徐惠娟　胡典典　張虹

摘要：對(duì)已分離到的多菌靈降解菌進(jìn)行16S rDNA序列分析后，采用均勻設(shè)計(jì)法，優(yōu)化多菌靈降解菌降解條件。用4因素6水平混合均勻設(shè)計(jì)表，綜合考察培養(yǎng)時(shí)間、接種量、pH、溫度對(duì)多菌靈降解菌降解能力的影響。通過二次多項(xiàng)式逐步回歸得出最終降解條件為：培養(yǎng)時(shí)間6 d、接種量10%、pH 4.0、溫度為45 ℃時(shí)，最優(yōu)目標(biāo)函數(shù)Y（降解率）為68.65%。進(jìn)一步進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，檢測(cè)該菌在實(shí)際應(yīng)用中的降解效率為59.54%。

關(guān)鍵詞：多菌靈降解菌；均勻設(shè)計(jì)；降解條件優(yōu)化；盆栽試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：Q939.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）10-2372-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.10.016

多菌靈是一種高效廣譜低毒的內(nèi)吸性殺菌劑，廣泛應(yīng)用于工業(yè)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，主要用于水果保鮮、蔬菜、果樹和谷類作物的真菌病害防治[1]。多菌靈化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定且降解半衰期長(zhǎng)，在果蔬及土壤中的殘留能對(duì)生態(tài)環(huán)境和人、畜健康造成極大危害[2]。利用生物降解法去除多菌靈殘留已成為熱點(diǎn)。本研究運(yùn)用均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法，多因素多水平地優(yōu)化多菌靈降解菌對(duì)多菌靈的降解條件，評(píng)估降解菌的降解能力，為實(shí)現(xiàn)多菌靈殘留去除的生物修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

試驗(yàn)菌株從長(zhǎng)期噴灑多菌靈的花卉基質(zhì)土中分離純化得到，保存于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)。

1.2 試劑與培養(yǎng)基

多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品由Adamas公司生產(chǎn)，純度為98%，80%多菌靈懸浮劑為蘇州遍凈植?？萍加邢薰旧a(chǎn)。

種子培養(yǎng)基參考文獻(xiàn)[3]，降解培養(yǎng)基為NaCl 100 mg，K2HPO4 150 mg，KH2PO4 50 mg，MgSO4·7H2O 20 mg，（NH4）2SO4 200 mg，多菌靈20 mg，去離子水 100 mL。pH依需要調(diào)節(jié)。

1.3 菌株鑒定

將菌株充分活化后進(jìn)行菌體形態(tài)觀察和革蘭氏染色。提取細(xì)菌基因組DNA，PCR擴(kuò)增16S rDNA，PCR產(chǎn)物純化后送上海生工生物工程有限公司測(cè)序，測(cè)序數(shù)據(jù)在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。

1.4 均勻設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析

選用均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，擬選4因素，即培養(yǎng)時(shí)間（X1）、接種量（X2）、pH（X3）、溫度（X4）（圖1），每個(gè)處理重復(fù)5次，測(cè)定不同因素條件下多菌靈降解菌對(duì)多菌靈的降解能力，采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)分析所得數(shù)據(jù)，對(duì)多菌靈降解率進(jìn)行優(yōu)化求解，建立菌株對(duì)多菌靈的最佳降解力模型，預(yù)測(cè)最佳值。

1.5 盆栽試驗(yàn)

1.5.1 小白菜的預(yù)處理 種植7盆小白菜，其中試驗(yàn)組3盆，對(duì)照組4盆。按市售多菌靈使用說明配制多菌靈懸浮劑，將所配藥劑等份均勻噴灑到試驗(yàn)組與對(duì)照組的小白菜莖及葉表面，早晚各處理一次，每次每盆20 mL。連續(xù)處理2 d，第3天開始用生長(zhǎng)于對(duì)數(shù)期的菌液處理小白菜，每盆菌液20 mL，對(duì)照不噴菌。噴菌后第3、5、7天采樣進(jìn)行多菌靈殘留測(cè)定。

1.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與樣品的提取分離 參考于彥彬等[4]測(cè)量多菌靈殘留量的方法，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和樣品多菌靈殘留量測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定

在牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基上進(jìn)行菌株djj-1活化培養(yǎng)24 h后觀察，菌落較小，奶白色，表面光滑，濕潤，呈圓形。顯微鏡下觀察菌體為桿狀，單個(gè)存在或成對(duì)存在，靜止期呈球形，革蘭氏染色為革蘭氏陰性菌。

將菌株djj-1的16S rDNA序列在NCBI上進(jìn)行序列比對(duì)分析和同源性比較，發(fā)現(xiàn)其與Acinetobacter baumannii的同源性達(dá)99%。

