陸順教等

摘 要 以蝴蝶蘭幼嫩花梗誘導(dǎo)的無菌苗葉片為外植體，以MS為基本培養(yǎng)基，研究不同暗培養(yǎng)時(shí)間和TDZ濃度對蝴蝶蘭葉片誘導(dǎo)不定芽的影響。結(jié)果表明：暗培養(yǎng)和TDZ對接種的蝴蝶蘭葉片的成活率均具有顯著影響，暗培養(yǎng)60 d時(shí)，葉片的存活率在90%以上，而在同一暗培養(yǎng)時(shí)間條件下，葉片的存活率隨著TDZ濃度的增加而上升；在TDZ濃度為3.0 mg/L，暗培養(yǎng)60 d時(shí)，蝴蝶蘭存活葉片不定芽的誘導(dǎo)率最高，達(dá)到93.45%；誘導(dǎo)的不定芽數(shù)最多，平均每個(gè)外植體誘導(dǎo)的不定芽數(shù)為13.22個(gè)。綜合考慮外植體的成活率、不定芽誘導(dǎo)率和誘導(dǎo)的不定芽數(shù)，蝴蝶蘭葉片誘導(dǎo)不定芽的最佳條件為：MS+TDZ 3.0 mg/L，暗培養(yǎng)60 d。

關(guān)鍵詞 蝴蝶蘭 ；葉片 ；不定芽 ；TDZ ；暗培養(yǎng)

分類號 S682.31

Abstract Used leaves of in vitro plantlets which induced from young pedicels of Phalaenopsis as explants and the MS as basal medium， the effect of dark culture phase and TDZ on adventitious shoot induction from leaves of Phalaenopsis were investigated. The result showed that： dark culture and TDZ had a significant impact on survival rate of inoculated leaves， and the survival rate was more than 90% when the dark culture phase was 60 d， the survival rate increased with the increase of TDZ concentrations under same dark culture phase； The highest inductivity of 93.45% and maximum average number of adventitious shoots were obtained on the MS medium supplemented with 3.0 mg/L TDZ and under 60 d dark culture. Considering of survival rate， regeneration rate and adventitious shoot number， the optimum culture condition for adventitious shoots induction from leaf explants of Phalaenopsis was MS appended with 3.0 mg/L TDZ and 60 d dark culture treatment.

Keywords Phalaenopsis ； leaf ； adventitious bud ； TDZ ； dark culture

蝴蝶蘭為蘭科蝴蝶蘭屬植物，是蘭科中最具觀賞價(jià)值的花卉之一，因其花型奇特、色彩豐富、花期持久，在熱帶蘭中具有“蘭花皇后”的美稱，在國內(nèi)外花卉市場極受歡迎[1]。蝴蝶蘭在商業(yè)生產(chǎn)中需要大量的種苗，但蝴蝶蘭是單莖性氣生蘭，植株極少發(fā)育側(cè)芽，較難進(jìn)行分株繁殖。因此，組織培養(yǎng)是蝴蝶蘭種苗高效繁育的重要手段[2]。蝴蝶蘭通過組織培養(yǎng)獲得大量種苗的方式主要有2種：一是通過無菌播種獲得；二是通過外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生原球莖或叢生芽，再通過原球莖或叢生芽增殖培養(yǎng)從而獲得大量幼苗。商業(yè)生產(chǎn)中的蝴蝶蘭大多是雜交品系，因此前者雖然簡單易行，可短期內(nèi)獲得大量幼苗，但其后代變異率高，難以獲得品質(zhì)整齊的大規(guī)模種苗；后者變異率低，原球莖或叢生芽增殖系數(shù)高，幼苗品質(zhì)較一致，適合商業(yè)生產(chǎn)種苗的大規(guī)模繁育。近年來，蝴蝶蘭在莖尖[3-4]、花梗腋芽[4-5]、花梗節(jié)間段[6-7]、根尖[8-9]及根段[10]的組織培養(yǎng)上已經(jīng)取得了很大進(jìn)展。但以莖尖為外植體，不僅外植體材料少，還會(huì)因切取莖尖而損傷母株；以花梗作為外植體在取材時(shí)間上受到限制；以根尖和根段作為外植體誘導(dǎo)原球莖困難，誘導(dǎo)率低。葉片雖是蝴蝶蘭組培快繁最好的外植體材料，但葉片誘導(dǎo)原球莖較為困難。目前，蝴蝶蘭葉片誘導(dǎo)不定芽的組培快繁雖有少量研究[11-12]，但缺少針對某一特定條件深入系統(tǒng)的研究。本研究以蝴蝶蘭葉片為外植體，對影響蝴蝶蘭葉片誘導(dǎo)不定芽的關(guān)鍵因素TDZ（Thidazuron，噻二唑苯基脲）濃度和暗培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行研究，為蝴蝶蘭的高效組培快繁和種質(zhì)創(chuàng)新奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

