高春艷

摘要：采用均勻設(shè)計法，對影響PCR的主要因素，即退火溫度、引物、Taq酶、二甲基亞砜（DMSO）、模板DNA進(jìn)行了優(yōu)化，得到人類SMN基因的最優(yōu)PCR擴增體系。結(jié)果表明，PCR擴增條件和反應(yīng)體系的最優(yōu)組合為：退火溫度61.6 ℃、Taq酶0.26 μL、引物（10 μmol/L）3.6 μL、DMSO（100%） 2 μL、DNA 3.8 μL。

關(guān)鍵詞：DNA；鹽析法；均勻設(shè)計法；灰度分析；PCR擴增

中圖分類號：Q781 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）12-3031-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.12.061

Optimizing the PCR Amplification of Human SMN Gene by Uniform Design Method

GAO Chun-yan1a，1b，LI Jun1a，1b，CAI Lu1a，1b，2

（1a.The Institute of Bioengineering and Technology；1b.School of Mathematics Physics and Biological Engineering，

Inner Mongolia University of Science and Technology，Baotou 014010， Inner Mongolia， China；

2.Inner Mongolia Key Laboratory of Biomass-Energy Conversion， Baotou 014010， Inner Mongolia， China）

Abstract： Based on uniform design method， the critical factors implicating with PCR， such as annealing temperature， primer，Taq polymerase，DMSO，DNA，were optimized respectively and PCR amplifying condition of human SMN gene was established. The results shouwed that annealing temperature 61.6 ℃，Taq polymerase 0.26 μL， primer（10 μmol/L）3.6 μL，DMSO（100%）2 μL，DNA3.8 μL were designated to the optimized combination between PCR amplifying condition and reaction system.

Key words： DNA； salting out method； uniform design； gray analysis； PCR amplification

人類SMN基因位于染色體5q13上，全長約20 kb，含9個外顯子，該染色體上有兩個高度同源的拷貝，端粒側(cè)拷貝（SMN1或SMNt）和著絲粒側(cè)拷貝（SMN2或SMNc）。SMN1和SMN2在序列上高度相似，兩者之間的DNA序列僅存在5個堿基的差異，其中SMN2基因外顯子7（+6C→T）的堿基置換直接影響了基因的可變剪接模式，因此對SMN基因的研究具有重大的現(xiàn)實意義。人類SMN基因片段為高GC含量，富含GC堿基的DNA的PCR難點在于模板DNA形成的二級結(jié)構(gòu)使DNA模板比較難變性[6]；退火時引物與模板不能很好地結(jié)合，容易形成錯配；延伸過程也不能很好進(jìn)行，從而使擴增效率大大降低；普通的PCR擴增1.5 kb以上的長片段基因經(jīng)常會遇到困難[7]。均勻設(shè)計法[8，9]將試驗有關(guān)因素的各水平數(shù)均勻分散在試驗范圍內(nèi)，使每一個試驗點具有更好的代表性，減少了試驗次數(shù)，而且試驗結(jié)果可用計算機處理，在尋找最佳試驗條件、最佳配比等方面是選擇優(yōu)化條件的有力工具。本研究采用均勻設(shè)計法對PCR主要因素：退火溫度、引物、Taq酶、DMSO（二甲基亞砜）、DNA等5個因素進(jìn)行優(yōu)化試驗，從而得到適合于人類基因SMN基因片段的PCR擴增條件和反應(yīng)體系的獲得最優(yōu)組合。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 人類外周血標(biāo)本取自包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，上游引物P1：5′-CGACGACAAGACCGTGAATGAAAAT GAAAGCCAAGT-3′，下游引物P2：5′-GAGGAGAAGAGCCGTGATAGTACGACCGA CGGA-3′；Taq酶、dNTPs、DMSO購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.2 儀器 NanoDrop紫外分光光度計，G16-W型微量高速離心機，Eppendorf高速冷凍離心機，Biometra PCR擴增儀，TGL-16C型臺式離心機，GeneGenius凝膠成像儀。

