趙立香，郭夢(mèng)堯，李豐陽，梁德潔，張乃生

（1.吉林農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)學(xué)院制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132101；2.吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130062）

奶牛子宮內(nèi)膜炎是危害奶牛養(yǎng)殖業(yè)的重要疾病，主要導(dǎo)致子宮復(fù)舊時(shí)間延長(zhǎng)、受孕率下降，母牛淘汰率升高，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。奶牛子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生是病原微生物與奶牛自身免疫狀態(tài)及遺傳因素等作用的結(jié)果[1]。先天免疫系統(tǒng)首先識(shí)別侵入機(jī)體的病原，然后信號(hào)傳導(dǎo)通路，誘導(dǎo)相關(guān)免疫細(xì)胞的活化和細(xì)胞因子分泌，啟動(dòng)獲得性免疫應(yīng)答，殺滅致病菌。病原相關(guān)分子模式（PAMP）識(shí)別受體可對(duì)入侵病原菌識(shí)別，是先天免疫反應(yīng)以及獲得性免疫反應(yīng)的基礎(chǔ)[2]。近年來發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體（Toll-like recep?tor，TLR）就是一類PAMP識(shí)別受體。TLR4可以識(shí)別革蘭陰性菌細(xì)胞壁成分，進(jìn)而激活下游分子和細(xì)胞因子的分泌[3-4]。大腸桿菌是革蘭陰性菌，主要引發(fā)臨床型子宮內(nèi)膜炎[5]，但其引發(fā)奶牛子宮內(nèi)膜炎的機(jī)制仍不清楚。本研究以先天免疫反應(yīng)中的TLR4為切入點(diǎn)，研究大腸桿菌引發(fā)奶牛子宮內(nèi)膜炎的致病機(jī)制。這將有助于對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜炎的防控及治療。

1 材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 健康中國(guó)荷斯坦母奶牛10頭，體溫正常，食欲旺盛，直腸檢查：子宮角直徑明顯縮小，子宮壁彈性良好。由吉林省吉林市規(guī)范化養(yǎng)牛養(yǎng)殖場(chǎng)提供。

1.2 藥品 雙丙烯酰胺、丙烯酰胺、Tris、尿素、EDTA，均購(gòu)自Promega生物技術(shù)有限公司；甲酰胺、TEMED，購(gòu)自Sigma生物有限公司；PBS、H2SO4、冰醋酸，購(gòu)自上海化學(xué)試劑公司。

1.3 主要試劑 組織蛋白提取試劑盒、cDNA合成試劑盒、組織RNA提取試劑盒、ELISA檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；SYBR Green Premix Ex Tag試劑盒、TBST、脫脂乳，購(gòu)自Sigma生物有限公司。

1.4 主要儀器 臺(tái)式高速離心機(jī)，購(gòu)自上海天美科學(xué)儀器公司；半干轉(zhuǎn)膜儀、凝膠電泳成像系統(tǒng)、酶標(biāo)儀，均購(gòu)自美國(guó)伯樂生物有限公司；水平電泳槽，購(gòu)自北京君意電泳儀設(shè)備廠；熒光定量PCR儀，購(gòu)自ABI生物有限公司；勻漿器、搖床，購(gòu)自上海六一儀器廠。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型建立 選取中國(guó)荷斯坦奶牛10頭。其中，2頭不做處理（A），4頭子宮灌注無菌的LB肉湯培養(yǎng)基（B），4頭子宮灌注大腸桿菌菌液（C）。7～10 d后，灌注細(xì)菌組臨床表現(xiàn)為：精神沉郁，體溫升高，采食減少，由陰門流出灰褐（白）色有腐臭味的黏液，子宮頸口周圍有膿性分泌物附著，直腸檢查：子宮角松軟、增粗，子宮壁增厚，彈性減弱等。對(duì)照組A和無菌的LB肉湯培養(yǎng)基B組奶牛無異常臨床表現(xiàn)。

2.2 子宮內(nèi)膜樣品采集 利用子宮內(nèi)膜活檢采樣器采集子宮內(nèi)膜樣品。將已經(jīng)無菌處理的采樣器以直腸把握法送入子宮內(nèi)。經(jīng)直腸用手將子宮壁用力按壓到采樣器的凹口，閉合采樣器，切下子宮內(nèi)膜組織，再取出采樣器，將子宮內(nèi)膜樣品放于已滅菌的小瓶中，以備實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

2.3 TNF-α、IL-1β、IL-6檢測(cè) 子宮內(nèi)膜樣品組織勻漿后，12000 r/min離心收集上清液。ELISA板一抗包被，4℃過夜。洗板液清洗4次，注入樣品稀釋液（200μL/孔），室溫振蕩1 h。加入待測(cè)樣品100 μL，20℃振蕩2 h，PBS洗板3次，加入二抗，洗板3次，之后加入顯色液，用濃度2 mmol/L H2SO4100μL注入各孔以終止顯色。用酶標(biāo)儀測(cè)定OD450nm值，根據(jù)已經(jīng)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析 利用組織RNA提取試劑盒提取子宮黏膜總RNA。通過測(cè)定OD260值檢測(cè)RNA的濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。依據(jù)TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA第一鏈。

cDNA樣品梯度稀釋后構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸分析。利用real-time PCR反應(yīng)的S動(dòng)力學(xué)曲線和解離曲線檢測(cè)方法是否可靠。使用SYBR Pre?mix Ex Tag試劑盒，25μL體系進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR：上、下游引物（10 pmol/μL）各1μL，模板cD?NA 2.5μL，Rox Reference DyeⅡ1.7μL，緩沖液11 μL，滅菌雙蒸水7.8μL。反應(yīng)條件為：95℃35 s；95℃ 5 s，60 ℃ 40 s，60 ℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)孔，采用相對(duì)定量法分析結(jié)果。