外植體取自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所熱帶蘭花種質(zhì)資源圃保存的黃花紅唇金邊蝴蝶蘭品種，取其幼嫩花梗進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得該品種的無菌苗，誘導(dǎo)方法參照卜朝陽等[5]的方法。待無菌幼苗長到3片全展葉時(shí)，取其葉片作為試驗(yàn)材料。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用單因素設(shè)計(jì)，分別進(jìn)行以下試驗(yàn)：（1）不同濃度TDZ對葉片不定芽再生的影響：以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/L的TDZ，以不添加TDZ為對照；（2）不同暗培養(yǎng)時(shí)間對葉片不定芽再生的影響：葉片分別接種到各個(gè)TDZ濃度處理的培養(yǎng)基中，分別在暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0（對照）、10、20、30、40、50、60 d，然后移至光照培養(yǎng)。

所有培養(yǎng)基均添加30 g/L的蔗糖、6.5 g/L卡拉膠，pH值調(diào)至6.0，分裝至培養(yǎng)瓶中，每瓶分裝30 mL，120 ℃高溫高壓滅菌后備用。取生長較一致的無菌苗，剪取頂部葉片，在正面輕輕的橫劃幾刀，正面朝上置于培養(yǎng)基上，蓋好瓶蓋，置于（25±1）℃的暗培養(yǎng)室培養(yǎng)，然后根據(jù)暗培養(yǎng)試驗(yàn)設(shè)計(jì)的暗培養(yǎng)時(shí)間分別轉(zhuǎn)至光照培養(yǎng)。每個(gè)處理做3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種10瓶，每瓶接種4個(gè)外植體。

1.2.2 項(xiàng)目測定

接種70 d后統(tǒng)計(jì)外植體的存活率、存活外植體不定芽誘導(dǎo)率、平均不定芽誘導(dǎo)數(shù)。

外植體存活率=存活外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%

存活外植體不定芽誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)不定芽外植體數(shù)/存活外植體數(shù)×100%

平均不定芽誘導(dǎo)數(shù)=誘導(dǎo)的不定芽總數(shù)/誘導(dǎo)不定芽外植體數(shù)

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SAS9.0軟件進(jìn)行處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 TDZ和暗培養(yǎng)對蝴蝶蘭葉片成活率的影響

由表1可知，暗培養(yǎng)對蝴蝶蘭葉片在組織培養(yǎng)中的成活率具有顯著影響，在相同TDZ濃度條件下，隨著暗培養(yǎng)時(shí)間的延長，葉片的成活率呈逐漸上升的趨勢。暗培養(yǎng)60 d時(shí)，葉片的成活率最高；而未進(jìn)行暗培養(yǎng)的葉片成活率不到30%，最高僅為26.85%。除了暗培養(yǎng)，TDZ對提高組培過程中蝴蝶蘭葉片的成活率也具有顯著的作用，在相同暗培養(yǎng)時(shí)間下，葉片的成活率隨著TDZ濃度的增加而相應(yīng)提高；在暗培養(yǎng)60 d，TDZ濃度為2.50 mg/L時(shí)，葉片的成活率達(dá)到最高98.92%。但當(dāng)暗培養(yǎng)時(shí)間在50 d或以上時(shí)，葉片的成活率隨TDZ濃度的增加雖略有提高，但不同濃度之間無顯著性差異。因此，有利于蝴蝶蘭葉片組培中外植體成活率的最佳條件為：MS+TDZ 2.50 mg/L+暗培養(yǎng)60 d。

2.2 TDZ和暗培養(yǎng)對蝴蝶蘭葉片誘導(dǎo)不定芽的影響

由表2可知，TDZ對蝴蝶蘭葉片誘導(dǎo)不定芽的影響顯著，在相同暗培養(yǎng)時(shí)間條件下，蝴蝶蘭葉片不定芽誘導(dǎo)率隨著TDZ濃度的增加呈逐漸上升的趨勢，在TDZ濃度為3.0 mg/L時(shí)達(dá)到最大值，之后隨著TDZ濃度的增加而逐漸下降；其中在暗培養(yǎng)60 d，TDZ濃度為3.0 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)率達(dá)到最大值，為93.45%。而暗培養(yǎng)同樣對蝴蝶蘭葉片誘導(dǎo)不定芽具有促進(jìn)作用，在相同的TDZ濃度條件下，隨著暗培養(yǎng)時(shí)間的延長。蝴蝶蘭葉片不定芽的誘導(dǎo)率逐漸上升，在暗培養(yǎng)60 d時(shí)誘導(dǎo)率達(dá)到最高。綜合TDZ濃度與暗培養(yǎng)時(shí)間對蝴蝶蘭葉片誘導(dǎo)不定芽的作用，在MS+TDZ 3.0 mg/L+暗培養(yǎng)60 d時(shí)，蝴蝶蘭葉片可獲得最高的不定芽誘導(dǎo)率。

