石 朗，顧媛媛，焦丁寧，蘇德龍，王英昕，董培良，陳大忠

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，哈爾濱150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，哈爾濱150040;3.哈藥集團中藥二廠，哈爾濱150078)

注射用雙黃連粉針由金銀花、黃芩、連翹三味中藥組成，經(jīng)提取、精制、噴霧干燥(或冷凍干燥)，無菌分裝制成，具有抗菌、抗病毒、消炎及增強免疫的作用，經(jīng)藥理學研究表明，它對流感病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒Ⅲ型等具有較廣譜的抗病毒作用.臨床上主要用于治療急性上呼吸道感染、急性支氣管炎、扁桃體炎、肺炎及小兒病毒性肺炎等[1].在實際生產(chǎn)中，為了提高制劑質(zhì)量，保證成品合格率，在生產(chǎn)注射用雙黃連粉針劑的各個環(huán)節(jié)中都有嚴格的質(zhì)量控制標準.但雙黃連粉針劑中間體一直沒有準確的判定標準.為此，本試驗通過建立雙黃連中間體的指紋圖譜，考察其與成品制劑是否存在相關(guān)性，建立中藥注射劑的標準化、規(guī)范化、產(chǎn)業(yè)化和國際化的科學技術(shù)平臺，為快速實現(xiàn)中藥制劑的現(xiàn)代化和國際化奠定堅實的技術(shù)基礎(chǔ).

中藥及其復方化學成分復雜，中藥指紋圖譜技術(shù)能標示中藥材特征的共有峰圖譜，借以辨別真?zhèn)?、評價原料藥材、半成品及成品質(zhì)量的均一性和穩(wěn)定性[2].UPLC相對于HPLC色譜法具有更好的分離效率，峰容量及靈敏度，能大大縮短樣品運行時間[3]，本實驗前期建立了雙黃連粉針的UPLC指紋圖譜方法，為了考察雙黃連粉針劑成品和中間體的相關(guān)性，本試驗同樣采用UPLC技術(shù)建立中間體的指紋圖譜，為高效控制和科學評價雙黃連粉針劑的質(zhì)量提供了有力的數(shù)據(jù)支持和實驗依據(jù).

1 實驗材料

1.1 儀器

美國Waters AqcuityTM UPLC液相色譜儀(四元梯度泵一在線真空脫氣機一自動進樣器一二極管陣列檢測器一柱溫箱);MassLynx V4.1工作站;美國Micromass Q－TOF microTM四極桿－飛行時間質(zhì)譜)(電噴霧離子源－正、負離子掃描方法－Lockspray);JA2003精密電子天平(上海良平儀器廠生產(chǎn));KQ5200E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)).

1.2 試藥與樣品

對照品均購自中國藥品生物制品檢定所，連翹苷對照品(批號110821－201213，供含量測定用)，黃芩苷對照品(批號110715－201314，供含量測定用)，綠原酸對照品(批號110753－201314，供含量測定用)，雙黃連粉針劑中間體由哈爾濱中藥二廠生產(chǎn)和提供，批號為 1409405、1409406、1409407、1409408、1409409、1409410、1409411、1409413、1409414、1409416、1409417、1409418 和 1409419.乙腈為色譜純(美國Fisher公司生產(chǎn))，甲酸為色譜級(天津科密歐化學試劑有限公司生產(chǎn))，水為屈臣氏蒸餾水.

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用ACQUITY UPLCTM BEH C18Column色譜柱(1.7 μm，2.1 × 50 mm，Waters Corp，Milford USA);流動相:乙腈－0.1%的甲酸水，梯度洗脫條件如表1所示，流速:0.3 mL/min;柱溫:40℃;進樣量:3 μL.

表1 梯度洗脫表

2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧電離源(ESI)，采用正離子掃描檢測;干燥氣溫度:350℃;碰撞能:100 V;干燥器流速:11 L/min;毛細管電壓:4 kV;霧化器壓力276 kPa;掃描方式全掃描，質(zhì)量掃描范圍:m/z100～1500.

2.3 對照品溶液的制備

分別取黃芩苷、連翹苷、綠原酸對照品適量，精密稱定，加50%甲醇溶液分別制成每1 mL含黃芩苷0.1 mg、連翹苷60 μg、綠原酸40 μg 的混合對照品溶液.

2.4 供試品溶液的制備

從每批次樣品中隨機取本品5支的內(nèi)容物，混勻，取本品1 mL，置25 mL量瓶中，加50%甲醇溶液15 mL，超聲處理10 min，并稀釋至刻度，搖勻，過0.22 μm 微孔濾膜即得.

2.5 方法學考察

2.5.1 運行時間

參照雙黃連粉針劑的運行時間，故該中間體在與雙黃連粉針劑相同的色譜條件下采集時間確定為22 min.

2.5.2 精密度試驗

取批號為1409405的雙黃連粉針劑中間體樣品，按2.4項下的方法制成6份供試品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進樣6次，檢測特征指紋圖譜，記錄色譜圖，各共有色譜峰對參比峰的相對峰面積和相對保留時間的RSD值均小于3.0%，結(jié)果表明所用儀器精密度良好[4].