2.5 Western Blot分析 子宮黏膜組織勻漿后，加入預(yù)先裂解液，置于搖床緩慢震蕩5 min，然后10000 r/min（4℃）離心20 min，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析，并用半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜，50 g/L脫脂乳封閉2 h，然后4℃，孵育一抗，過夜。TBST漂洗4次，每次5 min，孵育二抗?；瘜W(xué)發(fā)光ECL顯色，觀察。

3 結(jié)果

3.1 炎性細(xì)胞因子分泌情況 將收集到的子宮內(nèi)膜樣品標(biāo)記后，利用勻漿器進(jìn)行組織勻漿。12000 r/min離心后收集上清液，棄去沉淀。按照TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒說明書操作進(jìn)行測(cè)定。用酶標(biāo)儀測(cè)OD450nm值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組樣品中TNF-α、IL-1β、IL-6的濃度。結(jié)果如圖1所示。大腸桿菌刺激后，炎性因子均明顯上升。TNF-α、IL-1β變化尤為明顯，分泌量增加（P＜0.05）。IL-6也有所升高，但變化不大（P＜0.05）。子宮灌注無菌的液體培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)組TNF-α、IL-1β、IL-6略微有所增多，但無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 炎性細(xì)胞因子分泌水平

3.2 TLR4基因及蛋白表達(dá)變化 TLR4是識(shí)別革蘭陰性菌的主要受體蛋白。試驗(yàn)結(jié)果顯示，大劑量的大腸桿菌作用于牛的子宮內(nèi)膜組織，TLR4 mRNA表達(dá)水平明顯升高（如圖2a所示）。進(jìn)一步對(duì)TLR4蛋白表達(dá)進(jìn)行分析，與A、B組相比，C組大腸桿菌刺激能明顯地增加TLR4蛋白的表達(dá)（P＜0.05）。表明大腸桿菌刺激能促進(jìn)TLR4 mRNA及LR4蛋白的表達(dá)（如圖2b所示）。

圖2 TLR4基因及蛋白表達(dá)水平

3.3 NF-κB信號(hào)通路的影響 NF-κB信號(hào)通路與炎癥關(guān)系非常緊密，是TLR4下游的關(guān)鍵調(diào)控節(jié)點(diǎn)。為進(jìn)一步研究大腸桿菌的致炎機(jī)制，對(duì)NF-κB信號(hào)通路進(jìn)行檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，給予大腸桿菌刺激牛的子宮內(nèi)膜組織后，NF-κB mRNA表達(dá)水平明顯升高（如圖3a所示），其抑制蛋白I-κB mRNA表達(dá)也明顯升高（見圖3b）。對(duì)NF-κB蛋白分析發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌對(duì)NF-κB蛋白表達(dá)無影響，但會(huì)促進(jìn)NF-κB磷酸化。相對(duì)應(yīng)的，大腸桿菌刺激明顯地增加了I-κB磷酸化蛋白的表達(dá)（P＜0.05）。表明大腸桿菌刺激NF-κB蛋白磷酸化，并促進(jìn)I-κB與NF-κB蛋白的解離，從而減少其抑制作用（如圖4所示）。

4 討論

圖3 NF-κB與I-κB基因表達(dá)水平

圖4 NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平

大腸桿菌引發(fā)急性子宮內(nèi)膜炎與TLR4密切相關(guān)。子宮內(nèi)膜組織TLR4發(fā)揮對(duì)大腸桿菌的識(shí)別作用，受到大腸桿菌刺激后TLR4表達(dá)增加。進(jìn)一步激活NF-κB信號(hào)通路的NF-κB蛋白磷酸化及I-κB與NF-κB蛋白的解離，NF-κB入核啟動(dòng)相關(guān)因子基因，從而導(dǎo)致TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性細(xì)胞因子表達(dá)增多。由于這種刺激呈現(xiàn)暴發(fā)式的反映效果，所以患牛在TNF-α、IL-1β、IL-6作用下，表現(xiàn)出典型的臨床癥狀。

5 結(jié)論

結(jié)果表明，奶牛子宮內(nèi)膜組織表達(dá)TLR4受體。大腸桿菌引發(fā)奶牛子宮內(nèi)膜炎過程與TLR4的作用密切相關(guān)，其導(dǎo)致的信號(hào)通路活化和炎性細(xì)胞因子的分泌，可能受到TLR4的調(diào)節(jié)。大腸桿菌刺激后，炎性因子均明顯上升。TLR4基因及蛋白表達(dá)、NF-κB蛋白磷酸化都有所增強(qiáng)。

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