2.3 TDZ和暗培養(yǎng)對蝴蝶蘭葉片不定芽分化的影響

由表3可知，TDZ和暗培養(yǎng)均可促進(jìn)蝴蝶蘭葉片不定芽的分化，蝴蝶蘭葉片分化的不定芽數(shù)量隨著TDZ濃度的增加和暗培養(yǎng)時(shí)間的延長而增多，其中在TDZ為3.0 mg/L，暗培養(yǎng)60 d時(shí)，分化的不定芽數(shù)量達(dá)到最高，每片葉平均分化的不定芽數(shù)量達(dá)到13.22個(gè)。之后則隨著TDZ濃度的增加不定芽數(shù)的數(shù)量逐漸減少。因此，蝴蝶蘭葉片誘導(dǎo)不定芽過程中，在MS+TDZ 3.0 mg/L+暗培養(yǎng)60 d條件下，單個(gè)外植體可獲得最多的不定芽。

3 討論與結(jié)論

近年來，關(guān)于蝴蝶蘭的組培快繁研究已經(jīng)做了大量的研究，但大多數(shù)集中在原球莖發(fā)生途徑，然而原球莖發(fā)生途徑的組培再生過程周期長，且發(fā)生細(xì)胞變異的可能性比較高[13]。而由葉片直接誘導(dǎo)不定芽的再生方式是通過直接器官發(fā)生途徑實(shí)現(xiàn)的。一般認(rèn)為，直接再生具有以下優(yōu)勢：一是分化時(shí)間短，在一定程度上縮短種苗繁育周期；二是通過直接出芽的方式可減少變異率，保持親本的優(yōu)良特性；三是外植體材料不受限制，可常年進(jìn)行。但葉片分化不定芽發(fā)育成植株是一個(gè)非常復(fù)雜的脫分化、再分化的過程，在整個(gè)過程中受到多個(gè)因素的影響，本研究針對影響因素中的暗培養(yǎng)時(shí)間和外源激素TDZ的濃度進(jìn)行了研究。

已有研究結(jié)果表明，暗培養(yǎng)可降低組培外植體材料的褐化，進(jìn)而提高成活率，這已在春蘭[14]、蝴蝶蘭[15]、春石斛[16]、寒蘭[17]等蘭花組織培養(yǎng)中得到證實(shí)，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，暗培養(yǎng)可提高蝴蝶蘭葉片外植體的成活率，與上述研究結(jié)果一致。暗培養(yǎng)對梨葉片不定芽再生具有顯著的影響[18-19]。邢文等[20]在研究玫瑰葉片的直接再生中發(fā)現(xiàn)暗培養(yǎng)對不定芽的分化具有一定的促進(jìn)作用。另外，在黑莓和黃瓜的葉片再生研究中，暗培養(yǎng)均對不定芽的再生具有明顯的促進(jìn)作用[21-22]。本研究結(jié)果表明，暗培養(yǎng)可提高蝴蝶蘭葉片不定芽誘導(dǎo)率及分化的不定芽數(shù)，這與上述研究結(jié)果相似。在蝴蝶蘭研究方面，程強(qiáng)強(qiáng)等[11]研究認(rèn)為，短時(shí)間的暗處理有利于蝴蝶蘭葉片不定芽的誘導(dǎo)，但其研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，15 d的暗處理時(shí)間誘導(dǎo)率達(dá)到最高，且隨著暗處理時(shí)間的延長，誘導(dǎo)率逐漸下降。而楊海蕓等[8]的研究結(jié)果表明適當(dāng)時(shí)間的暗培養(yǎng)有利于不定芽的發(fā)生，其中以暗培養(yǎng)21 d誘導(dǎo)效果最佳。以上2個(gè)蝴蝶蘭葉片誘導(dǎo)不定芽的暗培養(yǎng)時(shí)間與本研究存在差異，這可能是由于所選材料的基因型不同造成的，而程強(qiáng)強(qiáng)等[11]的研究結(jié)果表明相同條件下不同基因型的蝴蝶蘭葉片不定芽誘導(dǎo)率存在顯著差異。綜上所訴，不同基因型的蝴蝶蘭葉片誘導(dǎo)不定芽需要的暗培養(yǎng)時(shí)間存在差異。

