孫佩甫+郎越+裴新梧+袁潛華

摘要：以7個普通野生稻（Oryza rufipogon Griff.）和3個栽培稻（Oryza sativa L.）為材料，研究普通野生稻的花器性狀和異交結(jié)實率及其相關(guān)性。結(jié)果表明，普通野生稻的花藥長度和寬度、柱頭長度和寬度及花粉量均比栽培稻大，但其花粉粒大小、花粉活力、花粉可育度和套袋自交結(jié)實率均比栽培稻小。相關(guān)分析結(jié)果表明，普通野生稻的花藥長度與花藥寬度、花粉量與花藥寬度、柱頭長度與柱頭寬度、柱頭寬度與花柱夾角分別呈顯著正相關(guān)，花粉可育度與花粉活力呈極顯著正相關(guān)；普通野生稻與栽培稻的異交結(jié)實率與其花器性狀和套袋自交結(jié)實率之間無顯著相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：普通野生稻（Oryza rufipogon Griff.）；花器性狀；自交結(jié)實率；異交結(jié)實率

中圖分類號：S511 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）10-2317-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.10.004

普通野生稻（Oryza rufipogon Griff.）是目前中國三種野生稻中分布最廣的一種野生稻，一般分布在熱帶、亞熱帶等溫度相對較高、雨量充沛的地區(qū)[1]，尤其以海南省的分布密度最大，在海南省絕大部分縣（市）如?？凇⑽牟?、萬寧、東方等地區(qū)均有廣泛分布。普通野生稻長期在自然條件下適應(yīng)環(huán)境的變化，具有復(fù)雜的遺傳背景和豐富的遺傳多樣性，含有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病蟲、耐逆境等優(yōu)異基因， 是亞洲栽培稻（Oryza sativa L.）育種的重要基因源[2]。普通野生稻與栽培稻同屬AA型基因組，親緣關(guān)系較近，兩者雜交可以獲得種子，轉(zhuǎn)基因水稻可以通過花粉擴(kuò)散向普通野生稻產(chǎn)生基因漂流[3]。外源基因逃逸到作物的野生近緣種中可直接或間接地影響這些野生種群的遺傳和生態(tài)適應(yīng)性，進(jìn)而影響該野生種群的生態(tài)和進(jìn)化方向[4]，因而一些研究者開展了水稻向野生稻的基因漂流研究。在田間自然狀況下，Song等[5]，Chen等[6]和Wang等[7]對栽培稻或轉(zhuǎn)基因水稻向普通野生稻的基因漂流進(jìn)行了評估。結(jié)果表明，向普通野生稻的最大基因飄流頻率分別為2.94%，1.21%～2.19%和11.24%～18.00%，數(shù)值介于向不育系和常規(guī)稻的基因漂流頻率之間[8]。從不同研究者的研究結(jié)論來看，漂流頻率有著較大差異，這種差異主要是因為研究者采用了不同的普通野生稻居群作為受體材料，而遺傳多樣性較高的普通野生稻是高度雜合的群體[2，7]，其群體中存在部分不育株和半不育株，且野生稻的柱頭外露率高、容易接受外來花粉[9]，因此在基因漂流研究中作為受體的野生稻居群不同。會產(chǎn)生不同的基因漂流研究結(jié)果。為了客觀比較和評價轉(zhuǎn)基因水稻向不同普通野生稻的基因漂流頻率，有必要研究同等試驗條件下、不同居群普通野生稻與栽培稻在人工雜交授粉條件下的異交結(jié)實率，比較不同普通野生稻居群與栽培稻的雜交親和性，進(jìn)而評價基因漂流率差異及其原因。另一方面，普通野生稻的花器性狀是否通過影響異交結(jié)實率來影響基因漂流率是值得關(guān)注的問題，已有相關(guān)學(xué)者研究了雜交水稻不育系花器特征與異交結(jié)實率的關(guān)系，但未見對普通野生稻的花器性狀與異交結(jié)實率關(guān)系的相關(guān)報道。因此需要對普通野生稻的花器性狀、自交結(jié)實率及與栽培稻的異交結(jié)實性進(jìn)行相關(guān)分析，這對于水稻育種中野生稻資源利用和轉(zhuǎn)基因水稻向普通野生稻的基因漂流研究均具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗采用7個居群的普通野生稻和3個栽培稻品種（系），普通野生稻包括海南?？?、文昌、東方H、東方B（相同縣市普通野生稻編號以村名首字母為代號，以區(qū)別同一地區(qū)兩種不同的野生稻居群）、萬寧和廣西桂平、來賓居群。栽培稻包括雜交水稻恢復(fù)系9311（揚稻6號）、3550和轉(zhuǎn)bar基因水稻Bar9311（簡稱B9）。其中9311為兩系雜交稻恢復(fù)系，生育期適中，花粉量中等，株型集散適中，莖稈粗壯，穗大粒重，生育后期光合優(yōu)勢強[10]。3550的生育期中等，莖稈粗壯，株型好；抗稻瘟病，恢復(fù)力強；配合力好，穗粒數(shù)多，開花散粉時間長[11，12]。B9為抗除草劑的轉(zhuǎn)基因秈稻品種，中國科學(xué)院亞熱帶生態(tài)研究所肖國櫻教授用基因槍法將bar基因?qū)雰上惦s交早稻恢復(fù)系D68，獲得抗除草劑草銨膦的水稻恢復(fù)系 Bar68-1、從9311×Bar68-1分離后代中，篩選出抗除草劑的穩(wěn)定株系，該株系生育期長、株高較高、穗長、穗粒數(shù)多、產(chǎn)量潛力大[13]，3種栽培稻是研究異交結(jié)實的良好材料。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計 2013年，供試材料于海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院海甸試驗基地進(jìn)行播種，為了使供試材料花期相遇時間較長，分別在7月13日、7月19日、7月24日和7月28日對3種栽培稻分期播種。每期每品種10行，每行10株，行距約為16.7 cm×20.0 cm。

