王家雄楊慎敏**馬林偉程洪波李海波. 南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院生殖與遺傳中心 （蘇州 25002）2. 鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院

精子纖維鞘發(fā)育不良的形態(tài)學(xué)和遺傳學(xué)初步研究（附3例報道）*

王家雄1楊慎敏1**馬林偉2**程洪波1李海波1
1. 南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院生殖與遺傳中心 （蘇州 215002）2. 鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院

摘要目的 分析纖維鞘發(fā)育不良患者精子形態(tài)學(xué)特點，探尋其致病基因。方法 對3例表現(xiàn)為嚴(yán)重弱精子癥的患者進(jìn)行光鏡下精液分析，通過掃描電鏡和透射電鏡進(jìn)一步明確其超微結(jié)構(gòu)特點。候選基因精子鞭毛蛋白2 （SPEF2）和減數(shù)分裂特異性蛋白1（MNS1）全外顯子測序，分析可能的致病突變位點。結(jié)果 3例患者均表現(xiàn)為100%（或接近）不活動精子，精子存活率26.0%～80.0%。光鏡和掃描電鏡下可見無尾、粗短尾、卷尾和不規(guī)則尾等嚴(yán)重畸形，DFS缺陷精子分別占99.5%，97.5%和79.5%。透射電鏡表現(xiàn)為精子鞭毛纖維鞘等多種結(jié)構(gòu)組裝異常，伴有中心微管缺失（59%～78%）和動力蛋白臂缺失。MNS1和SPEF1基因外顯子未見病理性突變。結(jié)論 DFS是嚴(yán)重弱精子癥原因之一，根據(jù)形態(tài)學(xué)特點可以診斷；遺傳學(xué)病因有待研究。

關(guān)鍵詞精子/超微結(jié)構(gòu); 弱精子癥; 鞭毛

按照精液特征不育男性可以診斷為少精子癥、弱精子癥和無精子癥等，隱藏在精液表現(xiàn)下的原發(fā)病因復(fù)雜多樣。通過標(biāo)準(zhǔn)的評估仍有44%的精液異常原因不明[1]。射出精液中精子均不活動，可能由于獲得性和或天性缺陷精子鞭毛缺陷造成[2]。大多數(shù)精子表現(xiàn)為活的但不活動提示精子鞭毛超微結(jié)構(gòu)缺陷[3]。原發(fā)性纖毛運動障礙（primary ciliary diskinesia，PCD）是纖毛動力蛋白臂缺失為主的超微結(jié)構(gòu)異常，表現(xiàn)為無活動精子或嚴(yán)重弱精子癥，以及反復(fù)的呼吸道感染癥狀[4]。

Chemes[5]發(fā)現(xiàn)了5名纖維鞘發(fā)育不良（dysplasia f the fibrous sheath, DFS）患者，精子95%～100%不活動，光鏡下形態(tài)呈短、粗和不規(guī)則尾。電鏡下纖維鞘及線粒體等整個鞭毛組裝異常，伴不同程度中心微管及動力蛋白臂缺失[3, 5]。DFS可能為常染色體隱性遺傳，一般發(fā)病率低于PCD[3]。DFS在中國人群中僅見個別確診或可疑病例報道，發(fā)病率不詳[6-9]。我們最近報道了中國DFS患者，但初步的遺傳學(xué)分析未發(fā)現(xiàn)致病基因[10]。

目前已經(jīng)有多種動物基因敲除模型用來研究人類精子鞭毛異常，也為DFS研究提供工具[11]。精子鞭毛蛋白2（sperm flagella protein 2，SPEF2）和減數(shù)分裂特異性蛋白1（meiosis-specific nuclear structural rotein 1，MNS1）基因突變小鼠精子表型與人類

FS相似[12,13]，故作為候選基因?qū)?例患者進(jìn)行測序分析。

資料與方法

一、臨床資料

2012年12月至2014年6月來我院就診的不育男性例，原發(fā)不育2～7年。均為漢族，現(xiàn)居蘇州，病例1 和2籍貫蘇州，病例3籍貫山西。精液檢查提示為嚴(yán)重弱精子癥及嚴(yán)重精子鞭毛畸形。病例1在1歲時有急性肺炎病史以及慢性咳嗽。其余2例否認(rèn)反復(fù)呼吸道感染、鼻竇炎病史，未發(fā)現(xiàn)內(nèi)臟反位情況。生殖系統(tǒng)體格檢查未見異常，染色體核型分析均為正常核型。性激素和精漿抗精子抗體檢測未見異常。生殖系統(tǒng)超聲檢查，睪丸、附睪、精索靜脈、前列腺及精囊均未見特殊病變。病例1的父母為姨表親?；颊呔炇鹬橥鈺鴧⑴c本項研究，并獲得我院倫理委員會通過。

