馬淑玲 孫新城 王富 張玲麗 張浩

摘要：采用菌絲生長速率法測定分離自實驗室的一株細菌對黃瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea）、辣椒疫病菌（Phytophthora capsici）、黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）的抑菌效果。結果表明，這株細菌對以上3種病原菌均有較好的抑制效果，其中對黃瓜灰霉病菌的抑制效果最好；細菌粗發(fā)酵液經(jīng)一定強度的溫度和酸堿處理后仍有一定的抑菌效果，抑菌效果在pH 5.1～9.0之間無顯著差異；用胰蛋白酶處理后拮抗活性無明顯變化；經(jīng)硫酸銨處理過的粗發(fā)酵液，其上清液與沉淀均具有抑菌活性。

關鍵詞：粗發(fā)酵液； 黃瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea）； 辣椒疫病菌（Phytophthora capsici）；黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）； 抑菌活性

中圖分類號：S436.3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）10-2377-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.10.018

植物病害每年給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的損害，化學農(nóng)藥的使用雖可有效地防治各種病害，但是大量連續(xù)使用化學農(nóng)藥會引起嚴重的環(huán)境污染和食品安全問題，進而為害人類的健康和生存質(zhì)量[1]。同時迫于農(nóng)業(yè)無公害、綠色、有機生產(chǎn)的迫切需要以及農(nóng)產(chǎn)品出口農(nóng)藥殘留等方面的限制要求，使研究和開發(fā)環(huán)境友好的生物農(nóng)藥進行生物防治成為目前世界農(nóng)藥發(fā)展的趨勢[2]。植物病害生物防治的防治因子包括微生物、抗生素等多種因素。具有生防潛力的微生物有細菌、真菌、放線菌和病毒等種類。這些微生物可通過與病原菌競爭生態(tài)位和營養(yǎng)物質(zhì)、分泌抗菌物質(zhì)、寄生病原菌等多種生防機制實現(xiàn)對植物病害的防治[3]?；颐共∈寝r(nóng)作物的主要病害之一，如何高效安全地進行灰霉病的防治是長期以來有待解決的難題。篩選對灰霉病菌有拮抗作用的微生物，從中開發(fā)出新型、高效、無毒天然農(nóng)用殺菌劑是防治灰霉病的重要途徑。安瑞平[4]采用組織分離法，從黃瓜各器官（根、莖、葉）中得到內(nèi)生細菌173株。通過平板對峙培養(yǎng)篩選出8株對黃瓜灰霉病菌具有較強拮抗作用的細菌，再對這8株菌發(fā)酵濾液的抑菌活性進行測定，選出抑菌效果最好的2個菌株B12和B13，抑制率分別為84.0%和81.8%[4]。張興鋒等[5]分離了紅樹植物（木欖）體內(nèi)的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）CⅢ-1菌株，對多種病原菌具有較強的抑制作用，該菌產(chǎn)生的抗菌蛋白液對疫霉菌等植物病原菌具有較強的拮抗作用，同時發(fā)現(xiàn)該抗菌蛋白對熱不穩(wěn)定。

本研究針對目前對黃瓜灰霉病、辣椒疫霉病、黃瓜枯萎病尚無高效生防菌株的問題，采用生長速率法測定細菌MSL2#對以上3種病原菌是否具有生防效果。同時研究了經(jīng)不同溫度和酸堿處理后，MSL2#菌發(fā)酵液對這三種蔬菜病原菌抑菌活性的變化，以期得到具有高效生防潛力的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 黃瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea）、辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）、黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporumf），細菌MSL2#（拮抗菌，待鑒定）均由鄭州輕工業(yè)學院實驗室分離提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、瓊脂15 g、葡萄糖20 g、去離子水1 000 mL。用于病原真菌的活化及培養(yǎng)。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏0.5 g、蛋白胨1 g、氯化鈉0.5 g、瓊脂2 g、去離子水1 000 mL。用于生防細菌的活化及培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 細菌活化 用接種環(huán)從試管中挑取MSL2#，接種于牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)3～4 d。

1.2.2 發(fā)酵液的制備 取在斜面中活化好的MSL2#，注入2 mL無菌水，配成菌懸液，搖勻后用移液器各移取1 mL接種至裝有150 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的三角瓶中，于37 ℃搖床培養(yǎng)3 d。