1.2.2 柱頭和花藥形態(tài)性狀的測定 在普通野生稻和栽培稻的開花期，隨機選取參試材料的不同稻穗中上部的5個即將開花的穎花制片[14]，在ZEISS Primo Star顯微鏡下配合AxioCam ERc 5s對柱頭和花藥進(jìn)行拍照，用Image-Pro Plus軟件測量柱頭長度、柱頭寬度、花柱夾角、花藥寬度和長度。

1.2.3 花粉相關(guān)性狀的測定 于7：00～8：00隨機采集稻穗插入盛有適量水的錐形瓶中，選取穎花，將單個穎花中的全部花藥放入1.5 mL 離心管中，加入1.0 mL去離子水，10 000 r/min離心 2 min，再渦旋混勻，用2.5 μL移液槍吸取1.0 μL溶液滴在載玻片上[14，15]，在顯微鏡下計數(shù)其中的花粉數(shù)量，根據(jù)稀釋倍數(shù)計算單個花藥的花粉量。在顯微鏡下結(jié)合測量軟件測定花粉粒直徑，即花粉粒大小。采用I2-KI染色法測定花粉可育度[16-19]，采用氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法測量花粉活力[20]。endprint

1.2.4 自交結(jié)實率和人工雜交結(jié)實率的測定 調(diào)查稻穗套袋自交結(jié)實率和人工異交結(jié)實率，使用透明、防雨、透氣的羊皮紙袋并固定羊皮紙袋于竹竿上，防止大風(fēng)折斷穗莖[21]。測定人工異交結(jié)實率需要采用溫湯去雄并結(jié)合剪穎法并進(jìn)行人工輔助授粉，當(dāng)普通野生稻開花時，用高20 cm的保溫壺裝滿45 ℃的溫水，溫湯5 min[22]，一次浸泡2～4穗普通野生稻的稻穗，使花粉致死，并剪去穎殼的1/3便于接受花粉。采集7：00～9：00的栽培稻植株花粉以捻穗法對野生稻進(jìn)行離體授粉2～3 d[23]。每個居群的野生稻設(shè)置2穗空白對照，采用溫湯去雄并剪穎，但不進(jìn)行授粉。于授粉后第25～30天收集種子，計算人工異交結(jié)實率。使用SPSS軟件統(tǒng)計測量數(shù)據(jù)并進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 普通野生稻、栽培稻花藥和柱頭形態(tài)性狀比較

由表1可知，普通野生稻居群中花藥長度為4.40～6.24 mm，栽培稻的花藥長度為1.99 mm～2.63 mm，普通野生稻的花藥長度均值（5.09 mm）較栽培稻花藥長度均值（2.37 mm）長2.72 mm，所有供試的普通野生稻花藥長度均較栽培稻長。普通野生稻花藥寬度為0.42～0.93 mm，栽培稻的花藥寬度為0.53～0.65 mm，栽培稻的花藥寬度均值（0.60 mm）較普通野生稻的花藥寬度均值（0.68 mm）小0.08 mm。供試材料中普通野生稻的柱頭長度為1.50 ～2.79 mm，栽培稻的柱頭度長為1.26～1.77 mm，普通野生稻的柱頭長度均值（1.97 mm）較栽培稻的柱頭長的均值（1.55 mm）長0.42 mm。普通野生稻柱頭寬度為0.45～0.92 mm，栽培稻中柱頭寬度0.35～0.48 mm，普通野生稻的柱頭寬度均值為0.68 mm，除了文昌的柱頭寬與栽培稻的柱頭寬相近，其余的普通野生稻柱頭寬均較栽培稻的長。普通野生稻的花柱夾角均值為112.4°，較栽培稻的花柱夾角均值（92.6°）大19.8°?？梢娖胀ㄒ吧镜幕ㄋ庨L和花藥寬、柱頭長和柱頭寬均比栽培稻長，花柱夾角的均值也略大于栽培稻。

