陳 平，杜 佳，孫勝敏

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，哈爾濱150076)

食用菌多糖具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，如香菇中含有人體所需的多糖，多糖具有極其重要的生物功能[1].多糖與免疫功能的調(diào)節(jié)、細(xì)胞與細(xì)胞的識(shí)別、細(xì)胞間物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)、癌癥的診斷與治療等都有著密切的關(guān)系[2].鋅是人體中不可缺少的微量元素，元素鋅作為體內(nèi)重要的必需微量元素，有明顯的抗氧化作用.鋅通過金屬硫蛋白(MT)發(fā)揮抗氧化作用，MT能夠抵御重金屬的毒性作用[3]，在保證金屬元素的穩(wěn)態(tài)以及清除自由基等方面發(fā)揮重要的作用.缺鋅的結(jié)果可能是血清胸腺素的活性顯著下降，而且補(bǔ)鋅可使其得到糾正[4].復(fù)合多糖配合鹽具有抵抗干擾，很容易被動(dòng)物體消化吸收，在補(bǔ)充鋅的同時(shí)又補(bǔ)充了動(dòng)物體所需的多糖.本實(shí)驗(yàn)采用原料為食用菌香菇，經(jīng)微波輔助熱水浸提法提取得復(fù)合多糖[5]，將復(fù)合多糖與醋酸鋅在適當(dāng)條件下進(jìn)行配合反應(yīng)制備復(fù)合多糖－鋅(Ⅱ)的配合物，并對(duì)其最適反應(yīng)條件進(jìn)行初步研究.本實(shí)驗(yàn)方法也適用于菌類加工中回收的多糖與鋅的配合[6].

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

復(fù)合多糖，自制;醋酸鋅、鹽酸、氫氧化鈉(分析純)、乙酸鋅、硫代硫酸鈉、冰醋酸、乙酸鈉、二硫腙、四氯化碳，天津市嘉興化工有限公司;sephadex－G200，北京天恩澤有限公司.葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品MW=1.26 ×104g/moL，MW=6.06 ×104g/moL，中國計(jì)量科學(xué)研究院.Dextran標(biāo)準(zhǔn)品 MW=3.35×104g/moL，MW=9.11 ×104g/moL，美國聚合物標(biāo)準(zhǔn)品公司.

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004N型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司;85－2型控溫磁力攪拌器，江蘇金壇醫(yī)療儀器廠;TU1901型雙光束紫外－可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公責(zé)任公司;722E型分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司;RE52－98型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠;GZX－DH－30×35型電熱恒溫箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;Spectrum one型紅外分光光度計(jì)，美國Perkin－Elmer公司;精密凈化交流穩(wěn)壓電源，上海三科電器有限公司;美國waters高效液相色譜儀.

1.3 試驗(yàn)方法

復(fù)合多糖的制備與純化:準(zhǔn)確稱取經(jīng)過研磨的食用菌(香菇、元菇)干粉5 g于燒杯中，加入100 mL蒸餾水，用5 mol/L鹽酸水解，料液比1∶20水浴加熱 6 h，浸提后進(jìn)行微波輔助提取[7－8]，在微波功率為80%條件下微波處理4 min，提取混合多糖.后經(jīng)過離心取出上清液，加入活性炭，在60℃水浴振蕩30 min脫色完全.加入sevag(三氯甲烷∶正丁醇=4∶1)試劑，去除粗多糖中的蛋白質(zhì).并用葡聚糖凝膠對(duì)提取液中復(fù)合多糖進(jìn)行純化[9]，然后將純化液經(jīng)過3 000 r/min離心，冷凍干燥，制得混合多糖[10－13]，其中復(fù)合多糖得率為 3.75%，元菇多糖得率得率為2.15%.香菇中多糖得率高于元菇多糖得率，所以本實(shí)驗(yàn)中復(fù)合多糖為香菇多糖.

