張曼麗，王慧慈，柳金金，于 丁，王紫微，吳佳昕，李軍霞*

(河北醫(yī)科大學(xué) 1.藥理教研室； 2.第二醫(yī)院心外科； 3.2012級七年制臨床醫(yī)學(xué)， 河北 石家莊 050000；4.滄州市人民醫(yī)院 甲乳外科， 河北 滄州 061000)

?

研究論文

戊地昔布通過上調(diào)ROS誘導(dǎo)人乳腺癌MCF- 7細(xì)胞凋亡

張曼麗1,4，王慧慈1，柳金金1，于 丁2，王紫微3，吳佳昕3，李軍霞1*

(河北醫(yī)科大學(xué) 1.藥理教研室； 2.第二醫(yī)院心外科； 3.2012級七年制臨床醫(yī)學(xué)， 河北 石家莊 050000；4.滄州市人民醫(yī)院 甲乳外科， 河北 滄州 061000)

目的探討活性氧 (reactive oxygen species，ROS)在選擇性環(huán)氧化酶(cyclooxygenase，COX)- 2抑制劑戊地昔布誘導(dǎo)人乳腺癌MCF- 7細(xì)胞凋亡中的作用。方法噻唑藍(lán)(MTT) 法檢測細(xì)胞增殖；流式細(xì)胞術(shù)和Hoechst33258檢測細(xì)胞凋亡；激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞ROS和線粒體膜電位；Western blot檢測蛋白表達(dá)。結(jié)果1)戊地昔布可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(P<0.01)，抑制細(xì)胞增殖(P<0.05或P<0.01)。2)給予戊地昔布后, caspase- 3表達(dá)先升高，然后降解為cleaved caspase- 3，Bcl- 2的表達(dá)降低，Bax的表達(dá)增高，caspase- 3 抑制劑Ac-DEVD-CHO和caspase 抑制劑Z-VAD-FMK可拮抗戊地昔布的抗腫瘤作用(P<0.05或P<0.01)。3)戊地昔布可降低線粒體膜電位，明顯提高細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。抗氧化劑N-乙酰基半胱氨酸(N-Acetyl-L-cystein，NAC)可拮抗戊地昔布的抗腫瘤作用(P< 0.01)。結(jié)論戊地昔布可通過升高細(xì)胞內(nèi)ROS誘導(dǎo)MCF- 7細(xì)胞凋亡。

戊地昔布; 環(huán)氧化酶- 2; 人乳腺癌MCF- 7細(xì)胞; 凋亡；活性氧

環(huán)氧化酶(cyclooxygenase，COX)可把花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素，有兩種亞型COX- 1和COX- 2[1]。COX- 1組成性表達(dá)在許多正常組織，參與生理功能的調(diào)節(jié)，COX- 2可被細(xì)胞因子、生長因子和腫瘤啟動子等誘導(dǎo)表達(dá)，在腫瘤組織表達(dá)增多，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[1]。許多研究表明COX- 2抑制劑可抑制腫瘤細(xì)胞增生，也可增強(qiáng)化療藥物和放療的敏感性[1]。近年來，活性氧 (reactive oxygen species，ROS)在腫瘤中的作用受到廣泛關(guān)注，ROS可通過誘導(dǎo)DNA損傷和激活癌基因等方式促進(jìn)癌癥發(fā)生，但ROS的增高也是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的原因之一[2]。戊地昔布(valdecoxib)是一類不良反應(yīng)小的選擇性COX- 2抑制劑，可抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長，但ROS在戊地昔布抗腫瘤中的作用尚未有報道[3]。本研究從這一角度出發(fā)，探討ROS在戊地昔布抗人乳腺癌MCF- 7細(xì)胞中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

