP起始斜率的值代表LTP的誘發(fā)和變化情況。若EPSP起始斜率增幅在20%以上，并維持30min以上為L(zhǎng)TP成功誘發(fā)。3個(gè)基線組海馬腦片首先給予基礎(chǔ)刺激30min然后用相應(yīng)藥物灌注60min，同時(shí)繼續(xù)給予基礎(chǔ)刺激，不給予這3組高頻電刺激。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

給于腦片HFS后測(cè)量第45min EPSP的起始斜率，基礎(chǔ)水平的百分?jǐn)?shù)形式表示LTP的幅度。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（x±sE）表示。用Original7.0和pClamp9.0軟件分析EPSP，計(jì)量資料用單因素方差分析（ANOVA）和t檢驗(yàn)。P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4.結(jié)果

1.對(duì)照組大鼠海馬腦片CA1區(qū)LTP的誘發(fā)

對(duì)大鼠海馬腦片進(jìn)行基礎(chǔ)刺激30分鐘并記錄EPSP形狀和幅度。然后然后給與HFS，以刺激腦片EPSP起始斜率為 100%計(jì)算，刺激后EPSP平均增大幅度為（138.21±2.69），見圖A。

2.IL-1β1、姜黃素和NMDA對(duì)海馬腦片CA1區(qū)基礎(chǔ)突觸傳遞的影響

分別給予IL-1β基線組、姜黃素基線組和NMDA基線組海馬腦片30min基礎(chǔ)刺激，記錄海馬腦片CA1區(qū)的EPSP。30min后給與HFS，EPSP起始斜率無明顯變化，EPSP呈一平直線（圖B-D）。姜黃素基線組和NMDA基線組EPSP起始斜率無明顯變化。結(jié)果顯示，IL-1β、姜黃素和NMDA對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元的基礎(chǔ)突觸傳遞無影響。

3.姜黃素對(duì)IL-1β引起的海馬腦片CA1區(qū)LTP抑制作用的影響

將濃度為質(zhì)量濃度為1×10-7mol/L IL-1β與海馬腦片共同孵育后，記錄海馬CA1區(qū)的LTP。IL-1β組海馬腦片給予HFS后EPSP起始斜率增大至（134.08±3.04）%，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P＜0.05，圖E）。失活的IL-1β與海馬腦片共同孵育后，LTP平均斜率為（139.37±2.69）%，與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖F）。用姜黃素和IL-1β共同孵育海馬腦片后，海馬腦片的LTP部分恢復(fù)，EPSP的起始斜率為（140.17±2.87）%，與IL-1β組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05，圖H）。結(jié)果提示，姜黃素可部分拮抗IL-1β造成的大鼠海馬LTP抑制，保護(hù)海馬神經(jīng)元的正常功能。

各組大鼠海馬腦片CA1區(qū)LTP記錄

4.姜黃素對(duì)NMDA引起的海馬腦片CA1區(qū)LTP抑制作用的影響

將濃度為0.5mmol/L的NMDA與海馬腦片共同孵育后，記錄海馬CA1區(qū)的LTP。給予腦片HFS后，LTP平均斜率為（109.01±2.18）%，與對(duì)照組相比有顯著性差異（（P＜0.05，圖I）。用濃度為1μmol/L姜黃素與0.5mmol/L NMDA共同孵育海馬腦片后，LTP出現(xiàn)了部分恢復(fù)，EPSP的起始斜率恢復(fù)到（135.08±3.33）%，與NMDA組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），提示姜黃素可部分拮抗NMDA引起的LTP抑制（圖J）。

A：對(duì)照組大鼠EPSP起始斜率；B：IL-1β基線組大鼠EPSP起始斜率；C：NMDA基線組大鼠的EPSP起始斜率；D：姜黃素基線組大鼠EPSP起始斜率。E：IL-1β組大鼠EPSP起始斜率；F：IL-1β失活組大鼠EPSP起始斜率；G：姜黃素失活組大鼠EPSP起始斜率；H：IL-1β+姜黃素組大鼠EPSP起始斜率；I：NMDA組大鼠EPSP起始斜率；J：NMDA+姜黃素基線組大鼠EPSP起始斜率。圖的基線斜率為100。

HIV感染或被gp120激活的小膠質(zhì)細(xì)胞可釋放炎癥趨化因子。如TNF-α和IL-1β等。這些細(xì)胞因子可刺激單核吞噬細(xì)胞釋放L-半胱氨酸，L-半胱氨酸可激活NMDAR并引起神經(jīng)元凋亡。HAD患者腦內(nèi)會(huì)有IL-1β及其受體表達(dá)的升高。目的在于研究HAD中的神經(jīng)毒素類之間的相互作用的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IL-1β可促進(jìn)神經(jīng)元凋亡并可被IL-1β阻滯劑阻滯。而對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)的病變來說，IL-1β的升高也參與了CNS神經(jīng)元的病理進(jìn)程。研究表明神經(jīng)系統(tǒng)病變中，IL-1β水平的升高主要是激活神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞如神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的結(jié)果。因而參與了由急、慢性炎癥反應(yīng)參與的神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病過程。研究發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)多個(gè)部位都有IL-1β及其受體的表達(dá)：海馬，紋狀體，下丘腦，大腦皮質(zhì)以及腦干，且它們的表達(dá)因發(fā)育狀況而有所變化。目前的表明研究：神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞激活所分泌的細(xì)胞因子可誘導(dǎo)合成一定量的急性期蛋白，如淀粉蛋白A。這些蛋白可進(jìn)一步影響神經(jīng)元的代謝活性，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和凋亡；此外合成的急性期蛋白本身又可促進(jìn)IL-1，TNF和在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)。有研究表明IL-1，TNF的神經(jīng)毒性主要通過過度刺激NMDA受體，使得Ca2+通道開放，過多Ca2+流入細(xì)胞內(nèi)造成神經(jīng)元損傷。臨床研究表明Alzheimer癡呆和血管性癡呆患者的外周血IL-1β的水平表達(dá)增加。［6-7］