1.4 復(fù)合多糖Zn(Ⅱ)配合物的合成

取一定質(zhì)量比的復(fù)合多糖和醋酸鋅混合溶于200 mL水中，控制溶液的反應(yīng)溫度，調(diào)節(jié)pH值，反應(yīng)一定時(shí)間后，經(jīng)4 000 r/min離心10 min，取上清液做減壓蒸餾.醇沉、把減壓蒸餾后剩余少量液體預(yù)凍，進(jìn)行冷凍干燥，干燥后稱量配合物質(zhì)量，而后水解分離，得到多糖鋅的配合物.

1.4.1 復(fù)合多糖Zn(Ⅱ)配合物的結(jié)合率含量的測定

吸取水樣10.0 mL于25mL比色管中，如水樣鋅含量超過5 mg，可取適量水樣 ，用純水稀釋至10.0 mL.另取比色管8支，依次加入1 mg/mL鋅標(biāo)準(zhǔn)使用溶液 0、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 和5.00 mL，各加純水至 10 mL.向比色管中各加5.0 ml乙酸－乙酸納緩沖溶液，混勻，再各加1.0 mL硫代硫酸鈉溶液，混勻，然后加入2.5 mL雙硫腙－T ween 80溶液，搖勻，靜置 20 min.于525 nm波長，用20 mm比色皿，以純水為參比，測量樣品和標(biāo)準(zhǔn)系列吸光值.

1.4.2 合成復(fù)合多糖Zn(Ⅱ)配合物的溫度的選擇

分別稱量6份一定質(zhì)量比的復(fù)合多糖和醋酸鋅混合溶于200 mL水中，調(diào)節(jié)溶液pH9.0，控制反應(yīng)時(shí)間為65 min，并控制反應(yīng)溫度分別為30、40、50、60、70、80 ℃.醇沉、把減壓蒸餾后剩余少量液體預(yù)凍，進(jìn)行冷凍干燥，干燥后稱量配合物質(zhì)量，而后水解分離，得到多糖鋅的配合物.而后按1.4.1方法測定每份溶液中復(fù)合多糖Zn(Ⅱ)配合物中Zn(Ⅱ)的濃度，從而選擇合成配合物的最佳溫度.

1.4.3 合成復(fù)合多糖Zn(Ⅱ)配合物的時(shí)間的選擇

分別稱量6份一定質(zhì)量比的復(fù)合多糖和醋酸鋅混合溶于200 mL水中，調(diào)節(jié)溶液pH9.0，控制反應(yīng)溫度為60℃，并控制反應(yīng)時(shí)間分別為30、40、50、60、70、80 min.醇沉、把減壓蒸餾后剩余少量液體預(yù)凍，進(jìn)行冷凍干燥，干燥后稱量配合物質(zhì)量，而后水解分離，得到多糖鋅的配合物.按1.4.1方法測定每份溶液中復(fù)合多糖Zn(Ⅱ)配合物中Zn(Ⅱ)的濃度，從而選擇合成配合物的最佳時(shí)間.

1.4.4 合成復(fù)合多糖Zn(Ⅱ)配合物的pH值的選擇

分別稱量6份一定質(zhì)量比的復(fù)合多糖和醋酸鋅混合溶于200 mL水中，控制反應(yīng)溫度為60℃，并控制反應(yīng)時(shí)間為60 min.并在每份溶液中分別加入緩沖溶液調(diào)節(jié)溶液 pH 值分別為 3、5、7、9、11、13，醇沉、把減壓蒸餾后剩余少量液體預(yù)凍，進(jìn)行冷凍干燥，干燥后稱量配合物質(zhì)量，而后水解分離，得到多糖鋅的配合物.按1.4.1方法測定每份溶液中復(fù)合多糖Zn(Ⅱ)配合物中Zn(Ⅱ)的濃度，從而選擇合成配合物的最佳pH值.

1.5 配合物最佳合成工藝確定

取不同質(zhì)量比的復(fù)合多糖和醋酸鋅按照合成工藝進(jìn)行配合反應(yīng).采用分光光度法分析，濃度越大，即配合程度越大，則可根據(jù)吸光度的變化趨勢，確定出最佳反應(yīng)條件.并用正交試驗(yàn)確定最佳的配合條件[14－16].