二、精子形態(tài)學(xué)分析

（一）光鏡下觀察

患者禁欲2～7d手淫取精，在37℃溫箱30min精液液化后，按照世界衛(wèi)生組織《人類精液檢查與處理實驗室手冊》第5 版標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行精液常規(guī)分析。存活率試驗采用伊紅-苯胺黑染色，著色精子為死精子。精子形態(tài)分析采用改良巴氏染色，計數(shù)200個精子尾部，將無尾、粗短尾、卷尾和不規(guī)則形記為DFS精子。不規(guī)則尾指精子尾部正常結(jié)構(gòu)難以辨認(rèn)，全部或部分被雜亂結(jié)構(gòu)占據(jù)。精液常規(guī)和精子形態(tài)學(xué)分析至少重復(fù)兩次。

（二）電鏡觀察

精液液化后，380×g 離心15min，0.1mol/L PBS洗滌2次，離心設(shè)定同前。使精子沉淀松散后緩慢加入2.5%戊二醛固定液固定12 h，PBS緩沖液沖洗2次，每次15min，之后經(jīng)過1%鋨酸后固定1 h，再經(jīng)過 PBS緩沖液沖洗2次，每次15min，需要觀察表面結(jié)構(gòu)的樣本經(jīng)過乙醇逐級脫水，100%丙酮和乙酸異戊酯置換后，進(jìn)行臨界點干燥和離子濺射噴金，最后在掃描電鏡（Stereoscan260, Cambridge, UK）下觀察。而需要觀察內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)的標(biāo)本在鋨酸后固定和PBS沖洗后，經(jīng)2%醋酸鈾染色，乙醇逐級脫水，100%丙酮置換，用環(huán)氧樹脂Epon 812包埋，切片機(jī)超薄切片，醋酸鈾與檸檬酸鉛雙重染色，最后在透射電鏡（TECNAI-10; Philips, Amsterdam, Netherlands）下觀察精子尾部超微結(jié)構(gòu)。

三、遺傳學(xué)分析

抽血患者外周血2 m l（E D TA抗凝），應(yīng)用 QIAamp mini blood kit外周血DNA提取試劑盒（Qiagen，德國）提取基因組DNA。根據(jù)SPEF2 基因（Genbank ID：NC_000005）和MNS1（Genbank ID：NC_000015）外顯子及其側(cè)翼區(qū)堿基序列，采用Premer Premier 6.0 軟件設(shè)計相應(yīng)引物，引物交由上海捷瑞公司合成。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳30min，溴化乙錠染色，于凝膠成像系統(tǒng)中觀察PCR產(chǎn)物特異性。PCR產(chǎn)物純化后再行雙向測序PCR反應(yīng)，并將產(chǎn)物再次純化后于ABI 3130遺傳分析儀毛細(xì)管電泳。應(yīng)用DNAstar軟件將測序結(jié)果與Genebank的參考序列進(jìn)行對比，確定突變位點。

結(jié) 果

一、精液基本參數(shù)

經(jīng)過多次精液檢測3例患者均表現(xiàn)為無活動精子，病例2 在1份精液標(biāo)本中偶見微動精子。3個病例的精液量和pH值基本正常，精子濃度正?；蚱停哟婊盥史謩e為26%、30%～80%和35.6%。光鏡下形態(tài)分析，精子頭部形態(tài)無特殊異常，尾部出現(xiàn)嚴(yán)重的畸形，突出表現(xiàn)為精子主段增粗、無尾、短尾和卷尾，符合DFS的診斷標(biāo)準(zhǔn)（圖1）。根據(jù)DFS缺陷精子的比例，病例1（94.5%）和病例2（99.5%）診斷為完全型DFS，病例3（79.5%）診斷為不完全型DFS。見表1。

