鄭梅竹等

摘要：為了探討白芍（Radix paeoniae Alba）提取物對(duì)MPTP（1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶）致帕金森病小鼠的保護(hù)作用，試驗(yàn)采用不同劑量的白芍提取物（0.75、1.50、3.00 g生藥/kg體重）灌喂小鼠，每日一次，連續(xù)15 d。第八天起所有小鼠每日腹腔注射MPTP 1次共8次，建立小鼠帕金森?。≒arkinsons disease，PD）模型，通過(guò)檢測(cè)小鼠的自主活動(dòng)、爬桿能力、滾軸能力及懸掛能力等行為學(xué)表現(xiàn)，同時(shí)檢測(cè)小鼠腦黑質(zhì)中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）活性及丙二醛（MDA）水平的變化來(lái)評(píng)價(jià)白芍提取物對(duì)PD小鼠的影響。結(jié)果顯示，經(jīng)MPTP誘導(dǎo)的小鼠，其自主活動(dòng)次數(shù)顯著減少、爬桿時(shí)間差值顯著增加、附著能力評(píng)分顯著降低；經(jīng)高劑量白芍提取物預(yù)處理后能顯著（P<0.05）增加小鼠在測(cè)試時(shí)間內(nèi)的自發(fā)站立次數(shù)，顯著（P<0.05）縮短爬桿時(shí)間差值，顯著（P<0.05）提高附著能力分值，極顯著（P<0.01）提高小鼠腦內(nèi)SOD、GSH-Px水平，MDA水平極顯著（P<0.01）。

關(guān)鍵詞：白芍（Radix paeoniae Alba）提取物；帕金森?。≒D）；小鼠；氧化應(yīng)激

中圖分類(lèi)號(hào)：R742.5；R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）12-2960-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.12.039

Neuroprotective Effect and Mechanism of Radix paeoniae alba Extracts Against MPTP-induced Mouse Model of Parkinsons Disease

ZHENG Mei-zhua，F(xiàn)AN Ya-junb，SHI Dong-fanga，ZHANG Yu-chia，LIU Chun-minga，WANG Yue-qia，REN Jun-qia

（Changchun Normal University，a.The Central Laboratory；b.The College of life Science， Changchun 130032， China）

Abstract：For studying the neuroprotective effect of Radix paeoniae Alba extracts against MPTP-induced mouse model of Parkinsons disease （PD） and its mechanism， 60 mice were randomly indiveded to 6 groups， such as nomal control group， model conrol group， positive medicine control group， and three trial groups which treated with Radix Paeoniae Alba extracts of different dots （0.75、1.50、3.00 g/kg，i.g.） for 15 days. At the 8th day， the mice except of the nomal control group were started intraperitoneal injection with MPTP（3.00 g/kg，i.p.） for eight days and the subsequent behavioral testing of mice， such as voluntory movement， rotarod test， pole test and traction test was assessed. SOD、GSH-Px and MDA levels in mouse striatum nigra were measured using analysis Kit. The results showed that the MPTP-induced mice presented typical Parkinsons disease such as voluntory movement significantly decreased， the time difference of climbing pole， significantly increased and the adherence ability assessment significantly decreased， etc. But after pretreated Radix paeoniae Alba extracts， the abnormal behavior including the decrease in spontaneous motor activity and the prolongation in the pole test latent period induced by MPTP were all significantly improved（P<0.05）.In addition， Radix Paeoniae Alba extracts significantly inhibited the oxidative stress level， such as decreased the level of MDA （P<0.01） and increased the antioxidant enzyme GSH-Px（P<0.05） and SOD activity（P<0.05）.