1.6 香菇中復(fù)合多糖的分子質(zhì)量的確定方法

精確稱取不同分子質(zhì)量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品0.05 g，用流動(dòng)相溶解并定容至5 mL.最終質(zhì)量濃度為10 mg/mL.分別進(jìn)樣10 μL，以不同分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖的分離保留時(shí)間與相應(yīng)分子的質(zhì)量建立分子質(zhì)量對(duì)數(shù)值繪制標(biāo)準(zhǔn)坐標(biāo)曲線.待測樣品經(jīng)分離后得到不同分子質(zhì)量峰的保留時(shí)間值，通過分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)工作曲線即可計(jì)算其多糖分子質(zhì)量[17].

1.7 配合物最大吸收波長的確定

按以上配合工藝制得配合物后，取0.25 g溶于80 mL蒸餾水中，配制成配合物溶液，在可見－紫外光區(qū)(190～500 nm)掃描測定出最大吸收波長.

1.8 配合物配合比的確定

采用等摩爾連續(xù)變化法，配制一系列濃度的金屬鋅離子溶液和復(fù)合多糖溶液，使鋅離子和復(fù)合多糖的濃度總和為一定值，而連續(xù)改變金屬離子和復(fù)合多糖的濃度比值，測定各測試溶液的吸光度，以吸光度A－f(復(fù)合多糖的物質(zhì)的量與鋅離子的物質(zhì)的量比值)作圖，由圖可確定配合物的配合比[18－19]

1.9 配合產(chǎn)物的表征

對(duì)配合產(chǎn)物進(jìn)行紅外分析，確定其為目標(biāo)產(chǎn)物.

2 結(jié)果與分析

2.1 配合物的最佳合成工藝的確定

2.1.1 溫度對(duì)配合反應(yīng)的影響

調(diào)節(jié)溶液pH值至9.0，控制反應(yīng)時(shí)間65 min，變化配合的溫度，結(jié)果見圖1.

圖1 溫度對(duì)配合反應(yīng)的影響

如圖1所示，當(dāng)反應(yīng)溫度小于等于60℃時(shí)，配合程度隨溫度的升高而加大，大于60℃時(shí)，配合程度隨溫度的升高而減小.可能是溫度小于60℃時(shí)，適合化學(xué)反應(yīng)正向進(jìn)行，反應(yīng)速率逐漸上升:當(dāng)溫度大于60℃時(shí)，此溫度條件下不適合反應(yīng)的進(jìn)行，速率有所下降.

2.1.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)配合反應(yīng)的影響

調(diào)節(jié)溶液 pH值至9.0，控制反應(yīng)溫度為60℃，變化配合反應(yīng)的時(shí)間，結(jié)果見圖2.

圖2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)配合反應(yīng)的影響

由圖2可知，配合物產(chǎn)率在60 min時(shí)達(dá)到最高.在60 min之前產(chǎn)率增長幅度較快，而后隨反應(yīng)時(shí)間延長，產(chǎn)率逐漸趨于平穩(wěn)，可能是發(fā)生了平衡移動(dòng).

2.1.3 pH值對(duì)配合反應(yīng)的影響

調(diào)節(jié)不同pH值系列溶液，控制反應(yīng)溫度60℃，反應(yīng)60 min，結(jié)果見圖3.

圖3 pH值對(duì)配合反應(yīng)的影響

由圖3可知，隨著pH值的增大，復(fù)合多糖－鋅(Ⅱ)配合物的產(chǎn)率也隨之逐漸增大，并在pH值為9時(shí)達(dá)到最高.但當(dāng)pH值再增大時(shí)產(chǎn)物顏色變成淺棕色，當(dāng)pH值達(dá)到13時(shí)，顏色更加深，有副反應(yīng)發(fā)生.其主要原因可能是在強(qiáng)堿環(huán)境下金屬鋅離子與氫氧根發(fā)生沉淀反應(yīng)，影響了鋅離子與復(fù)合多糖的配合.