二、精子超微結(jié)構(gòu)特點

與光鏡觀察相比，掃描電鏡更加清晰地觀察到精子尾部畸形，部分精子尾部僅存末段樣的結(jié)構(gòu)（圖2A2A）。在透射電鏡下，縱切面可見精子纖維鞘以及線粒體等細(xì)胞器未能在正常的位置完成組裝，而是紊亂的堆積在精子尾部（圖2B2B）。橫斷面可見精子纖維鞘明顯增厚，病例1～3精子中心微管缺失率分別為59%, 78%和 62%。內(nèi)、外側(cè)動力蛋白臂不同程度缺失（圖2C2C）。

三、測序結(jié)果

3例患者的MNS1和SPEF2基因所有外顯子區(qū)均無致病意義突變產(chǎn)生。

圖1 光鏡下DFSDFS精子形態(tài)

表1 DFS病例的精液特點

圖2 DFS精子超微結(jié)構(gòu)變化

討 論

鞭毛是精子的運動裝置，嚴(yán)重弱精子癥可源于精子鞭毛結(jié)構(gòu)異常[3]。本組病例均表現(xiàn)為100%不動精子，病例2在其中一次檢測中偶見微動精子。光鏡下形態(tài)分析，79.5%～99.5%的精子出現(xiàn)粗、短和不規(guī)則尾，符合DFS精液特點[5]。根據(jù)DFS缺陷精子所占比例，病例1和2為完全型DFS，病例3為不完全型DFS[14]。通過超微結(jié)構(gòu)分析，精子活力的完全喪失更可能與精子動力蛋白臂缺失相關(guān)，與受累精子比例無明確關(guān)系。本研究中精子存活率為26%～80%不等，即使精子存活率為0%，DFS也并非繼發(fā)于死精子癥[14, 15]。

透射電鏡可以對精子尾部超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，并指導(dǎo)治療方式和病因?qū)W研究。當(dāng)前向運動精子率≤7%且存活率＞50%時，可能存在源于遺傳學(xué)因素的精子鞭毛超微結(jié)構(gòu)異常[16]。雖然3個病例在光鏡下表現(xiàn)相近，但超微結(jié)構(gòu)存在差別。中心微管和動力蛋白臂缺失率不同，這提示不同的分子基礎(chǔ)。DFS是精子纖維鞘組裝異常為共同表現(xiàn)的綜合征，是整個精子鞭毛的組裝異常。DFS精子免疫熒光顯示纖維鞘成分散，纖維鞘結(jié)紊亂和不完全組裝；多數(shù)精子線粒體鞘減少、組裝異?；蛉笔17]。

卵胞漿內(nèi)單精子注射（intra-cytoplasmic sperm injection，ICSI）使包括DFS在內(nèi)的多種精子鞭毛異常男性有機(jī)會生育后代[18]。但隨之帶來遺傳風(fēng)險，有必要探尋DFS的分子病因以進(jìn)行遺傳咨詢。A激酶錨定蛋白3（A-kinase anchoring proteins 3，AKAP3）和AKAP4是精子纖維鞘的主要成分并參與調(diào)節(jié)精子運動[19]。研究發(fā)現(xiàn)5例DFS患者中1例AKAP3、AKAP4基因缺失突變[20]。但是并未發(fā)現(xiàn)其余的DFS患者存在AKAP3和AKAP4基因突變[17, 21, 22]。最近，動力蛋白重鏈基因1（dynein heavy chain 1，DNAH1）被確認(rèn)為部分北非DFS男性的遺傳基礎(chǔ)[23]。我們對6例中國DFS患者的AKAP3和AKAP4全外顯子，以及包含上已報道突變位點的DNAH1基因4個外顯子進(jìn)行測序，未發(fā)現(xiàn)病理性突變[10]。

豬罹患的一種常染色體隱性遺傳病，不活動短尾精子（immotile short tail sperm，ISTS）精子表型類似DFS[24]。這種疾病是由于SPEF2基因插入突變導(dǎo)致[25]。SPEF2基因突變小鼠伴有精子纖維鞘發(fā)育異常和嚴(yán)重精子尾部畸形[12]。但是本組3例患者SPEF2基因的全外顯子測序，并沒有發(fā)現(xiàn)病理性突變。小鼠MNS1對精子鞭毛組裝十分重要，特異性表達(dá)于睪丸，肺和卵巢少量表達(dá)，編碼軸絲蛋白，蛋白表達(dá)于晚期粗線期精子細(xì)胞、雙線期生精細(xì)胞和精子細(xì)胞；突變小鼠表現(xiàn)為不活動短尾精子，軸絲微管和動力臂異常，精子主段缺失[13]。MNS1蛋白存在于人類精子鞭毛[26]，突變小鼠精子表型類似人類DFS，但3例患者M(jìn)NS1基因測序未能發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果。從動物模型推測DFS遺傳學(xué)病因在本研究中并未奏效，新一代測序技術(shù)可能為DFS研究帶來突破。

