韓建軍 寧娜 郁建生

摘要：為了優(yōu)化超高壓提取三七（Panax notoginseng）總皂苷的提取工藝，利用Box-Benhnken 中心組合設(shè)計(jì)原理和響應(yīng)面分析法，在單因素基礎(chǔ)上，以三七總皂苷提取率為響應(yīng)值，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取壓力、料液比和提取時間4個因素，研究各因素及其交互作用對總皂苷提取率的影響。結(jié)果表明，優(yōu)化的提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)71%、提取壓力403 MPa、料液比1∶71（g∶mL）、提取時間5 min。在此條件下三七總皂苷實(shí)際提取率為11.82%，與理論預(yù)測值（11.91%）的相對誤差僅為0.76%。

關(guān)鍵詞：三七（Panax notoginseng）；總皂苷；響應(yīng)面法；超高壓

中圖分類號：R284.2；S567.23+6 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）10-2455-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.10.040

中藥三七為五加科人參屬植物三七（Panax notoginseng）的干燥根，具有活血化瘀、消腫止痛、止血等功效，為中國傳統(tǒng)名貴中藥材[1]。三七含有皂苷類、揮發(fā)油、黃酮類等多種成分[2]。其中，2010版《中華人民共和國藥典》[3]將總皂苷類成分作為三七藥材的質(zhì)量指標(biāo)，包括人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1。在臨床上，三七總皂苷用于心血管疾病的治療[4，5]。目前已報(bào)道的三七總皂苷的提取方法有滲漉法、浸漬法、回流法、微波法[6]等，但這些方法不同程度地存在提取時間長、效率低，且由于長時間加熱會造成皂苷活性的降低、損失等問題。超高壓提取技術(shù)是在常溫條件下提取植物中有效成分的新技術(shù)。與傳統(tǒng)提取技術(shù)相比，超高壓提取技術(shù)可以縮短提取時間、降低能耗、減少雜質(zhì)成分溶出的同時，提高有效成分的得率，而且超高壓提取是在常溫下進(jìn)行的，避免了活性成分的受熱分解[7，8]。

目前中藥提取工藝優(yōu)化過程中，數(shù)理統(tǒng)計(jì)常用正交設(shè)計(jì)或均勻設(shè)計(jì)進(jìn)行擬合，雖然試驗(yàn)次數(shù)少，但精密度不夠，對于非線性擬合的模型不適合。而Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)屬于效應(yīng)面法的一種設(shè)計(jì)，可在因素與響應(yīng)值之間建立數(shù)學(xué)模型，通過對數(shù)學(xué)模型的處理得出多變量間的相互關(guān)系與影響因素。本試驗(yàn)以三七總皂苷提取率為指標(biāo)，采用超高壓提取技術(shù)，結(jié)合單因素試驗(yàn)和Box-Behnken設(shè)計(jì)對三七總皂苷的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化[9，10]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 三七藥材購于貴州省銅仁市藥材市場，經(jīng)銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院梁玉勇教授鑒定為五加科人參屬植物三七的根，經(jīng)干燥后粉碎過60目篩，備用；三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1標(biāo)準(zhǔn)品均購于中國藥品生物制品鑒定所（批號分別為：110745-201318、110703-201128和110704-201424）；乙腈（美國Tedia公司）為色譜純；其他試劑均為分析純；水為去離子水。

1.1.2 儀器與設(shè)備 美國安捷倫公司Agilent-1200LC高效液相色譜系統(tǒng)（包括G1311A四元梯度泵、G1313A標(biāo)準(zhǔn)型自動進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱、G1314A紫外檢測器、Agilent Chemstation 色譜工作站）；UHP 900×2-Z超高壓處理裝置（包頭超高壓儀器廠）；Sartorius BP 211D型電子天平（德國賽多利斯股份公司）；UV-2012PCS型紫外可見光分光光度計(jì)（尤尼柯上海有限公司）；SK5200HP型超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱為DIKMA Diamonsil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）與水（B），線性梯度洗脫程序見表1；流速：1.0 mL/min； 檢查波長：203 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。理論塔板數(shù)按三七皂苷峰計(jì)算應(yīng)不低于4 000。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精密稱取三七皂苷R1 10.4 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制得三七皂苷R1貯備液（1.04 mg/mL）。精密稱取人參皂苷Rg1 10.1 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制得人參皂苷Rg1貯備液（1.01 mg/mL）。精密稱取人參皂苷Rb1 10.2 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制得人參皂苷Rb1貯備液（1.02 mg/mL）。精密吸取1 mL 三七皂苷R1貯備液、4 mL人參皂苷Rg1貯備液、4 mL人參皂苷Rb1貯備液于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得濃度分別為0.104、0.404、0.408 mg/mL的R1、Rg1、Rb1三七標(biāo)準(zhǔn)混合溶液。