Key words：Radix paeoniae Alba；Parkinsons disease （PD）；mouse；oxidative stress

開(kāi)發(fā)新型、高效、低毒副作用的帕金森?。≒arkinsons disease，PD）藥物始終是精神藥理學(xué)的一個(gè)重要研究課題，因此從天然藥物中尋找高效抗PD制劑成為近幾年一個(gè)新的研究方向。

白芍（Radix paeoniae Alba）為毛茛科植物芍藥（Paeonia lactiflora Pall） 的干燥根，在中國(guó)北方地區(qū)分布廣泛。有養(yǎng)血、益氣、止痹、通絡(luò)的作用，是風(fēng)濕類(lèi)疾病、自身免疫病、肝炎及肝硬化治療中重要的組方之一，受到醫(yī)藥學(xué)界的廣泛重視。現(xiàn)代藥理學(xué)表明白芍提取物可改善東莨菪堿所致小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙，并能增強(qiáng)大鼠的學(xué)習(xí)能力。研究發(fā)現(xiàn)，芍藥總苷對(duì)大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞缺氧、缺糖、氧自由基及NO神經(jīng)毒性等損傷有顯著保護(hù)作用[1]。

PD的發(fā)病機(jī)制機(jī)理有環(huán)境和基因兩方面的因素，臨床研究表明，PD患者處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，氧化應(yīng)激反應(yīng)是PD的發(fā)病機(jī)制之一[2]，在各種神經(jīng)變性機(jī)制中，氧化應(yīng)激占據(jù)主導(dǎo)地位，并對(duì)多巴胺神經(jīng)元死亡起重要作用[3]。

因此，本研究采用經(jīng)典PD動(dòng)物模型對(duì)白芍提取物的抗PD作用進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)，以探討白芍提取物對(duì)MPTP（1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶）致PD小鼠腦組織氧化損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品和試劑 白芍提取物，由長(zhǎng)春師范大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室提供，提取率為3.84%，其中芍藥苷、沒(méi)食水?；炙庈蘸捅郊柞；炙庈蘸糠謩e為21%、14%、26%；美多芭（多巴絲肼片），上海羅氏制藥有限公司，批號(hào)SH1484；MPTP，上海德默醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)20131215；單胺氧化酶測(cè)定試劑盒、乙酰膽堿酯酶檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.1.2 儀器 YLS-4C型轉(zhuǎn)棒式疲勞儀、YLS-3TB型跳臺(tái)記錄儀，濟(jì)南益延科技開(kāi)發(fā)有限公司；ZZ-6型小動(dòng)物自主活動(dòng)儀，成都泰盟軟件有限公司；EXL 808型酶標(biāo)儀，BioTek instruments Inc。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 雄性ICR小鼠，體重18～22 g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司， 許可證號(hào)：SCXK（京）2009-0004。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組和給藥方法 60只小鼠隨機(jī)分為6組，即正常對(duì)照組（空白對(duì)照組），模型對(duì)照組，陽(yáng)性藥物對(duì)照組（美多芭，100 mg/kg體重），白芍提取物低、中、高劑量組（分別按0.75、1.50、3.00 g生藥/kg體重給藥），每組10只。均按20 mL/kg體重經(jīng)口灌胃給藥（正常對(duì)照組和模型對(duì)照組按20 mL/kg體重給予雙蒸水），每天1次，連續(xù)15 d。從第八天開(kāi)始，除空白對(duì)照組外所有試驗(yàn)小鼠均腹腔注射MPTP[30 mg/（kg·d）]，每天1次，共8次。最后一次注射MPTP 10 min后，模型對(duì)照組小鼠應(yīng)出現(xiàn)前肢抬舉伴震顫、后肢僵硬、豎尾、豎毛及跳、躥等動(dòng)作， 持續(xù)約30 min后， 出現(xiàn)短暫性活動(dòng)減少；注射MPTP 1 h后進(jìn)行以下行為學(xué)指標(biāo)檢測(cè)：自發(fā)活動(dòng)試驗(yàn)、爬桿試驗(yàn)、滾軸試驗(yàn)和懸掛試驗(yàn)。

1.2.2 自發(fā)活動(dòng)試驗(yàn) 使用小鼠自主活動(dòng)儀測(cè)定小鼠自發(fā)活動(dòng)并計(jì)數(shù)，將小鼠放入自主活動(dòng)箱中（高13 cm、直徑25 cm，每個(gè)活動(dòng)箱中放1只小鼠，每次同時(shí)測(cè)定4只小鼠），由記錄儀自動(dòng)記錄小鼠活動(dòng)，測(cè)定前每只小鼠先自由活動(dòng)3 min，然后測(cè)定每只小鼠5 min內(nèi)的活動(dòng)次數(shù)。

