周 帆 朱頤申 鄒巧根 韋 萍 (南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，南京 210009)

黑色素瘤是惡性程度最高的皮膚腫瘤，具有高復(fù)發(fā)率和高死亡率的特點［1］，其5 年生存率低于10%，屬于最難有效治療的腫瘤之一［2］。由于黑色素瘤易發(fā)生轉(zhuǎn)移，主要治療方法為及早局部手術(shù)切除根治、晚期化療和放療等，但結(jié)果均不理想。近年來，隨著分子生物學(xué)及基因工程技術(shù)的發(fā)展，利用多肽疫苗治療黑色素瘤的方法受到廣泛關(guān)注［3-6］。多肽疫苗通過啟動人體自身的免疫功能對抗腫瘤細(xì)胞，不會破壞人體其他健康的生理組織，安全性高。gp100:209-217 (210 甲 硫 氨 酸，210Methionine，210M)是一種臨床開發(fā)中的治療性合成多肽疫苗，在針對黑色素瘤的臨床試驗中顯示出積極功效，本文現(xiàn)對該疫苗綜述如下。

1 gp100:209-217(210M)疫苗的免疫機制

多肽疫苗是按照病原體抗原基因中已知或預(yù)測某段抗原表位的氨基酸序列，通過體外化學(xué)合成技術(shù)制備而得的多肽片段。與傳統(tǒng)疫苗相比，多肽疫苗可以避免因疫苗毒力回升或滅活不全引起的安全問題，同時可以通過化學(xué)合成法高效大量制備。

gp100:209-217 是黑色素細(xì)胞蛋白第209 至217 位的多肽片段。黑色素瘤患者接種該多肽疫苗后，能夠刺激并調(diào)節(jié)人體內(nèi)白細(xì)胞抗原A2(Human leukocyte antigen A2，HLA-A2)限制性細(xì)胞毒素CD8+T 淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生;T 淋巴細(xì)胞能夠特異性識別表面帶有g(shù)p100 蛋白抗原的黑色素瘤細(xì)胞，并分泌能穿透黑色素瘤細(xì)胞的酶，溶解gp100:209-217多肽針對的靶向細(xì)胞及黑色素瘤細(xì)胞株，使黑色素瘤細(xì)胞凋亡［7］。gp100:209-217(210M)，也稱為g209-2M，是將gp100:209-217 位點210 處的蘇氨酸置換為甲硫氨酸而制備得到的一種的治療黑色素瘤的多肽疫苗［8］。與 gp100:209-217疫苗相比，gp100:209-217(210M)疫苗提高了與HLA-A2 的結(jié)合力，對T 淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答特異性及組織相容性復(fù)合物(Major histocompatibility complex，MHC)分子的親和力更強，對黑色素瘤患者的外周血單個核細(xì)胞體外的致敏性(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)效果更好，對惡性黑色素瘤細(xì)胞具有更強的免疫活性［9，10］。

2 gp100:209-217(210M)疫苗治療惡性黑色素瘤的研究現(xiàn)狀

2.1 體外試驗 體外致敏性實驗中，將gp100:209-217(210M)疫苗與黑色素瘤患者的PBMCs 直接接觸，以酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme linked immuno-sorbent assay，ELISA)測定PBMCs 釋放γ-干擾素(Interferon-γ，IFN-γ)的生成量，以此作為評價疫苗免疫治療黑色素瘤的性能指標(biāo)(IFN-γ 主要由活化的T淋巴細(xì)胞分泌而來，輔助T 淋巴細(xì)胞識別腫瘤)。結(jié)果表明，未經(jīng)疫苗免疫的PBMCs，不產(chǎn)生特異性活性;經(jīng)gp100:209-217(210M)疫苗免疫的PBMCs，產(chǎn)生了針對HLA-A2+黑色素瘤的特異性活性，且具有高度的特異性［11］。

Liu 等［12］研究了gp100:209-217(210M)疫苗對體外誘導(dǎo)黑色素瘤患者PBMCs 中T 淋巴細(xì)胞增殖和表型的影響，聯(lián)合使用疫苗和佐劑白介素-2(Interleukin-2，IL-2)、白介素-7(IL-7)、白介素-15(IL-15)與黑色素瘤患者體中的PBMCs 接觸。結(jié)果表明:疫苗與IL-7 聯(lián)用不能顯著誘導(dǎo)T 淋巴細(xì)胞的增殖、表型;疫苗與IL-2、IL-5 均可顯著促進T 淋巴細(xì)胞的增殖和表型;聯(lián)合使用IL-2、IL-5 和IL-7，其對T 淋巴細(xì)胞增殖和表型的刺激與單獨使用IL-2 類似，從而說明聯(lián)合使用gp100:209-217(210M)疫苗與IL-2，可有效提高對黑色素瘤的抗原能力，使黑色素瘤退化［13，14］。