2.1.4 配合物的最佳合成工藝正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以配合物吸光度為指標(biāo)，以反應(yīng)pH值、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度為考察因素.采用L9(34)表進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化合成最佳條件.對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析.見表1～3.

表1 配合物的最佳合成工藝正交試驗(yàn)因素與水平

表2 配合物的最佳合成工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)方差分析表

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定以配合反應(yīng)pH值、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間3個(gè)因素，選用L9(34)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示.由表2可知，復(fù)合多糖－鋅(Ⅱ)的最佳合成工藝為配合反應(yīng)pH=9.0、配合反應(yīng)時(shí)間60 min、配合反應(yīng)溫度60℃.各種因素對(duì)配合反應(yīng)效果影響的主次順序依次為反應(yīng)pH值＞反應(yīng)溫度＞反應(yīng)時(shí)間.通過方差分析(表3)可知，反應(yīng)pH值、反應(yīng)溫度這兩種因素對(duì)復(fù)合多糖－鋅(Ⅱ)的合成影響均達(dá)顯著水平(P＜0.05)，反應(yīng)時(shí)間不顯著.

2.2 香菇中復(fù)合多糖的分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定

由分離得到的各色譜峰的保留時(shí)間，經(jīng)校準(zhǔn)后建立分子質(zhì)量對(duì)數(shù)值與保留時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖4所示.

圖4 分子質(zhì)量對(duì)數(shù)與保留時(shí)間的曲線

由圖4可知，分子質(zhì)量在 1.26×104～9.11×104g/moL范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系，合復(fù)合多糖的高壓液相色譜圖，結(jié)復(fù)合多糖的重均分子質(zhì)量為3.35 ×104g/moL.

2.3 配合物最大吸收波長的確定

分別將醋酸鋅溶液和配合反應(yīng)產(chǎn)物溶液在可見－外光區(qū)(190～500 nm)掃描測定，結(jié)果見圖5～7.

圖5 復(fù)合多糖紫外分析圖譜

圖6 醋酸鋅紫外分析圖譜

圖7 復(fù)合多糖與鋅配合產(chǎn)物的紫外分析圖譜

由圖可知，可在224 nm下進(jìn)行測定.

2.4 配合物配合比的測定

由圖8可以看出，當(dāng)物質(zhì)的量比為1∶1時(shí)，體系吸光度最大，由于吸光值大小與反應(yīng)體系配合比成正相關(guān)，因此1∶1為配合反應(yīng)最佳反應(yīng)物質(zhì)的量比.

圖8 復(fù)合多糖－鋅(Ⅱ)配合比的確定

2.5 配合產(chǎn)物的表征

用KBr壓片法測定復(fù)合多糖、復(fù)合多糖－鋅(Ⅱ)在4 000 ～450 cm－1的紅外光譜見圖9、10.

圖9 復(fù)合多糖的紅外光譜圖

圖10 復(fù)合多糖－鋅(Ⅱ)紅外光譜圖

復(fù)合多糖與鋅離子形成配合物后，它的一些主要吸收峰發(fā)生了明顯位移，證實(shí)二價(jià)鋅離子與復(fù)合多糖發(fā)生了配位作用.在復(fù)合多糖的紅外光譜圖中3 434.91cm－1的寬締合峰是羥基的強(qiáng)的伸縮振動(dòng)峰吸收峰.復(fù)合多糖2 925.44cm－1特征峰是醛基中的碳?xì)浞磳?duì)稱伸縮振動(dòng)吸收產(chǎn)生的峰，在配合物的紅外光譜圖中完全消失，說明醛基中的羰基參與鋅的配合反應(yīng).復(fù)合多糖圖譜中1 633.16cm－1由羰基(—C=O)的伸縮振動(dòng)引起的特征吸收峰.當(dāng)復(fù)合多糖與鋅配合后，螯合物的紅外光譜顯示，增加了1151.31cm－1和1 105cm－1兩個(gè)吸收峰，此為吡喃糖苷的吸收峰.同時(shí)，羰基的特征吸收移至1 630.27cm－1處.這是由于復(fù)合多糖的羥基和羥基氧參與配位形成螯合物的結(jié)果.由配合比結(jié)合紅外圖譜可得配合物可能的結(jié)構(gòu)圖，見圖11.