2.2 普通野生稻和栽培稻的花粉相關(guān)性狀及套袋自交結(jié)實率的比較

由表2可知，供試材料中普通野生稻的花粉粒大小為37.95～43.67 μm，栽培稻的花粉粒大小為44.91～46.82 μm，栽培稻的花粉粒大小均值（45.93 μm）較普通野生稻的均值（40.76 μm）大5.17 μm（表2）。有相關(guān)研究表明栽培稻的花粉粒大小為36～56 μm，多數(shù)在42～50 μm的范圍內(nèi)[24]，本研究的栽培稻的花粉粒直徑在多數(shù)水稻花粉粒大小的范圍內(nèi)，但普通野生稻的花粉粒直徑偏小。

普通野生稻居群中花粉數(shù)量為1 938～3 683粒，栽培稻的花粉量為605～1 315粒。楊弘遠(yuǎn)[24]調(diào)查了4個栽培稻品種的一個花藥內(nèi)約有1 000粒左右的花粉量，與本研究的栽培稻的花粉量基本一致，其中栽培稻3550的花粉量偏小，而普通野生稻的花粉量遠(yuǎn)大于栽培稻的花粉量。栽培稻品種中花粉可育度在91.34%以上，花粉活力在86.18%以上，而普通野生稻的花粉可育度為23.34%～94.58%，花粉活力為37.97%～94.63%，兩項指標(biāo)的均值均較栽培稻小。

普通野生稻居群的自交結(jié)實率為15.05%～62.21%，均值為31.89%，變化范圍比較大；栽培稻的自交結(jié)實率在69.86%～74.12%，均值為72.51%，且變化范圍較小，表明栽培稻品種套袋自交結(jié)實率穩(wěn)定。栽培稻的自交結(jié)實率明顯較普通野生稻高，可能與栽培稻經(jīng)過長期的人工農(nóng)藝性狀選擇有關(guān)。另一方面，栽培稻的花粉粒大小較普通野生稻大，且花粉可育度和花粉活力均較普通野生稻大，花粉粒貯存的淀粉等營養(yǎng)物質(zhì)多，因而其花粉粒萌發(fā)能力及花粉管伸長均具有優(yōu)勢，從而更容易受精結(jié)實。

2.3 普通野生稻與栽培稻的異交結(jié)實性分析

以普通野生稻為母本、栽培稻為父本進(jìn)行人工雜交。本試驗中對普通野生稻先進(jìn)行人工去雄，再進(jìn)行人工授粉，配置雜交組合，各組合的異交結(jié)實率見表3。由表3可知，空白對照所獲得的雜交種子均為0，說明人工雜交過程中去雄效果好，無自交結(jié)實現(xiàn)象的干擾。雜交組合中來賓×9311異交結(jié)實率最高，為11.24%，說明在這些組合中來賓與9311親和性最好，桂平×B9（5.26%）和桂平×9311（4.97%）也較高，而?？谂c三種栽培稻的異交結(jié)實率很低，文昌×3550的異交結(jié)實率為0，雜交親和性最差。普通野生稻與栽培稻的異交結(jié)實率不同，說明栽培稻與不同普通野生稻的親和性不同。同時不同栽培稻與同一種普通野生稻的異交結(jié)實率也有差異。

根據(jù)表3數(shù)據(jù)可以求得所有普通野生稻與栽培稻雜交的平均異交結(jié)實率。B9、9311和3550的平均異交結(jié)實率分別為1.67%、3.26%和1.04%，以9311平均異交結(jié)實率最大，最小為3550。普通野生稻與所有的栽培稻的平均異交結(jié)實率大小依次為來賓（4.48%）>桂平（3.77%）>東方B（2.80%）>東方H（1.02%）>萬寧（0.90%）>文昌（0.53%）>海口（0.40%）。廣西來賓和桂平的平均異交結(jié)實率相對最高，?？谧畹?。海南野生稻中以東方B、東方H較高，其他的海南野生稻的平均異交結(jié)實率均低于1.00%。廣西普通野生稻居群與栽培稻的平均異交結(jié)實率均比海南居群高，說明兩地的普通野生稻與栽培稻的異交結(jié)實能力差異較大。