將發(fā)酵好的發(fā)酵液于高速冷凍離心機中12 000 r/min離心10 min，收集上清液于250 mL無菌三角瓶中，細菌過濾器對離心上清液進行過濾，收集濾液于250 mL無菌三角瓶中，即為粗發(fā)酵液，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 對病原真菌拮抗效果的測定 MSL2#對黃瓜灰霉病、辣椒疫霉病、黃瓜枯萎病3種病原真菌拮抗效果的測定采用抑制菌生長速率法，重復3次，用直徑為0.6 cm的打孔器在培養(yǎng)好的供試菌落邊緣切下菌餅，用接種環(huán)反接于培養(yǎng)皿內(nèi)，28 ℃培養(yǎng)4～5 d，用十字交叉法測量菌落擴展直徑，每個處理重復3次，計算抑菌率[6]。

1.2.4 熱處理對粗發(fā)酵液活性成分的影響 取5支10 mL滅過菌的離心管，分別加入5 mL粗發(fā)酵液，然后將這5支離心管分別于40、50、60、80、100 ℃水浴鍋內(nèi)處理15 min，采用抑制菌絲生長速率法以黃瓜灰霉病菌為指示菌進行拮抗效果測定，每個溫度處理設3個重復，同時設3個未加粗發(fā)酵液的對照；28 ℃恒溫培養(yǎng)，2、3、4、5、6 d后測量菌落擴展直徑，并計算抑制率[2]。

1.2.5 pH變化對拮抗菌粗發(fā)酵液拮抗活性的影響 取6支10 mL滅過菌的離心管，分別加入5 mL粗發(fā)酵液，用0.025 mol/LNa2CO3溶液和0.05 mol/L檸檬酸溶液分別將離心管中的粗發(fā)酵液調(diào)pH為9.0、7.0、6.1、5.1、4.4、3.8，處理24 h后，再調(diào)回發(fā)酵液最初pH。采用抑制菌絲生長速率法進行拮抗效果測定，每個pH處理設3個重復，同時設3個未加粗發(fā)酵液的對照；28 ℃恒溫培養(yǎng)4 d后測量菌落擴展直徑，并計算抑制率。

1.2.6 酶處理對粗發(fā)酵液活性的影響 取3支10 mL滅過菌的離心管，加入5 mL粗發(fā)酵液，分別稱取胰蛋白酶5、10、15 mg置于5 mL粗發(fā)酵液中，將上述離心管于37 ℃水浴1 h，以黃瓜灰霉病菌為指示菌進行拮抗活性測定。

1.2.7 硫酸銨對發(fā)酵液中蛋白質(zhì)的沉淀研究 用不同濃度的硫酸銨（0、0.5、1.0、2.0、4.0 mol/L）對MSL2#的粗發(fā)酵液進行沉淀離心后分別收集上清液，測定處理后的上清液對黃瓜灰霉病菌的拮抗試驗。

2 結果與分析

2.1 MSL2#的粗發(fā)酵液對三種蔬菜病原菌的抑制效果

MSL2#對黃瓜灰霉病菌、辣椒疫病菌、黃瓜枯萎病菌均有一定的抑制效果（圖1），抑制率均隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加而上升，第6天開始有下降的趨勢。其中，發(fā)酵液對黃瓜灰霉病菌的抑制率最高為80.4%，而對辣椒疫病病原菌、黃瓜枯萎病菌的最高抑制率分別為62.7%、52.3%。說明這株MSL2#的發(fā)酵液對黃瓜灰霉病菌的抑制效果最好。

2.2 pH變化對活性成分的影響

不同酸堿處理后的細菌發(fā)酵液上清液對黃瓜灰霉病菌抑制效果見圖2，結果表明，pH 3.8～9.0處理后的發(fā)酵液隨著培養(yǎng)天數(shù)的增多，對黃瓜灰霉病菌的抑菌效果也不斷增加，6 d后，抑菌率達到最高。pH 5.1～9.0范圍內(nèi)對黃瓜灰霉病菌的抑制效果沒有顯著性差異，可見這株拮抗細菌發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性物質(zhì)可以耐受較寬的酸堿范圍。