戊地昔布由河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院合成(純度99%), 用二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide, DMSO)配成250 mmol/L母液-20 ℃儲存，臨用前稀釋。N-乙?；腚装彼?N-Acetyl-L-cystein，NAC)，Ac-DEVD-CHO，ROS試劑盒、Hoechst 33258試劑盒和JC- 1試劑盒(碧云天生物有限公司)；改良型RPMI1640、胰蛋白酶(Gibco公司)；MTT(Sigma公司)；Z-VAD-FMK，β-actin抗體(Santa Cruz公司)；caspase- 3，cleaved-caspase- 3，Bax和Bcl- 2抗體(Affbiotech公司)；二抗(Rockland公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：人乳腺癌MCF- 7細(xì)胞由河北醫(yī)科大學(xué)藥理室傳代培養(yǎng)。將細(xì)胞置于含10%胎牛血清、1×105IU/L青霉素及鏈霉素的改良型RPMI-1640 培養(yǎng)液中，于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 MTT法檢測戊地昔布對細(xì)胞增殖的影響：取對數(shù)增殖期的細(xì)胞，用胰蛋白酶消化，按1×104個/孔接種于96 孔板，待細(xì)胞貼壁后, 吸去上清，加入戊地昔布200 μL。同時設(shè)陰性對照和溶劑對照，于培養(yǎng)后不同時間加入MTT(5 g/L) 20 μL。繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加入DMSO 150 μL，振蕩，測570 nm的A值，計算生長抑制率。

1.2.3 MTT法檢測NAC，Ac-DEVD-CHO，Z-VAD-FMK對戊地昔布作用的影響：同上處理細(xì)胞。NAC濃度為5 mmol/L，Ac-DEVD-CHO和Z-VAD-FMK濃度為20 μmol/L，上述藥物提前孵育2 h，然后加入戊地昔布，戊地昔布濃度為200 μmol/L，繼續(xù)孵育48 h，其余同上。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡：實驗結(jié)束后，收集細(xì)胞，PBS 洗3次，用乙醇固定，PI 染液4℃避光染色30 min，上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡。

1.2.5 激光共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞凋亡、線粒體膜電位和ROS水平：將細(xì)胞培養(yǎng)在加入蓋玻片的24孔板中，給予戊地昔布，實驗結(jié)束后，按Hoechst 33258試劑盒、JC- 1試劑盒和ROS試劑盒步驟檢測。

1.2.6 Western blot檢測蛋白表達(dá)：收集各組細(xì)胞，加入蛋白裂解液，冰上放置30 min，4 ℃ 12 000×g離心, 取上清液用考馬斯亮藍(lán)試劑盒定量蛋白，變性。上樣量為每孔40 μg，10% SDS-PAGE(變性聚丙烯酰胺凝膠電泳)分離蛋白，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5% 脫脂奶粉37 ℃封閉2 h，一抗1∶500稀釋，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，二抗1∶5 000稀釋，37 ℃孵育1 h，掃描并分析圖像。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 戊地昔布對MCF- 7細(xì)胞增殖的抑制作用

25～400 μmol/L戊地昔布可抑制MCF- 7細(xì)胞的增殖，隨時間的延長和濃度的增加，抑制作用明顯增加(P<0.05或P<0.01)(圖1)。

2.2 戊地昔布可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

戊地昔布可明顯誘導(dǎo)MCF- 7凋亡(P< 0.01)。戊地昔布作用后細(xì)胞呈典型的凋亡形態(tài)，核染色質(zhì)熒光增強(qiáng)，濃縮邊聚，呈新月狀(圖2)。

SC:solvent control; *P<0.05，**P<0.01 compared with control圖1 戊地昔布對MCF- 7細(xì)胞增殖的抑制作用Fig 1 The effect of valdecoxib on the proliferation of MCF- 7 cells(n=3)

2.3 戊地昔布對凋亡蛋白影響

給予戊地昔布(200 μmol/L)后，Bax蛋白表達(dá)升高，Bcl- 2蛋白表達(dá)降低，caspase- 3表達(dá)先升高，然后降解為cleaved-caspase- 3。對照組細(xì)胞基本檢測不到cleaved-caspase- 3表達(dá)(P<0.05或P<0.01)(圖3)。

2.4 戊地昔布對線粒體膜電位影響

膜電位較高時，JC- 1呈紅色熒光；膜電位較低時，JC- 1呈綠色熒光。對照組可見明顯的紅色熒光，給予戊地昔布后，可見紅色熒光減弱，綠色熒光增強(qiáng)(P<0.01)(圖4)。

A,B.the apoptosis was detected by flow cytometry; C.the apoptosis was detected by hoechst 33258 dye; *P<0.01 compared with control

*P<0.05，**P<0.01 compared with control

A.representative confocal laser images of mitochondrial transmembrane potential; B.quantitative analysis of the level of mitochondrial transmembrane potential;*P<0.01 compared with control

圖4 戊地昔布對MCF- 7細(xì)胞線粒體膜電位的影響

Fig 4 The effect of valdecoxib on mitochondrion transmembrane potential(×200)