圖11 復(fù)合多糖－鋅(Ⅱ)可能的結(jié)構(gòu)式

3 結(jié)語

本實(shí)驗(yàn)研究復(fù)合多糖與鋅離子配合的最佳反應(yīng)條件，并通過紅外光譜對(duì)合成產(chǎn)物進(jìn)行了初步的表征.得到最佳反應(yīng)條件為pH=9.0、反應(yīng)溫度60℃、反應(yīng)時(shí)間60 min，通過等摩爾連續(xù)變化法測得產(chǎn)物配合比為1∶1.

[1]李紅衛(wèi)，周國燕，郭慧青，等.從香菇中浸提香菇多糖的方法對(duì)比研究[J].食品科學(xué)，2008，29(11):173－174.

[2]陸 娟，彭 浩，陳俊峰，等.香菇多糖微波輔助提取及體外免疫學(xué)活性研究[J].生物學(xué)雜志，2011，3(28):50－52.

[3]呂國英，范雷法，張作法，等.香菇多糖研究進(jìn)展[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，2(21):183－187.

[4]李小宇，王振宇，王 璐.食用菌多糖的分離、結(jié)構(gòu)及其生物活性的研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，28(12):236－240

[5]王麗威，郭旭穎，陳梁成，等.水浴法和微波法提取金針菇下腳料多糖的優(yōu)化及比較研究[J].食品工業(yè)科技，2012，33(8):323－325.

[6]金 茜，朱 琳，羅宿星，等.食用菌多糖生物活性研究進(jìn)展[J].遵義師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，4(12):75－76.

[7]王國佳，曹 紅.香菇多糖的研究進(jìn)展[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2010，27(5):451－454.

[8]徐翠蓮，杜林洳，樊素芳，等.多糖的提取分離純化及分析鑒定方法研究[J].河南科學(xué)，2009，27(12):1524－1525.

[9]楊 勇，錢運(yùn)華，賈建波.活性炭/凹土吸附劑香菇多糖提取液脫色研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(35):21959－21601.

[10]石倩茹，陳盼盼，田國政，等.SephadexG－200分離純化薇菜可溶性多糖的工藝優(yōu)化[J].現(xiàn)代園藝，2011(15):8.

[11]張 玲，郝艷梅，張世益.微量元素硒鋅與人體健康的研究進(jìn)展[J].中國保健營養(yǎng)，2013，03(上):1557.

[12]PRASAD A S.Zinc in human health:effect of zinc on immune Cells[J].MolMed，2008，14(5 －6):353 －357.

[13]何瑞雪，文宏思明.水溶性大豆多糖－鐵配合物的制備及理化性質(zhì)的研究[J].食品工業(yè)科技，2012，2(33):326－327.

[14]BONG C S，KYUNGMOON P，SEUNG H S，et al.Selective Biosorption of Mixed Heavy Metal Ions using polysaccharides[J].KereanJ.Chem.Eng，2004，21(6):1168 －1172.

[15]WAN NGAH W S，TEONGA L C，HANAFIAH M.Adsorption of dyes and heavy metalions by chitosan composites:A review[J].Carbohydrate Polymers，2011(83):1446 －1456.

[16]WU B D，WANG Q D，LIU Q.Capillary electrophoresis direct enantioseparation of aromatic amino acids based on mixed chelateinclusion complexation ofaminoethylamino cyclodextrin[J].Electrophoresis，2005，26(4/5):1013 －1017.

[17]甘賓賓.食品中糖類的高效液相色譜法測定[J].分析儀器，2000(3):38－42.

[18]徐新榮，于海濤，杭 麗，等.柚皮素銅、鋅配合物的制備及其對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性脈絡(luò)膜新生血管的抑制作用[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，29(6):545－546.

[19]石幫輝.雙硫腙分光光度法測定水中微量鋅[J].華南預(yù)防醫(yī)學(xué)，2004，130(5):56－57.