2.3 熱處理對粗發(fā)酵液的影響

MSL2#的發(fā)酵液通過不同溫度和不同時間的處理，以黃瓜灰霉病菌來檢測熱處理后的發(fā)酵液的抑制效果（圖3），結果表明，不同溫度處理后發(fā)酵液的抑菌活性存在顯著性差異，經(jīng)過40、50、60 ℃處理15 min的發(fā)酵液對黃瓜灰霉病菌抑制率最高分別達50%、38%、18%，100 ℃處理15 min后抑制率降低至5%以下，綜上可知MSL2#的粗發(fā)酵液具有一定的耐熱性。

2.4 酶處理對活性成分的影響

由圖4可知，經(jīng)酶處理的MSL2#粗發(fā)酵液隨著胰蛋白酶濃度的增大，其對黃瓜灰霉病菌的抑制率變化不顯著，表明MSL2#的拮抗物質(zhì)能抵抗胰蛋白酶的降解。

2.5 硫酸銨對發(fā)酵液中蛋白質(zhì)的沉淀結果

用不同濃度的硫酸銨對MSL2#的粗發(fā)酵液進行處理，測定處理后的上清液對黃瓜灰霉病菌的抑制率，結果見圖5。由圖5可知，經(jīng)過不同終濃度的硫酸銨處理過的發(fā)酵液對黃瓜灰霉病菌均有一定的抑制效果，隨著硫酸銨終濃度的增加，抑菌率則逐漸減小，說明上清液的活性成分主要是蛋白質(zhì)，同時也可能含有非蛋白組分。

3 小結與討論

有研究曾對蔬菜病害進行過生防菌的篩選并有一定的抑菌效果，但是這些菌株存在一定的不足，如抗菌蛋白對熱不穩(wěn)定等[4，5，7]。本試驗結果表明，MSL2#的粗發(fā)酵液對黃瓜灰霉病病菌、辣椒疫病病原菌、黃瓜枯萎病菌均有一定的抑制效果，其中對黃瓜灰霉病菌的抑制效果最好，菌株的發(fā)酵液對熱和酸堿都比較穩(wěn)定， 抑菌活性物質(zhì)能抵抗一定濃度的胰蛋白酶，以上結果均說明MSL2#具有較好的生防潛力。

本研究僅是對菌株進行了初步發(fā)酵，該菌對黃瓜灰霉病的抑菌效果可達80%，但對辣椒疫病病原菌和黃瓜枯萎病菌的抑制率分別為62.7%、52.3%。將來隨著發(fā)酵條件和發(fā)酵工藝的發(fā)展，代謝物質(zhì)的產(chǎn)量將會進一步提高，抑菌活性也會進一步提高，為該菌的進一步轉化奠定基礎。

同時硫酸銨沉淀后的發(fā)酵液上清液和沉淀均有一定的拮抗活性，說明發(fā)酵液活性物質(zhì)主要是蛋白質(zhì)，也有非蛋白組分，其粗發(fā)酵液中拮抗物質(zhì)的活性成分的分離提純以及具體性質(zhì)及大田防治效果等都將有待于進一步的深入研究。

參考文獻：

[1] 吳建挺，張悅麗，張 博，等.11種植物精油對6種植物病原真菌的抑菌活性研究[J].植物科學學報，2013，31（2）：198-202.

[2] 張萬里，喬潤香，尹 飛，等.13種植物提取物對5種果蔬病原真菌的抑菌活性[J].華南農(nóng)業(yè)大學學報，2009，30（2）：40-43.

[3] 梁建根，施躍峰，竺利紅，等.植物病害生物防治的研究現(xiàn)狀[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2008（18）：158-159.

[4] 安瑞平.黃瓜內(nèi)生細菌的分離及拮抗菌株的篩選初報[J].安徽農(nóng)學通報，2009，15（16）：39-40，75.

[5] 張興鋒，柳 鳳，何 紅，等.紅樹內(nèi)生細菌CⅢ-1菌株鑒定及其胞外抗菌蛋白性質(zhì)[J].微生物學通報，2010，37（2）：222-227.

[6] 張德濤，高艷麗，黃永輝，等.香蕉采后果實炭疽病菌的鑒定及其生物學特性[J].華中農(nóng)業(yè)大學學報，2011，30（4）：438-442.

[7] 師寶忠，仇艷肖，馬金亮，等.黃瓜灰霉病拮抗菌的篩選鑒定及其抑菌特性研究[J].河北省科學院學報，2012，29（1）：63-67，77.