2.5 戊地昔布對細(xì)胞ROS影響

對照組細(xì)胞熒光很微弱，給予戊地昔布后可見熒光明顯增強(qiáng)，抗氧化劑NAC可降低ROS水平(P< 0.01)(圖5)。

2.6 NAC，Ac-DEVD-CHO，Z-VAD-FMK對戊地昔布作用影響

抗氧化劑NAC、caspase 3 抑制劑Ac-DEVD-CHO和caspase抑制劑Z-VAD-FMK均可拮抗戊地昔布的抗腫瘤作用，這提示ROS和caspase途徑參與了戊地昔布抑制細(xì)胞增殖的作用(P<0.05或0.01)。NAC可拮抗戊地昔布誘導(dǎo)的凋亡(P<0.01)(圖6)。

3 討論

許多抗腫瘤藥物可通過多種方式誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[4- 5]。本實驗結(jié)果顯示，戊地昔布可降低線粒體膜電位，誘導(dǎo)MCF- 7細(xì)胞的凋亡。線粒體膜電位的降低可增強(qiáng)線粒體通透性，進(jìn)而激活caspase- 9和3，活化的caspase可引起DNA的斷裂、染色質(zhì)濃縮，出現(xiàn)凋亡特有的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)[6- 7]。戊地昔布可明顯增高caspase- 3表達(dá)，隨后caspase- 3降解為cleaved caspase- 3， caspase- 3抑制劑和caspase抑制劑可拮抗戊地昔布的生長抑制作用，這提示caspase的激活參與了戊地昔布誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Bcl- 2存在于線粒體外膜，可維持線粒體膜電位，延緩細(xì)胞的凋亡。Bax可引起細(xì)胞凋亡，這一作用可被Bcl- 2抑制[7]。本實驗結(jié)果表明，戊地昔布可引起B(yǎng)cl- 2表達(dá)降低和Bax表達(dá)增高。

A.representative confocal laser images of ROS; B.quantitative analysis of the level of ROS;*P<0.01 compared with control;#P<0.01 compared with valdecoxib group

圖5 戊地昔布對細(xì)胞ROS的影響

Fig 5 The effect of valdecoxib on ROS of MCF- 7 cells(×200)

A.quantitative analysis of the antagonistic effect NAC, Ac-DEVE-CHO and Z-CAD-FMK on valdecoxibby MTT assay; B.representative flow acytometry images of apoptosis; C.quantitative anolysis of the effect of NAC on the apoptosis induced by valdecoxib;*P<0.05,**P<0.01 compared with valdecoxib group

圖6 NAC, Ac-DEVD-CHO和Z-VAD-FMK對戊地昔布抗腫瘤作用的影響

Fig 6 The growth inhibition effect of valdecoxib was antagonized by NAC, Ac-DEVD-CHO, and Z-VAD-FMK(n=6)

在藥物引起腫瘤細(xì)胞凋亡中，ROS的作用受到了廣泛關(guān)注。正常情況下細(xì)胞內(nèi)ROS維持在穩(wěn)定的范圍內(nèi)，腫瘤細(xì)胞的抗氧化酶活性低于正常細(xì)胞，清除ROS的能力較正常細(xì)胞低，而腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的ROS又往往高于正常細(xì)胞，因此腫瘤細(xì)胞對ROS很敏感[8]。細(xì)胞內(nèi)ROS的聚集是一個雙刃劍，ROS的輕度升高可促進(jìn)細(xì)胞增殖，而高水平的ROS可介導(dǎo)Bax的活化，促進(jìn)細(xì)胞凋亡或壞死[8]。很多抗腫瘤藥物如順鉑、醌類藥物等誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡都與誘發(fā)ROS的產(chǎn)生相關(guān)[9- 10]。本實驗中，戊地昔布可誘發(fā)ROS明顯升高，抗氧化劑N-乙?；腚装彼峥赊卓刮斓匚舨嫉淖饔谩＿@提示，ROS的升高參與了戊地昔布誘導(dǎo)的凋亡。線粒體是ROS產(chǎn)生和攻擊的主要部位，線粒體膜受到ROS攻擊后可發(fā)生脂質(zhì)過氧化、通透性增高，caspase- 3的活化，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡[10]。因此，本實驗檢測到的線粒體膜電位的降低可能是ROS增多，細(xì)胞氧化還原狀態(tài)平衡改變的結(jié)果。

綜上所述，戊地昔布可誘導(dǎo)人乳腺癌MCF- 7細(xì)胞的凋亡，與戊地昔布升高細(xì)胞內(nèi)ROS，進(jìn)一步激活caspase- 3，降低Bcl- 2的表達(dá)和增高Bax表達(dá)等有關(guān)。

[1] Ghosh N, Chaki R, Mandal V,etal. COX- 2 as a target for cancer chemotherapy[J]. Pharmacol Rep, 2010, 62:233- 244.