1.2.3 供試品溶液的制作 精密稱取藥材粉末適量，按照料液比1∶40（g∶mL，下同）加入三氯甲烷，回流提取3 h，過濾除去濾液，濾渣揮干溶劑后即得脫脂樣品。精密稱取4.0 g三七脫脂樣品，按響應(yīng)面設(shè)計(jì)的工藝進(jìn)行超高壓提取。提取液經(jīng)過濾、離心后，減壓回收乙醇，冷凍干燥，得到三七醇提物浸膏。精密稱取各組浸膏0.5 g，加甲醇溶于100 mL容量瓶中，定容、離心，取上清液，過0.45 μm濾膜，即得供試品溶液。三七總皂苷提取率=（浸膏中總皂苷含量/藥材質(zhì)量）×100%，其中，總皂苷包括三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液2、4、8、12、16、20 μL分別注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件來測定，測定3個皂苷成分的吸收峰面積。以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)（X），吸收峰面積為縱坐標(biāo)（A）進(jìn)行線性回歸，求回歸方程，并測定該試驗(yàn)的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、加樣回收率等指標(biāo)。

1.3 單因素試驗(yàn)

1.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù) 設(shè)定提取壓力400 MPa，料液比1∶60，提取時間4 min，分別加入40%、50%、60%、70%、80%的乙醇進(jìn)行超高壓提取。

1.3.2 提取壓力 以70%乙醇為提取溶劑，設(shè)定料液比1∶60，提取時間4 min，分別在100、200、300、400、500 MPa下進(jìn)行超高壓提取。

1.3.3 料液比 以70%乙醇為提取溶劑，設(shè)定提取壓力400 MPa，提取時間4 min，分別按1∶20、 1∶40、1∶60、1∶80、1∶100的料液比進(jìn)行超高壓提取。

1.3.4 提取時間 以70%乙醇為提取溶劑，設(shè)定提取壓力400 MPa，料液比1∶60，分別超高壓提取1、2、3、4、5 min。

1.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)（X1）、提取壓力（X2）、料液比（X3）和提取時間（X4）4個因素為自變量，以三七總皂苷提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面分析，因素與水平見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 三七HPLC圖及方法學(xué)評價(jià)結(jié)果

由圖1可知，在“1.2.1”色譜條件下，三七中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1與人參皂苷Rb1成分達(dá)到較好的分離效果。線性回歸方程分別為：A=507.45X-34.16，r=0.999 8；A=587.75X+94.40，r=0.999 9；A=567.03X+72.62，r=0.999 9。結(jié)果表明，三七皂苷R1含量在0.208～2.080 μg、人參皂苷Rg1含量在0.808～8.080 μg、人參皂苷Rb1含量在0.816～8.160 μg與峰面積呈良好的線性關(guān)系。精密度試驗(yàn)中，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1與人參皂苷Rb1的RSD分別為1.02%、1.07%和0.97%，說明儀器精密度良好。重復(fù)性試驗(yàn)中，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1與人參皂苷Rb1的RSD分別為0.52%、0.47%和0.57%，說明方法的重復(fù)性良好。穩(wěn)定性試驗(yàn)中，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1與人參皂苷Rb1的RSD分別為0.87%、0.71%和0.67%，說明在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。加樣回收試驗(yàn)中，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1與人參皂苷Rb1的平均加樣回收率分別為100.3%、100.1%和99.8%，RSD分別為0.43%、0.55%和0.49%。上述結(jié)果表明，該HPLC法適于三七皂苷R1、人參皂苷Rg1與人參皂苷Rb1的含量測定。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