2.2 動物試驗 鑒于小鼠gp100:209-217 表位序列(ITDQVPFSV)與人類gp100:209-217 表位序列完全相同，Irvine 等［15］以HLA-A0201/H-2 Kb(A2/Kb)轉(zhuǎn)基因小鼠為模型，將編碼gp100:209-217(210M)的重組病毒感染機體，研究了其誘導(dǎo)反自CD8+T淋巴細(xì)胞對抑制腫瘤抗原gp100 活性的影響。結(jié)果表明:經(jīng)210 位Met 錨定修飾后的免疫原促進了反自CD8+T 淋巴細(xì)胞與腫瘤靶細(xì)胞的脈沖結(jié)合活性，該反自CD8+T 淋巴細(xì)胞與野生型gp100:209-217 具有特異性，能夠特異性識別小鼠黑色素瘤A2/Kb 表面的天然抗原表位(B16)，從而提高了重組病毒免疫原的抗原能力。

Tine 等［16］以HLA-A2.1 轉(zhuǎn)基因HHD 小鼠為模型，研究了gp100:209-217(210M)疫苗對誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T lymphoclyte，CTL)的影響。CTL 是細(xì)胞在機體介導(dǎo)免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞之一，主要是產(chǎn)生對靶細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)，也分泌細(xì)胞因子參與免疫調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明:gp100:209-217(210M)疫苗在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生了強烈的CTLs反應(yīng)。

2.3 臨床試驗 Ⅰ期臨床試驗16 位惡性黑色素瘤患者(9 位男性，7 位女性，平均年齡49 歲)靜脈注射gp100:209-217(210M)疫苗治療黑色素瘤?；颊呙扛? 周注射一次疫苗，且劑量逐步上升。以毒性、臨床和免疫反應(yīng)率為首要指標(biāo)，結(jié)果僅2 位患者出現(xiàn)了短暫的毒性反應(yīng)，表明該多肽疫苗免疫治療毒性反應(yīng)低。隨機分配10 位患者接受一周期治療，6位患者接受兩周期治療。ELISA 分析結(jié)果顯示:5位患者出現(xiàn)了針對gp100 的臨床反應(yīng)，其中4 位患者的臨床情況穩(wěn)定或出現(xiàn)腫瘤消退，從而表明該疫苗在黑色素瘤臨床治療方面發(fā)揮了積極作用［17］。

Powell 等［18］對5 位惡性黑色素瘤患者接種gp100:209-217(210M)，免疫佐劑為Montanide ISA 51。體外縱向PBMCs 分析顯示多肽特異性CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生了從早期效應(yīng)到效應(yīng)記憶性表型的轉(zhuǎn)變。一年治療期后，患者體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)中的gp100:209-217(210M)特異性CD8+T 細(xì)胞從4.8% 上升至38.1%，并伴隨出現(xiàn)了記憶性T 淋巴細(xì)胞，從而說明了注射gp100:209-217(210M)多肽疫苗對黑色素瘤具有免疫效應(yīng)。

Tarhini 等［19］研究了聯(lián)合使用gp100:209-217(210M)、MART-1:26-35 (27L)、酪氨酸酶:368-376(370D)以及佐劑PF-3512676 和GM-CSF 在治療惡性黑色素瘤的安全性和免疫原性。結(jié)果表明:其安全性和免疫原性都較好。Ⅱ期臨床試驗［11］31 例轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者服用高劑量IL-2 后，接種gp100:209-217(210M)疫苗及Montanide ISA-51(不完全弗氏佐劑)，其中13 例出現(xiàn)了臨床反應(yīng)(42%)，反應(yīng)率顯著高于單獨使用IL-2 的反應(yīng)率(15%～20%)［20］，為疫苗與IL-2 聯(lián)用治療黑色素瘤提供了依據(jù)［21-23］。

Schwartzentruber 等［24］對185 名患者進行了隨機Ⅲ期臨床試驗。參與者為Ⅳ期或局灶晚期黑色素瘤、表達HLA-A 0201、無腦部轉(zhuǎn)移、適合高劑量IL-2治療的患者?；颊弑浑S機分為IL-2 單藥治療組(每劑量為720 000 U/kg)和聯(lián)合治療組，聯(lián)合組用藥方法為gp100:209-217(210M)加上每周期不完全弗氏佐劑(Montanide ISA-51)，然后使用IL-2。首要指標(biāo)為臨床反應(yīng)率，次要指標(biāo)包括毒性反應(yīng)和無進展生存期。結(jié)果表明:聯(lián)合治療組的總體反應(yīng)率比單藥治療組高(分別為16、6%，P=0.03)，無進展生存期較長(分別為2.2、1.6 月，P=0.008)，且平均總生存期也較長(分別為17.8、11.1 月，P=0.06)。因此，對于惡性黑色素瘤患者而言，使用疫苗和IL-2聯(lián)合治療比單獨使用IL-2 治療有更高的反應(yīng)率和更長的無進展生存期。