1.2.3 爬桿試驗(yàn) 將一直徑為2.5 cm的軟木小球固定于一根長(zhǎng)50 cm、直徑1 cm的木桿頂端，木桿上纏上紗布以防打滑，作為爬桿。試驗(yàn)期間，每天引導(dǎo)小鼠從桿頂爬到桿底，每天2次。測(cè)試時(shí)將被測(cè)小鼠置于軟木小球上，記錄小鼠爬到桿底所需要的時(shí)間并作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，超過(guò)60 s的以60 s計(jì)。在給藥前先測(cè)定所有小鼠爬桿時(shí)間，并在末次腹腔注射MPTP后1 h再次測(cè)定其爬桿時(shí)間，每只小鼠測(cè)3次取平均值。以末次給藥后爬桿時(shí)間減去給藥前爬桿時(shí)間的差值作為衡量小鼠因MPTP引起肢體協(xié)調(diào)能力下降程度的指標(biāo)。

1.2.4 滾軸試驗(yàn) 滾軸試驗(yàn)需要?jiǎng)游镌跐L軸上保持平衡并連續(xù)運(yùn)動(dòng)，是廣泛采用的檢測(cè)運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性的試驗(yàn)。使用YLS-4C型小鼠轉(zhuǎn)棒式疲勞儀測(cè)試小鼠的轉(zhuǎn)棒行為表現(xiàn)。將小鼠置于轉(zhuǎn)棒上，轉(zhuǎn)速為16 r/min，測(cè)試小鼠從轉(zhuǎn)棒開(kāi)始旋轉(zhuǎn)到離開(kāi)轉(zhuǎn)棒的時(shí)間作為小鼠轉(zhuǎn)棒潛伏期，測(cè)試時(shí)間為180 s，每只小鼠測(cè)3次取平均值。測(cè)試前連續(xù)訓(xùn)練3 d，每天2次。

1.2.5 懸掛試驗(yàn) 在試驗(yàn)期間，每天將受試小鼠兩前爪懸掛于一根水平金屬線上（直徑1 mm，距地面30 cm）停留10 s，每天2次。于小鼠末次腹腔注射MPTP 1.5 h后進(jìn)行測(cè)試。小鼠懸掛能力評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：小鼠用兩后爪抓住金屬線記3分，用一后爪抓住金屬線記2分，兩后爪均抓不住金屬線記1分，最后計(jì)算得分情況并記錄小鼠從金屬線上掉下的時(shí)間。

1.2.6 小鼠腦組織超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）活性及丙二醛（MDA）含量測(cè)定 試驗(yàn)結(jié)束后，各組小鼠斷頭取腦，分離中腦黑質(zhì)。制備腦組織勻漿液，取適量上清液進(jìn)行SOD、GSH-Px、MDA的檢測(cè)，具體方法參考檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以x±s表示， 用ANOVA 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)， 組間比較P<0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 自發(fā)活動(dòng)試驗(yàn)

由表1可見(jiàn)，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠自發(fā)活動(dòng)次數(shù)和自發(fā)站立次數(shù)顯著（P<0.01）減少，說(shuō)明造模成功；與模型對(duì)照組比較，白芍提取物高劑量組小鼠自發(fā)站立次數(shù)顯著（P<0.05）增加。

2.2 爬桿試驗(yàn)

由表2可見(jiàn)，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠爬桿時(shí)間極顯著（P<0.01）延長(zhǎng)；與模型對(duì)照組比較，白芍提取物高劑量組小鼠爬桿時(shí)間顯著（P<0.05）縮短。

2.3 滾軸試驗(yàn)

由表3可見(jiàn)，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠滾軸時(shí)間極顯著（P<0.01）縮短；與模型對(duì)照組比較，白芍提取物低、中、高劑量組小鼠滾軸時(shí)間極顯著（P<0.01）增加。