1.2 方法

1.2.1 鹽析法從人類外周血中提取人類全基因組DNA 取500 μL血樣，置于1.5 mL EP管中，加入1 000 μL 0.9%的NaCl，搖勻后靜置5 min，10 000 r/min離心20 min；棄上清，加入1 000 μL紅細(xì)胞裂解液，充分顛混均勻至清亮，然后10 000 r/min離心10 min；棄上清，沉淀中加入1 500 μL紅細(xì)胞裂解液，充分振蕩后12 000 r/min離心10 min；徹底棄上清，加入白細(xì)胞裂解液500 μL（裂解細(xì)胞）渦旋混勻；再加入150 μL的飽和NaCl渦旋混勻，靜置15 min后12 000 r/min離心15 min；取上清置于另一EP管中，加預(yù)冷的無水乙醇至1.5 mL，輕輕搖勻后，有白色絮狀物（DNA）析出，用移液槍將溶液吸出，將絮狀物留在EP管中；用移液槍吸取500 μL的75% 乙醇輕輕沖洗EP管中的DNA，加入50 μL 1×TE Buffer，使DNA溶解，將溶液狀態(tài)的DNA置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 均勻設(shè)計法優(yōu)化PCR擴增條件 在確定的反應(yīng)程序下研究退火溫度、Taq酶、引物（10 μmol/L）、DMSO、DNA濃度5個因素對SMN基因片段擴增結(jié)果的影響（反應(yīng)體系中其他因子為定量）。根據(jù)均勻設(shè)計法的要求，將每個因素分成10個水平根據(jù)均勻設(shè)計進(jìn)行試驗，組合見表1。

1.2.3 PCR產(chǎn)物灰度分析 按均勻設(shè)計法優(yōu)化PCR擴增條件（表1），得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂凝膠電泳后，并用Quantity one 4.6.2進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽析法DNA提取結(jié)果

由圖1可以看出，鹽析法提取的DNA在瓊脂糖凝膠電泳上條帶清晰整齊，具有較好的完整性。

2.2 優(yōu)化前的PCR擴增結(jié)果

由圖2可以看出，優(yōu)化前的PCR擴增產(chǎn)物的凝膠成像圖可見條帶不是很清晰，說明優(yōu)化前的PCR擴增效果不好，需要進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

2.3 均勻設(shè)計法優(yōu)化PCR擴增結(jié)果

將提取的DNA中濃度最好的作為DNA樣品，并按照表1中的條件進(jìn)行PCR擴增，其產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像結(jié)果如圖3。根據(jù)表1中PCR擴增具體條件進(jìn)行PCR擴增，與圖2相比圖3的擴增產(chǎn)物的凝膠成像圖條帶明顯清亮、齊整，充分說明均勻設(shè)計法優(yōu)化PCR擴增效果明顯。

以泳帶灰度值作為指標(biāo)，用均勻設(shè)計軟件對PCR擴增條件再次進(jìn)行優(yōu)化，得出最終優(yōu)化條件，結(jié)果見表2。

根據(jù)表2均勻設(shè)計軟件的優(yōu)化結(jié)果建立PCR體系，進(jìn)行PCR擴增，作6個平行管，對其產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，結(jié)果如圖4。

用均勻設(shè)計軟件最終優(yōu)化出的PCR條件進(jìn)行擴增后的產(chǎn)物的灰度高，達(dá)到了預(yù)期的效果，說明均勻設(shè)計法最終優(yōu)化出的PCR擴增條件為最優(yōu)擴增條件。

3 小結(jié)與討論

PCR擴增是基因研究的關(guān)鍵步驟，雖然PCR擴增操作是簡單的，但其影響因素較多，擴增效果很難把握。普通PCR擴增1.5 kb以上的長片段基因經(jīng)常會遇到困難，如果未找到最佳的擴增條件，可能會擴增得到非特異性條帶或者根本擴增不出條帶。擴增SMN基因片段GC含量較高，富含GC的DNA模板在常規(guī)變性溫度（94 ℃）下變性不完全，且單鏈GC富集區(qū)易于自身配對，形成發(fā)夾、環(huán)等穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)。DNA聚合酶在帶有穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)的模板鏈上難于延伸，使PCR產(chǎn)物的延伸效率大幅下降。雖然提高變性溫度可使模板變性完全，但變性溫度不能過高，變性時間不能過長，否則會對模板DNA造成損害，導(dǎo)致出現(xiàn)更多脫嘌呤及脫氨基敏感位點，同時會降低DNA聚合酶活性。

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