3 提高gp100:209-217(210M)疫苗免疫活性的途徑

腫瘤抗原往往不是單一表達，而是相關(guān)抗原的共同表達［25-27］。通常單一多肽抗原表位僅對一部分患者有效，原因在于人類中存在一些被通用MHCⅠ等位基因限制的多肽抗原表位(如HLA-A2，大約存在于40%的人類中)。為了保證疫苗在患者體中廣泛發(fā)揮作用，其他CTL 抗原表位也必須被識別。因此聯(lián)合采用2 種或多種抗原多肽可有效提高多肽疫苗對腫瘤細(xì)胞的殺傷力及其抗腫瘤逃逸的效應(yīng)。

Levy 等［28］根據(jù)多表位多肽疫苗免疫治療黑色素瘤(Multiepitope polypeptide for melanoma，MEPmel)的策略，設(shè)計了包含三個重復(fù)單元的四抗原表位［gp100:209-217(210M);gp100:280-288(288 纈氨酸，288valine，288V);Mart1:26-35(27 亮氨酸，27leucine，27L);酪氨酸酶:368-376(370 天冬氨酸，370aspartic acid，370D)］。多種多肽通過包含蛋白酶識別的基因序列相互關(guān)聯(lián)，提高了蛋白解離和抗原表達的能力。結(jié)果表明:當(dāng)用MEP-mel-轉(zhuǎn)染的樹突狀細(xì)胞(DC)刺激多肽特異性T 淋巴細(xì)胞，會表達生成細(xì)胞因子IFN-γ。同時經(jīng)MEP-mel-轉(zhuǎn)染的DC表達的多肽具有蛋白酶依賴性，且比外源釋放原生多肽的表達更持久。DC 負(fù)載MEP-mel 蛋白誘導(dǎo)弱交叉表達。因此，多表位多肽疫苗是提高gp100:209-217(210M)免疫療法的策略之一，同時多種抗原多肽的聯(lián)合使用擴大了其免疫原性，可應(yīng)用于其他類型腫瘤的治療［29，30］。

4 展望

綜上所述，gp100:209-217(210M)多肽疫苗能夠特異性主動免疫治療黑色素瘤，其臨床研究已取得一定進展。與其他類型的疫苗相比，gp100:209-217(210M)多肽疫苗因其合成簡單、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、無毒力回升、無致癌性等優(yōu)點，應(yīng)用前景更為廣泛［31］。隨著對gp100:207-219(210M)多肽疫苗的進一步深入研究，不斷優(yōu)化多肽疫苗的設(shè)計方法，通過加強腫瘤微環(huán)境的免疫能力控制黑色素瘤細(xì)胞，如聯(lián)合使用不同靶點的抗原多肽、結(jié)合適當(dāng)載體、配伍新型佐劑、利用DC 負(fù)載多肽疫苗等方法，進一步改善其免疫原性，最大限度激發(fā)疫苗在抗腫瘤的免疫反應(yīng)。

［1］Zhao F，Dou J，He XF，et al.Enhancing therapy of melanoma efficacy via tumor cell vaccine expressing GPI-anchored IL-21 and secreting GM-CSF in mouse model［J］.Vaccine，2010，28(16):2486-2852.

［2］He X，Wang J，Zhao F，et al.ESAT-6-gpi DNA vaccine augment the specific anti-tumor efficacy induced by the tumor vaccine B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21 in mice［J］.Scand J Immunol，2013，78(1):69-78.

［3］Benlalam H，Linard B，Guilloux Y，et al.Identification of five new HLA-B* 3501-restricted epitopes derived from common melanoma-associated antigens，spontaneously recognized by tumor-infiltrating lymphocytes［J］.J Immunol，2003，171(11):6283-6289.

［4］Hartmann TB，Bazhin AV，Schadendorf D，et al.SEREX identification of new tumor antigens linked to melanoma-associated retinopathy［J］.Int J Cancer，2005，114(1):88-93.

［5］李 昂，劉榮軍，林 怡，等.人黑色素腫瘤相關(guān)抗原gp100 質(zhì)粒誘導(dǎo)特異性抗小鼠黑色素瘤的免疫保護效應(yīng)［J］.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2006，26(4):334-338.

［6］張正華，劉維達.黑素瘤疫苗的研究進展［J］.國外醫(yī)學(xué):皮膚性病學(xué)分冊，2003，29(4):253-256.

［7］黃 進.gp100:209-217［J］.中國處方藥，2009，(87):17.