2.2 降解菌的降解條件優(yōu)化

采用三波長(zhǎng)校正法對(duì)均勻設(shè)計(jì)的每個(gè)試驗(yàn)處理進(jìn)行多菌靈降解率的測(cè)定，結(jié)果見圖1。

采用偏最小二乘回歸法（Partial Least Squares，PLS）[5]，以培養(yǎng)時(shí)間（X1）、接種量（X2）、pH（X3）、溫度（X4）為自變量；以降解率（Y）為因變量建立回歸方程如下：

Y=56.298 4-1.150 6X1-7.162 0X2+1.567 2X3-0.055 1X4-0.416 1X12+0.202 8X22+0.005 1X33- 0.003 7X44+0.5352 7X1X2+0.238 4X1X3+0.002 7X1X4-0.243 6X2X3+0.156 4X2X4-0.056 0X3X4

回歸方程Y的決定系數(shù)R2為0.865 3，經(jīng)F檢驗(yàn)P<0.01，表明回歸方程的擬合程度較好。

為了尋求在試驗(yàn)條件下獲得最大降解率，通過DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)回歸方程Y進(jìn)行優(yōu)化求解，得到各個(gè)試驗(yàn)因素的最優(yōu)組合：X1為6，X2為10，X3為4，X4為45，即培養(yǎng)時(shí)間為6 d、接種量為10%、pH 4.0、溫度45 ℃時(shí)，最優(yōu)目標(biāo)函數(shù)Y（降解率）為68.65%。

2.3 多菌靈降解菌株的初步應(yīng)用分析

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 參照多菌靈標(biāo)準(zhǔn)曲線[4，6]的測(cè)定步驟， 測(cè)定不同含量多菌靈的三波長(zhǎng)校正吸光度ΔA， 以校正吸光度ΔA為縱坐標(biāo)，多菌靈的含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在0～50 μg濃度范圍內(nèi)，曲線的回歸方程為Y= 0.001 5-0.000 8X（μg），Y為校正吸光度ΔA，相關(guān)系數(shù)為0.999 5。

2.3.2 樣品的測(cè)定結(jié)果 對(duì)處理后的小白菜進(jìn)行多菌靈殘留量的測(cè)定，根據(jù)數(shù)據(jù)計(jì)算得最大降解率為59.54%（表2），在理想最優(yōu)目標(biāo)函數(shù)（降解率）68.65%以內(nèi)。

3 小結(jié)與討論

微生物法是消除環(huán)境中多菌靈農(nóng)藥污染的有效手段，因此，選育和應(yīng)用高效多菌靈降解菌是多菌靈環(huán)境污染實(shí)現(xiàn)高效處理的重要措施。本研究將多菌靈降解菌經(jīng)多次分離純化后，對(duì)其進(jìn)行16S rDNA序列分析，發(fā)現(xiàn)與Acinetobacter baumannii的同源性達(dá)99%。

菌株對(duì)多菌靈的降解容易受到多種因素的限制，包括多菌靈的濃度、培養(yǎng)時(shí)間、pH、溫度及金屬離子等。目前對(duì)多菌靈降解菌的研究多局限在實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)單因素水平降解率方面，本研究應(yīng)用均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，從多因素、多水平研究微生物降解多菌靈的能力，優(yōu)化菌株djj-1對(duì)多菌靈的降解條件。結(jié)果表明，在其最優(yōu)條件下，即培養(yǎng)時(shí)間6 d、接種量為10%、pH 4.0、溫度45 ℃時(shí)，降解率為68.65%。

本試驗(yàn)采用分光光度法進(jìn)行了小白菜中多菌靈殘留量的測(cè)定。結(jié)果表明，多菌靈菌株對(duì)小白菜中多菌靈最大降解率為59.54%，其結(jié)果較為滿意，但本試驗(yàn)只是研究了菌株對(duì)盆栽小白菜多菌靈的降解作用，實(shí)驗(yàn)室中的溫度相對(duì)適中，晝夜溫差不大，無陽光暴曬等環(huán)境因素的影響。如果將降解菌在戶外蔬菜田中應(yīng)用，對(duì)多菌靈的降解能力如何尚有待進(jìn)一步研究。

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[3] 沈 萍.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].第四版.北京：高等教育出版社，2007.

[4] 于彥彬，苗在京，萬述偉，等.三波長(zhǎng)校正光度法測(cè)定水果蔬菜中多菌靈殘留量[J].理化檢驗(yàn)（化學(xué)分冊(cè)），2005（5）：353-357.

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[6] 范寧云，蔡 興，李彩霞.分光光度法測(cè)定蔬菜中多菌靈殘留量新方法的研究[J].甘肅科技，2009，25（2）：52-53.