2.5.3 重復性試驗

取批號為1409405的雙黃連粉針劑中間體樣品，按2.4項下的方法制成6份供試品溶液，照上述色譜條件進樣，記錄色譜圖.各共有色譜峰對參比峰的相對峰面積和相對保留時間的RSD值均小于3.0%，結(jié)果表明該實驗重復性良好.

2.5.4 樣品穩(wěn)定性考察

取供試品，分別于 0、2、4、6、8、12、24 h 測定，檢測特征指紋圖譜，記錄.各共有色譜峰對參比峰的相對峰面積和相對保留時間的RSD值均小于3.0%，結(jié)果表明該樣品24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性.

2.6 樣品測定

將13批雙黃連粉針劑中間體樣品，照2.3項下方法制成供試品溶液，按上述色譜條件依次進樣3 μL檢測，記錄對照品溶液和供試品溶液UPLC色譜圖，分別見圖1、2.將雙黃連粉針劑批號1409405同樣制成供試品溶液，進樣3 μL，記錄UPLC色譜圖，見圖3.

圖1 對照品溶液的UPLC色譜圖

圖2 雙黃連中間體指紋圖譜標號圖

圖3 雙黃連粉針指紋圖譜標號圖

2.7 指紋圖譜共有模式的建立與評價

2.7.1 共有峰的確定

通過對13批樣品的指紋圖譜進行分析，20 min 內(nèi)有26 個共有峰，分別為 1、3、4、8、12、13、14、17、18、20、21、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、36、37、39、40、42 號色譜峰，各共有峰的相對峰面積及相對保留時間均具有較好的重復性，其RSD均小于0.5%.通過與對照品的色譜圖進行比對，確定了三個特征峰，4號峰為綠原酸，29號峰為黃芩苷，31號峰為連翹苷.

2.7.2 參比峰的選擇

在各批次樣品圖譜中綠原酸的色譜峰(4號峰)分離度良好，峰面積積分值適中，且為所有樣品共有，所以確定綠原酸為參照色譜峰.

2.7.3 相似度評價

將13批雙黃連粉針中間體的圖譜導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004年A版相似度軟件，進行相似度的評價，結(jié)果見表2.結(jié)果表明，13批中間體樣品相似度均大于0.9，說明其相似度較好，工藝比較穩(wěn)定.

表2 13批注射用雙黃連(凍干)指紋圖譜的相似度

2.8 相關(guān)性測定結(jié)果

從測定結(jié)果可以看出，中間體的色譜圖中共有42個色譜峰，而粉針劑成品中僅有30個色譜峰，但所指認的特征峰均可在雙黃連中間體和粉針劑成品色譜圖中追蹤得到，中間體、成品制劑中4號峰均為綠原酸，中間體中29號峰與粉針成品中的22號峰均為黃芩苷，中間體中31號峰與粉針成品中的24號峰均為連翹苷，由此可見，雙黃連中間體和粉針劑成品具有良好的相關(guān)性.

3 討論

本研究通過建立13個批次雙黃連凍干粉中間體的UPLC指紋圖譜，對其中多個組分進行了研究，不限定域值，共有42個色譜峰.測定結(jié)果顯示，整體分離效果較好，同時根據(jù)對照品對3個特征色譜峰的歸屬進行了定性分析，13批中間體的供試色譜圖中有26個共有峰，相似度大于0.9，說明各批次間工藝較穩(wěn)定，具有良好的一致性，該方法可以用于雙黃連粉針中間體的質(zhì)量控制.

將同一批次的雙黃連粉針中間體與其成品制劑的色譜譜進行比較，發(fā)現(xiàn)成品制劑的色譜峰數(shù)目減少了(中間體42個色譜峰，成品30個色譜峰)，所指認的三個特征峰在雙黃連中間體和粉針劑成品色譜圖中追蹤得到，可用于其質(zhì)量評價指標，同時說明中間體和成品制劑之間具有相關(guān)性.對于減少的化學成分是否有效，后期有待于繼續(xù)對其進行化學結(jié)構(gòu)確認和藥效進行深入研究.本研究在前期建立了相同批次雙黃連粉針的指紋圖譜，其相似度水平略低于中間體的相似度，其原因是否在于工藝上的問題，有待于進一步研究與探討，總之，該方法的建立對成品制劑的質(zhì)控奠定了基礎(chǔ)，且為中藥注射劑的規(guī)范化、標準化、產(chǎn)業(yè)化和國際化提供了科學的技術(shù)平臺[5].

[1]李 方，姜文紅，劉麗娟，等.注射用雙黃連(凍干)指紋圖譜的建立及其在質(zhì)量控制中的應(yīng)用[J].中成藥，2007，29(8):1196－1198.

[2]譚超元，王海波，王 東.鉤藤飲片HPLC指紋圖譜研究[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18(1):63.

[3]ZHOU D，ZHANG X，XU Q，et al.UPLC/Q－TOFMS/MS as a powerful technique for rapid identification of polymethoxylated flavones in Fructus aurantii[J].J Pharm Biomed Anal，2009，50(1):2－8.

[4]CHEN W K，LUO Y H，XIONG W.Sutdy on fingerprint chromatogram of Coyrdalis decumbens for injection[J].Chin J Pharm Anal，2008，28(3):434.

[5]國家藥品監(jiān)督管理局.中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)[J].中成藥，2000，22(10):671－ 675.