2.4 普通野生稻套袋自交結(jié)實率與其花器性狀的相關(guān)性分析

用SPSS統(tǒng)計軟件對測量的普通野生稻的花器性狀和自交結(jié)實率數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果如表4所示。相關(guān)性分析結(jié)果表明，花藥長度與柱頭長度、花粉量與花藥寬度、柱頭長度與柱頭寬度、柱頭寬度與花柱夾角呈顯著正相關(guān)（表4）；花粉可育度與花粉活力呈極顯著正相關(guān)。前人研究表明，TTC染色法是檢測水稻花粉活力最佳方法之一，其測定值與離體培養(yǎng)法的測定結(jié)果相近[25]，本研究得出花粉活力和花粉可育度高度相關(guān)，說明TTC染色法和I2-KI染色法均為檢測水稻花粉生活力和成熟度的有效方法，成熟的花粉活力較高。普通野生稻的自交結(jié)實率與其花器性狀無顯著或極顯著相關(guān)性，但與花粉量呈低度負(fù)相關(guān)，可見普通野生稻的花粉數(shù)量多并不能表示其具備較多的有活力的花粉。endprint

2.5 普通野生稻異交結(jié)實率與其雌蕊形態(tài)性狀的相關(guān)性

普通野生稻與3種栽培稻的異交結(jié)實率的相關(guān)性分析表明，普通野生稻（與栽培稻）的異交結(jié)實率和普通野生稻的雌蕊形態(tài)性狀的相關(guān)性未達(dá)到顯著水平（表5），與其自交結(jié)實率也無顯著的相關(guān)關(guān)系。但普通野生稻與不同栽培稻的異交結(jié)實率與柱頭長等雌蕊形態(tài)性狀的相關(guān)系數(shù)存在差異，說明普通野生稻的異交結(jié)實率與栽培稻的品種選擇有關(guān)。

3 小結(jié)與討論

不同研究者對于水稻基因漂流進(jìn)行了研究，但獲得的基因漂流頻率有較大差異。而基因漂流頻率實際上在某種意義上反映了異交結(jié)實率，理論上異交結(jié)實較好的材料更容易接受外來花粉，形成較高的基因漂流頻率。為了比較不同居群普通野生稻的漂流頻率，研究栽培稻與不同普通野生稻居群的異交結(jié)實率是必要的。但普通野生稻是雜合體[2，7]，一些群體中存在部分不育和半不育株，為了防止自身花粉影響到異交結(jié)實，需要人工去除自身可育花粉，對普通野生稻先采用溫湯等方法去雄，再行人工授粉雜交，以獲得真實的異交結(jié)實率。

在田間自然狀況下，栽培稻或轉(zhuǎn)基因水稻向普通野生稻的最大基因飄流頻率為1.21%～18.00%， 該數(shù)值介于向不育系和常規(guī)稻的基因漂流頻率之間[5-8，26]。本試驗通過栽培稻與不同普通野生稻的人工雜交，研究普通野生稻的異交結(jié)實率，其范圍為0%～11.24%，平均值為1.99%。但需要指出的是，盡管基因飄流頻率與試驗的異交結(jié)實率屬性相似，但計算方法有較大差異。在轉(zhuǎn)基因水稻基因漂流研究過程中，其試驗設(shè)計一般是在試驗中心設(shè)一個轉(zhuǎn)基因稻樣方， 周圍種植非轉(zhuǎn)基因稻或其親緣種，于水稻成熟期在不同方向的不同距離上取一定面積的樣方或一定數(shù)量的植株或種子， 分析植株或成熟種子轉(zhuǎn)基因存在的頻率[27]，即作為轉(zhuǎn)基因傳粉的頻率，以評價外源轉(zhuǎn)基因通過授粉雜交途徑的擴(kuò)散過程。這種方法會因外來花粉（或自身花粉，如野生稻）競爭大小造成結(jié)實率高低不同，從而影響基因漂流頻率的計算值。但如果參試的受體為雜交水稻的不育系時，由于不育系自身無可育花粉或者無花粉，其結(jié)實率高低受外來花粉多少的影響較大，而當(dāng)周圍無常規(guī)水稻競爭花粉、只有轉(zhuǎn)基因供體花粉的情況下，授粉全部來自于轉(zhuǎn)基因花粉源，結(jié)實的子粒全部或絕大部分為轉(zhuǎn)基因種子，只有極少數(shù)來自于不純的不育系雜株，這樣估算的基因漂流頻率往往偏高。對于雜合群體的普通野生稻，群體中不育株或半不育株的數(shù)量將影響到競爭花粉的數(shù)量，進(jìn)而影響基因漂流頻率。而異交結(jié)實率反映的是受體異交結(jié)實的能力，在自然條件下其接受的花粉既可來自普通野生稻自身，也可來自外來花粉。本試驗中人工異交結(jié)實率遠(yuǎn)低于其套袋自交結(jié)實率，除了與雜交親和性有關(guān)外，可能還與人工去雄對普通野生稻雌蕊器官造成傷害進(jìn)而影響授粉有關(guān)。