TDZ是人工合成的不同于腺嘌呤類細(xì)胞分裂素的苯基脲衍生物的一種，作為一種有效的植物生長調(diào)節(jié)劑廣泛應(yīng)用于植物組織培養(yǎng)中直接誘導(dǎo)葉片不定芽的形成研究中[23]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TDZ濃度為3.0 mg/L時(shí)，對蝴蝶蘭葉片不定芽的誘導(dǎo)效果最好。而程強(qiáng)強(qiáng)等[11]在蝴蝶蘭葉片誘導(dǎo)不定芽的研究中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在TDZ 3.0 mg/L條件下，‘紅天使的不定芽誘導(dǎo)率和誘導(dǎo)的平均不定芽數(shù)均達(dá)到最高，與本研究結(jié)果一致。楊海蕓等[8]研究認(rèn)為TDZ 1.5 mg/L為蝴蝶蘭葉片不定芽的最佳誘導(dǎo)濃度。Latip等[24]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)TDZ濃度在0.1～0.3 mg/L時(shí)，葉片不定芽誘導(dǎo)率最高，而且這兩者的研究結(jié)果在誘導(dǎo)率和不定芽的分化數(shù)量上均低于本研究，其可能的原因是外植體材料基因型不同造成的，另外，這2個(gè)研究所設(shè)置的TDZ濃度最高值均較?。ㄇ罢咦罡邽?.0 mg/L，后者為1.0 mg/L），未能全面體現(xiàn)TDZ的濃度梯度。

參考文獻(xiàn)

[1] 盧思聰. 中國蘭與洋蘭[M]. 北京：金盾出版社，1994.

[2] 胡松華. 熱帶蘭花[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2003.

[3] Tokuhara K， Mii M. Induction of embryogenic callus and cell suspension culture from shoot tips excised from flower stalk buds of Phalaenopsis（Orchidaceae）[J]. In Vitro Cell Dev Biol Plant， 2001， 37（3）： 457-461.

[4] 張?jiān)獓?，刁家連，劉玉娥，等. 蝴蝶蘭花梗腋芽組培再生技術(shù)體系的研究[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，6（1）：3-5.

[5] 卜朝陽，蔣慧萍，滿若君. 蝴蝶蘭花梗離體培養(yǎng)及葉片誘導(dǎo)類原球莖研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，3（1）：147-150.

[6] 魯雪華，郭文杰，徐立暉，等. 蝴蝶蘭花梗節(jié)間段培養(yǎng)繁殖的初步研究[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2002，29 （5） ：491-492.

[7] 蘇家樂，陳尚平，湯久順，等. 蝴蝶蘭花梗節(jié)間切段的類原球莖誘導(dǎo)與增殖[J]. 植物生理學(xué)通訊，2007，43（5）：876-878.

[8] 楊海蕓，黃珊珊，鮑忠贊，等. 蝴蝶蘭根尖組織培養(yǎng)[J]. 林業(yè)科技開發(fā)，2009，23（3）：120-123.

[9] Park S Y， Murthy H N， Paek K Y. Protocorm-like body induction and subsequent plant regeneration from root tip cultures of Doritaenopsis[J]. Plant Science， 2003， 164（5）： 919-923.

[10] 李進(jìn)進(jìn)，廖俊杰，柯麗婉，等. 蝴蝶蘭根段的組織培養(yǎng)[J]. 植物生理學(xué)通訊，2000，36（1）：37.

[11] 程強(qiáng)強(qiáng)，莊東紅，許大熊，等. TDZ高效誘導(dǎo)蝴蝶蘭葉片不定芽及植株再生[J]. 植物科學(xué)學(xué)報(bào)，2011，29（4）：524-530.

[12] 楊海蕓，吳 震，王廣東，等. 不同培養(yǎng)條件對蝴蝶蘭離體葉片不定芽發(fā)生的影響[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，30（1）：44-49.

[13] Chen W H， Chen T M， Fu Y M， et al. Studies on somaclonal variation in Phalaenopsis[J]. Plant Cell Reports， 1998， 18（1）： 7-13.

[14] 王寶寧，張 顯，宋軍陽. 秦嶺野生春蘭組織培養(yǎng)過程中的褐化控制研究[J]. 北方園藝，2011，35（5）：169-172.

[15] 崔廣榮，張子學(xué)，胡能兵，等. 蝴蝶蘭原球莖液體增殖培養(yǎng)的研究[J]. 激光生物學(xué)報(bào)，2009，18（2）：189-194.

[16] 張新平. 春石斛蘭組培增殖及蘭花試管開花研究[D]. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2008.

[17] 雷文瑾. 寒蘭組織培養(yǎng)中酚污染控制研究初探[J]. 南方園藝，2009，20（3）：17-18.

[18] 蘇艷麗，田 鵬，魏聞東. 紅星梨葉片不定梢誘導(dǎo)及增殖培養(yǎng)[J]. 經(jīng)濟(jì)林研究，2015，33（1）：103-106.

[19] 陶愛群，尹 婷，謝深喜. 黃金梨葉片再生體系建立研究[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，5（1）：108-111.

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