各因素對總皂苷提取率的影響見圖2。由圖2A可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，三七總皂苷提取率增大，但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過70%，組織細(xì)胞滲透性下降，引起總皂苷溶出量降低，因此最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。由圖2B可知，在100～400 MPa，三七皂苷提取率隨著提取壓力的增加而增加，當(dāng)提取壓力超過400 MPa后，提取率有所下降，可能與提取壓力過大引起其他雜質(zhì)成分溶出有關(guān)。由圖2C可知，在1∶20～1∶60，總皂苷提取率隨著提取溶劑用量增加而增加，當(dāng)料液比低于1∶60時，皂苷的溶出量增加緩慢。從提取效果和溶劑用量等方面考慮，最佳料液比為1∶60。由圖2D可知，1～4 min內(nèi)皂苷提取率隨著提取時間的增加而增加，時間超過4 min后，提取率增加略有下降，可能隨著提取時間延長，其他雜質(zhì)溶出導(dǎo)致溶液總?cè)苜|(zhì)溶度增加，引起皂苷的溶出傳質(zhì)阻力增加，提取率反而下降。因此最佳提取時間為4 min。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 二次響應(yīng)面回歸模型的建立與分析 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。采用Design Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)軟件對表3數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到二次多項(xiàng)回歸方程：Y=-127.488 33+1.992 83X1+0.081 367X2+0.226 58X3+18.586 67X4-2.025 00×10-4X1X2-1.925 00 ×10-3 X1X3-0.072 000X1X4+1.350 00×10-4X2X3-2.825 00×10-3X2X4+4.750 00×10-3X3X4-0.010 179 X12-7.816 67×10-5X22-1.197 92×10-3X32-1.307 92 X42。對該模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，方差分析結(jié)果見表4。由表4可知，模型極顯著（P<0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.188 07>0.05），其R2=0.919 9，校正R2=0.839 7，說明模型對試驗(yàn)擬合較好。回歸方程各項(xiàng)分析表明，該回歸模型的一次項(xiàng)中X3和X4極顯著影響三七總皂苷提取率；二次項(xiàng)中X12、X22、X32、X42均極顯著影響三七總皂苷提取率；交互項(xiàng)中X1X4極顯著影響三七總皂苷提取率。根據(jù)F大小可判斷，各個單因素對總皂苷提取率影響作用依次為：X3>X4>X2>X1。

2.3.2 兩因子間交互作用分析 由各因素對響應(yīng)值構(gòu)成的三維空間曲面圖可直觀反映各因素間交互作用對響應(yīng)值的影響。觀察曲面的傾斜度可以確定兩因素交互作用對響應(yīng)值的影響程度，傾斜度越高，即坡度越陡，說明兩者交互作用越顯著。由圖3可知，在所選范圍內(nèi)存在極值，即響應(yīng)面的最高點(diǎn)。通過對比曲面傾斜度可知乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時間的交互作用對總皂苷提取率影響較顯著，這與方差分析結(jié)果一致。通過回歸模型的預(yù)測，得到超高壓提取三七總皂苷的最佳工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)70.97%、提取壓力402.89 MPa、料液比1∶70.74、提取時間4.87 min，在此條件下三七總皂苷理論提取率為11.91%。考慮到試驗(yàn)的可操作性，最佳工藝條件修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)71%、提取壓力403 MPa、料液比1∶71、提取時間5 min。在此條件下進(jìn)行5次平行試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，三七總皂苷平均提取率為11.82%，與理論預(yù)測值的相對誤差僅為0.76%，證明了該模型的有效性

3 小結(jié)

本試驗(yàn)采用超高壓工藝提取三七總皂苷，該方法時間短、耗能低，且提取是在常溫下進(jìn)行，避免了高溫對活性成分的影響。優(yōu)化所得的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)71%、提取壓力403 MPa、料液比1∶71、提取時間5 min，該優(yōu)化條件下的總皂苷的提取率為11.82%。

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