普通野生稻自交結(jié)實和異交結(jié)實的研究中，大田試驗中下雨天氣往往使套袋潮濕甚至霉變，影響受（授）精結(jié)實，造成空粒或雜交稻穗的損失，而且普通野生稻植株較高且莖稈細(xì)小易折使人工輔助授粉困難，使得人工去雄雜交過程非常艱難，樣本數(shù)量難以達(dá)到栽培稻之間進(jìn)行人工雜交獲得種子的數(shù)量級。

影響異交結(jié)實的花器性狀很多， 柱頭外露率是其中非常重要的因素。在雜交水稻制種中一般圍繞提高母本柱頭外露率、 父母本開花時相遇率等調(diào)節(jié)措施來提高制種產(chǎn)量， 并改進(jìn)授粉技術(shù)。龍俐華等[28]以三系不育系為材料， 研究結(jié)果表明， 雜交水稻制種中柱頭外露率與異交結(jié)實率呈極顯著相關(guān)（r=0 .966 7）。但不同居群的普通野生稻的柱頭外露率均較高，差異較小，大多高于95%[29]，因此本研究不考慮柱頭外露率與其他花器性狀及自交、異交結(jié)實率的關(guān)系。

水稻的柱頭長寬、花藥長寬與柱頭夾角等花器形態(tài)性狀與異交結(jié)實率的相關(guān)研究表明，粳稻三系不育系的異交結(jié)實率與其花柱長度呈極顯著正相關(guān)，而花藥長與柱頭長、柱頭長與柱頭寬無顯著相關(guān)性[30]；恢復(fù)系柱頭長寬與花柱夾角無顯著相關(guān)，而花粉量與花藥長度呈極顯著線性正相關(guān)（r=0.911 2），與花藥寬度的正相關(guān)系數(shù)雖然也很高，但未達(dá)到顯著水平（r=0.679 7）[14]。本試驗對普通野生稻雌蕊花器性狀和自交結(jié)實率相關(guān)性分析結(jié)果表明，普通野生稻的花藥長與柱頭長、柱頭長與柱頭寬、柱頭寬與花柱夾角、花粉量與花藥寬分別呈顯著正相關(guān)，花粉可育度和花粉活力呈極顯著正相關(guān)。異交結(jié)實率與自交結(jié)實率和雌蕊花器形態(tài)性狀的相關(guān)分析表明，普通野生稻的雌蕊形態(tài)性狀對其（與栽培稻的）異交結(jié)實率和自交結(jié)實率無顯著影響，這與張忠旭[14]和全東興等[30]在雜交水稻上的研究結(jié)果有差異。

柱頭活力關(guān)系到花粉飄落到柱頭之后能否萌發(fā)、花粉管能否生長，所以柱頭活力直接關(guān)系到受精的成敗。普通野生稻的柱頭活力也應(yīng)影響其異交結(jié)實進(jìn)而影響基因漂流率。在植物界中，柱頭活力持續(xù)時間的長短因植物種類而異，水稻一般能維持6～7 d，以開花當(dāng)天相關(guān)活力最強，以后逐漸下降。在雜交水稻制種實踐中，不育系柱頭活力強有利于異交結(jié)實和制種產(chǎn)量的提高[31，32]。研究柱頭活力一般針對不育系材料， 對不育系的穎花進(jìn)行處理， 通過人工授粉的結(jié)實率高低來衡量開花后不同天數(shù)的外露柱頭活力。但對于野生稻， 由于自身含有可育花粉，通過異交結(jié)實率判定柱頭活力或會導(dǎo)致誤差， 若用溫湯去雄等方法也會在一定程度上傷害柱頭等雌蕊器官， 影響柱頭活力研究的準(zhǔn)確性。因此對野生稻柱頭活力的評價方法尚有待于進(jìn)一步研究。

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