[2] Vurusaner B, Poli G, Basaga H. Tumor suppressor genes and ROS: complex networks of interactions[J]. Free Radic Biol Med, 2012, 52:7- 18.

[3] 徐清華，候曉敏，王慧慈，等.戊地昔布聯(lián)用吡柔吡星對人肺癌A549細(xì)胞凋亡的影響[J]. 中國藥學(xué)雜志, 2013, 48：972- 975.

[4] 紀(jì)春梅，甄永占，范曉禹，等.賴氨大黃酸與順鉑聯(lián)合對人肺癌A549 細(xì)胞系增殖和凋亡的影響[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床, 2014, 34: 155- 159.

[5] Mayora A, Arvelo F. Prostate cancer and apoptosis[J]. Invest Clin, 2011, 52: 376- 396.

[6] Frejlich E, Rudno-Rudzińska J, Janiszewski K,etal. Caspases and their role in gastric cancer[J]. Adv Clin Exp Med, 2013, 22: 593- 602.

[7] Kang MH, Reynolds CP. Bcl- 2 inhibitors: targeting mitochondrial apoptotic pathways in cancer therapy[J]. Clin Cancer Res, 2009, 15: 1126- 1132.

[8] Sosa V, Moliné T, Somoza R,etal. Oxidative stress and cancer: an overview[J]. Ageing Res Rev, 2013, 12: 376- 390.

[9] 易健，舒徐.活性氧對細(xì)胞凋亡和增殖的調(diào)控作用[J]. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床, 2013, 33: 1127- 1130.

[10] Wang HC, Choudhary S. Reactive oxygen species-mediated therapeutic control of bladder cancer[J]. Nat Rev Urol, 2011, 8: 608- 616.

Valdecoxib induces apoptosis of human breast cancer MCF- 7 cells by increasing ROS

ZHANG Man-li1,4, WANG Hui-ci1, LIU Jin-jin1, YU Ding2, WANG Zi-wei3, WU Jia-xin3, LI Jun-xia1*

( 1.Dept. of Pharmacology; 2.Dept. of Cardiac Surgery, the Second Hospital; 3.the Clinical Medicine of Seven-year Education, Hebei Medical University， Shijiazhuang 050000；4.Dept. of Thyroid and Breast Surgery, Cangzhou People’s Hospital, Cangzhou 061000，China)

Objective To study the role of ROS in the apoptosis of human breast cancer MCF- 7 cells induced by valdecoxib, a selective COX- 2 inhibitor. Methods MTT assay was used to observe the effect of valdecoxib on cell proliferation; Flow cytometry and hoechst 33258 dye were used to detect apoptosis; Laser confocal microscopy was used to detect the level of ROS and mitochondrial transmembrane potential; Western blot was used to detect the protein expression. Results 1)Valdecoxib significantly inhibited the proliferation of MCF- 7 cells(P<0.05 or 0.01)and induced apoptosis of the cells(P<0.01). 2)The expression of Bax was increased, and the expression of Bcl- 2 was decreased after valdecoxib was aplied. The expression of caspase- 3 was increased at first and then degradated into cleaved caspase- 3. Caspase- 3 inhibitor Ac-DEVD-CHO, and caspase inhibitor Z-VAD-FMK antagonized the growth inhibition effect of valdecoxib(P<0.05 or 0.01). 3)Valdecoxib significantly decreased the mitochondrial transmembrane potential, and increased the level of ROS. Antioxidant NAC antagonized the growth inhibition effect of valdecoxib(P< 0.01). Conclusions Valdecoxib induces apoptosis of MCF- 7 cells by enhancing the level of ROS.

valdecoxib; cyclooxygenase- 2; human breast cancer MCF- 7 cells; apoptosis; reactive oxygen species

2014- 09- 22

2015- 01- 04

河北省科技攻關(guān)項目(07276403D)；河北省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)重點課題(2008067)

1001-6325(2015)04-0491-05

R739.9

A

*通信作者(corresponding author)：lyjunxia@aliyun.com