［8］Dudley ME，Ngo LT，Westwood J，et al.T-cell clones from melanoma patients immunized against an anchor-modified gp100 peptide display discordant effector phenotypes［J］.Cancer J，2000，6(2):69-77.

［9］Thomas FG，Hodi FS.Targeted therapeutics in Melanoma［M］.New York:Springer，2012:207-232 .

［10］Linse KD.Category Archives:Genetics［DB/OL］.http://blogbiosyn.com/category/genetics/，2013.

［11］Rosenberg SA，Yang JC，Schwartzentruber DJ，et al.Immunologic and therapeutic evaluation of a synthetic peptide vaccine for the treatment of patients with metastatic melanoma［J］.Nat Med，1998，4(3):321.

［12］Liu S，Riley J，Rosenberg S，et al.Comparison of common［gamma］-chain cytokines，interleukin-2，interleukin-7，and interleukin-15 for the In vitro generation of human tumor-reactive T lymphocytes for adoptive cell transfer therapy［J］.J Immunother，2006，29(3):284.

［13］Velho TR.Metastatic melanoma-a review of current and future drugs［J］.Drugs in Context，2012:1-17.

［14］Smith FO，Downey SG，Klapper JA，et al.Treatment of metastatic melanoma using interleukin-2 alone or in conjunction with vaccines［J］.Clin Cancer Res，2008，14(17):5610-5618.

［15］Irvine KR，Parkhurst MR，Shulman EP，et al.Recombinant Virus vaccination against "self" antigens using anchor-fixed immunogens［J］.Cancer Res，1999，59(11):2536.

［16］Tine JA，F(xiàn)irat H，Payne A，et al.Enhanced multiepitope-based vaccines elicit CD8+cytotoxic T cells against both immunodominant and cryptic epitopes［J］.Vaccine，2005，23 (8):1085-1091.

［17］Lau R，Wang F，Jeffery G，et al.Phase I trial of intravenous peptide-pulsed dendritic cells in patients with metastatic melanoma［J］.J Immunother，2001，24(1):66-78.

［18］Powell Jr DJ，Rosenberg SA.Phenotypic and functional maturation of tumor antigen-reactive CD8+T lymphocytes in patients undergoing multiple course peptide vaccination［J］.J Immunother，2004，27(1):36.

［19］Tarhini AA，Leng S，Moschos SJ，et al.Safety and immunogenicity of vaccination with MART-1 (26-35，27L)，gp100 (209-217，210M)，and tyrosinase (368-376，370D)in adjuvant with PF-3512676 and GM-CSF in metastatic melanoma［J］.J Immunother，2012，35(4):359-366.

［20］Sosman JA，Carrillo C，Urba WJ，et al.Three phase Ⅱcytokine working group trials of gp100 (210M)peptide plus high-dose interleukin-2 in patients with HLA-A2-positive advanced melanoma［J］.J Clin Oncol，2008，26(14):2292-2298.

［21］Eggermont AMM，Schadendorf D.Melanoma and Immunotherapy［J］.Hematol Oncol Clin N Am，2009，23(3):547-564.

［22］White RL，Amin A.Cancer immunotherapy［J］.Surg Oncol Clin N Am，2011，20(3):531-554.

［23］Homsi J，Grimm JC，Hwu P.Immunotherapy of melanoma:an update［J］.Surg Oncol Clin N Am，2011，20(1):145-163.

［24］Schwartzentruber DJ，Lawson DH，Richards JM，et al.gp100 peptide vaccine and interleukin-2 in patients with advanced melanoma［J］.New Engl J Med，2011，364(22):2119-2127.

［25］劉 杰，王清明，張云林，等.肽疫苗的研究進展［J］.生物技術(shù)通訊，2004，15(4):405-408.

［26］Eisenberg G，Machlenkin A，F(xiàn)rankenburg S，et al.Transcutaneous immunization with hydrophilic recombinant gp100 protein induces antigen-specific cellular immune response［J］.Cell Immunol，2010，266(1):98-103.

［27］Turcotte S，Rosenberg SA.Immunotherapy for metastatic solid cancers［J］.Adv Surg，2011，45(1):341-360.

［28］Levy A，Pitcovski J，F(xiàn)rankenburg S，et al.A melanoma multiepitope polypeptide induces specific CD8+T-cell response［J］.Cell Immunol，2007，250(1-2):24-30.

［29］邱 鄭，胡加亮，王 旻.腫瘤多肽疫苗的臨床應(yīng)用［J］.藥物生物技術(shù)，2010(6):538-544.

［30］Lutzky J.New therapeutic options in the medical management of advanced melanoma［J］.Semin Cutan Med Surg，2010，29(4):249-257.

［31］朱頤申，張 霓.多肽疫苗研究進展［J］.中國疫苗和免疫，2013，19(1):69-74.