2.4 懸掛試驗(yàn)

由表4可見(jiàn)，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠懸掛時(shí)間極顯著（P<0.01）縮短；與模型對(duì)照組比較，白芍提取物高劑量組小鼠懸掛時(shí)間顯著（P<0.05）延長(zhǎng)。

2.5 小鼠腦組織SOD、GSH-Px活性及MDA水平的檢測(cè)

由表5可見(jiàn)，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠腦組織的SOD和GSH-Px活性極顯著（P<0.01）降低，而MDA含量極顯著（P<0.01）升高；與模型對(duì)照組比較，白芍提取物高劑量組小鼠腦組織SOD、GSH-Px活性極顯著（P<0.01）升高，MDA水平極顯著（P<0.01）下降。

3 小結(jié)與討論

用MPTP制備的C57BL/6J小鼠模型是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的PD動(dòng)物模型之一，已被廣泛用于PD的研究中。本試驗(yàn)利用MPTP腹腔注射成功復(fù)制了C57BL/6J小鼠PD模型，小鼠的行為學(xué)及臨床表現(xiàn)方面都與PD患者相近[4-7]。由于PD臨床癥狀以靜止性肌肉震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌張力增高及姿勢(shì)平衡障礙等為主要特征，故本試驗(yàn)中設(shè)計(jì)了白芍提取物對(duì)小鼠自主活動(dòng)、爬桿能力、滾軸能力、懸掛能力的影響，以研究其是否具有增加自主活動(dòng)及改善肢體運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力的作用。自主活動(dòng)反映了動(dòng)物的隨意運(yùn)動(dòng)能力和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮程度，當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮時(shí)，自主活動(dòng)增多；反之，自主活動(dòng)減少。在本試驗(yàn)中以自主活動(dòng)次數(shù)作為反映自主活動(dòng)的客觀指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)與模型對(duì)照組比較，白芍提取物高劑量組（3.00 g/kg）能夠顯著增加小鼠在測(cè)試時(shí)間內(nèi)的自發(fā)站立次數(shù)，提示白芍提取物能部分拮抗小鼠因腹腔注射MPTP導(dǎo)致的自主活動(dòng)減少，提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮程度及隨意運(yùn)動(dòng)能力。爬桿試驗(yàn)、滾軸試驗(yàn)與懸掛試驗(yàn)?zāi)芊从硠?dòng)物肢體運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力，協(xié)調(diào)性好則動(dòng)物爬桿所需時(shí)間短、附著能力強(qiáng)，反之，爬桿所需時(shí)間長(zhǎng)、附著能力弱。研究發(fā)現(xiàn)腹腔注射MTPT 8次后，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組爬桿時(shí)間差值顯著增加、附著能力評(píng)分顯著降低，表明小鼠肢體運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力嚴(yán)重受損。白芍提取物能明顯縮短小鼠爬桿時(shí)間差值并提高附著能力分值，提示白芍提取物能夠提高小鼠肢體運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力，對(duì)PD動(dòng)物模型具有保護(hù)作用。

有關(guān)PD的發(fā)病機(jī)制至今尚不清楚。研究表明，氧化應(yīng)激與PD發(fā)病密切相關(guān)。PD患者處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，腦黑質(zhì)中過(guò)氧化物比正常人增加10倍，血清MDA含量增加；黑質(zhì)紋狀體中GSH活性顯著降低，腦中水解酶、GSH-Px的活性明顯降低[8]。本研究使用MPTP制備PD模型，采用白芍提取物給藥15 d后，PD小鼠腦內(nèi)SOD和GSH-Px活性與模型對(duì)照組相比明顯提高（P<0.05或P<0.01），而其MDA的含量較模型對(duì)照組明顯下降（P<0.05或P<0.01），這些結(jié)果提示，白芍提取物可能通過(guò)抑制氧化損傷來(lái)起到保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元的作用。

該結(jié)果為進(jìn)一步研究白芍提取物的抗PD機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為在白芍中研發(fā)新型抗PD藥物提供了有力依據(jù)。

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