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，姜黃素在神經(jīng)退性性疾病的治療當(dāng)中，可發(fā)揮重要的作用。姜黃素可抑制HIV慢性感染的HIV-1 LTP（long terminal repeat，LTR）活性和病毒復(fù)制，提示姜黃素對(duì)處于前病毒狀態(tài)的病毒有作用，姜黃素可能直接或間接地作用于影響HIV-1 LTR活性調(diào)節(jié)因子。另外姜黃素可能通過抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-的活化在其抗HIV復(fù)制的過程中具有重要意義。推測(cè)姜黃素用于感染患者的治療，可增加機(jī)體的體液免疫功能，防止繼發(fā)性感染。近來的研究表明姜黃素還可以抑制HIV-1復(fù)制所需的蛋白酶和整合酶進(jìn)而抑制病毒的復(fù)制。［8］

長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)是突觸部位傳遞效能增強(qiáng)的一種現(xiàn)象，是突觸可塑性的表現(xiàn)型式，也是學(xué)習(xí)和記憶的細(xì)胞電生理指標(biāo)［9］。本研究中大鼠海馬腦片孵育IL-1β后，腦片的LTP發(fā)生了明顯抑制，說明IL-1β對(duì)海馬神經(jīng)元功能是產(chǎn)生了抑制作用。而用姜黃素和IL-1β共同孵育海馬腦片后，海馬腦片的LTP部分恢復(fù)，因此可知，姜黃素可以部分拮抗IL-1β造成的大鼠海馬LTP抑制，保護(hù)海馬的正常功能。本研究把海馬腦片孵育于濃度0.5mmol/L的NMDA后，腦片的LTP發(fā)生了明顯抑制，而當(dāng)姜黃素和NMDA共同孵育海馬腦片后，海馬腦片的LTP也出現(xiàn)了部分恢復(fù)。說明毒性劑量的NMDA引起NMDA受體的過度激活，造成海馬神經(jīng)元功能障礙，出現(xiàn)LTP抑制，姜黃素可部分拮抗NMDA受體激活引起的LTP抑制。［8］［10］因此姜黃素對(duì)海馬神經(jīng)元具有功能性保護(hù)作用，其機(jī)制可能是作用于神經(jīng)元細(xì)胞膜上的NMDA受體，拮抗IL-1β引起的神經(jīng)元功能異常。

［1］ELLIS R，LANGFOR D D，MASLIAH E.HIV and antiretroviral therapyin the brain:neuronal injury and repair［J］. NatRevNeurosc，i 2007，8（1）:33-44.

［2］LeeSC，eksonD，LiuW，etal.Induetion of nitriC oxide synthase ACtivity in human astroeytes by IL-1β and IFN-［J］.J Neuroimmunol，1993，46:19-24.

［3］Rothwell NJ，Relton JK.Involvement of Cytokines in a Cute neurodegeneration in the CNS［J］.Neurosei Biobehavior Rev，1993，17:217-227.

［4］AHUJA K D K，KUNDE D A，BALLM J，eta.l Effects of capsaicin，dihydrocapsaicin，and curcumin on copperinduced oxidation of human serum lipids［J］.J Agric Foos Chem，2006，54（17）:6436-6439.

［5］黃濤，董軍，陸大祥，等.CREB在姜黃素改善gp120所致大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙中的作用［J］.暨南大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2008，29（4）:362-36.

［6］Kindt S，Vanden Berghe P，etal.Prolonged IL-1beta exposure altersneurotransmitter andelectricallyinducedCa2+ responses in the myenteric plexus［J］.Neurogastroenterol Motil 2010，（22）:321-e85.

［7］GougeonPY，LourenssenS，eta.ThePro-Inflammatory Cytokines IL-1β and TNFα Are Neurotrophic for Enteric Neurons［J］.J Neurosci.2013，33（8）:3339-51.

［8］Guo L，Xing Y，Pan R，eta.Curcumin protects microglia and primary rat cortical neurons against HIV-1 gp120-mediated inflammation and apoptosis［J］.J Nat Prod.2013，76（6）: 1105-12.

［9］梅鎮(zhèn)彤.學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)的神經(jīng)機(jī)制［J］.生理科學(xué)進(jìn)展，1996，27（3）：183-188.

［10］QIU Z，SWEENEY D D，NETZEBAND J G，ETAL.Chronic interleukin-6α lters NMDA recepter-mediatedmem brane responses and enhances neurotoxicity indevel-oping CNS neurons［J］.J Neurosci，1998，18（24）:10445-10456.

（責(zé)任編輯：夏萬夫）

黃濤（1974-），男，安徽銅陵人，上海市第一人民醫(yī)院寶山分院主任助理，主管檢驗(yàn)師，碩士，研究方向：臨床檢驗(yàn)。

R961

A

1671-752X（2015）01-0031-04

2014-12-11