DFS在中國人群中鮮有報道，作為不動精子癥或嚴(yán)重弱精子癥的一種病因，值得臨床關(guān)注。對可疑病例通過光鏡下精子形態(tài)觀察做出初步診斷，并建議根據(jù)超微結(jié)構(gòu)分型。DFS患者的遺傳學(xué)病因研究，可能對人類精子形成機(jī)制和弱精子癥的病因帶來新的認(rèn)識。

參 考 文 獻(xiàn)

1 Pierik FH, Van Ginneken AM, Dohle GR, et al. The advantages of standardized evaluation of male infertility. Int J Androl 2000; 23(6): 340-346

2 Ortega C, Verheyen G, Raick D, et al. Absolute asthenozoospermia and ICSI: what are the options. Hum Reprod Update 2011; 17(5): 684-692

3 Chemes EH, Rawe YV. Sperm pathology: a step beyond descriptive morphology. Origin, characterization and fertility potential of abnormal sperm phenotypes in infertile men. Hum Reprod Update 2003, 9(5): 405-428

4 Leigh MW, Pittman JE, Carson JL, et al. Clinical and genetic aspects of primary ciliary dyskinesia/ Kartagener syndrome. Genet Med 2009; 11(7): 473-487

5 Chemes HE, Brugo S, Zanchetti F, et al. Dysplasia of the fi brous sheath: an ultrastructural defect of human spermatozoa associated with sperm immotility and primary sterility. Fertil Steril 1987; 48(4): 664-669

6 楊慎敏, 李錚, 李紅. 精子纖維鞘發(fā)育不良的研究進(jìn)展.中華男科學(xué)雜志 2014; 20(11): 1035-1038

7 李滿, 莊廣倫, 周燦權(quán), 等. 卵漿內(nèi)單精子注射治療精子尾部發(fā)育不良不育1例. 生殖醫(yī)學(xué)雜志 2000; 9(3): 178-179

8 林謙, 白文俊, 鄭姝穎, 等. 重度特發(fā)性弱精子癥患者精子鞭毛超微結(jié)構(gòu)的研究: 附22例報告. 中華男科學(xué)雜志2014; 20(2): 156-159

9 劉鋒, 丘映, 王東瑋, 等. 用ICSI治療纖毛運動障礙不育患者1例報告. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報 2001; 23(7): S131-S134

10 Yang SM, Li HB, Wang JX, et al. Morphological characteristics and initial genetic study of multiple morphological anomalies of the fl gella in China. Asian J Androl 2015; 17(3): 513-515

11 Escalier D. Knockout mouse models of sperm fl agellum anomalies. Hum Reprod Update 2006; 12(4): 449-461

12 Sironen A, Kotaja N, Mulhern H, et al. Loss of SPEF2 function in mice results in spermatogenesis defects and primary ciliary dyskinesia. Biol Reprod 2011; 85(4): 690-701

13 Zhou J, Yang F, Leu NA, et al. MNS1 is essential for spermiogenesis and motile ciliary functions in mice. PLoS Genet 2012; 8(3): e1002516

14 Chemes HE, Olmedo SB, Carrere C, et al. Ultrastructural pathology of the sperm fl agellum: association between fl agellum pathology and fertility prognosis in severely asthenozoospermic men. Hum Reprod 1998; 13(9): 2521-2526

15 Toyama Y, Sumiya H, Fuse H, et al. A case of an infertile man with short-tailed spermatozoa. Andrologia 1996; 28(2): 81-87

16 Francavilla S, Pelliccione F, Cordeschi G, et al. Utrastructural analysis of asthenozoospermic ejaculates in the era of assisted procreation. Fertil Steril 2006; 85(4): 940-946

17 Baccetti B, Collodel G, Gambera L, et al. Fluorescence in situ hybridization and molecular studies in infertile men with dysplasia of the fibrous sheath. Fertil Steril 2005; 84(1):123-129

18 Mitchell V, Rives N, Albert M, et al. Outcome of ICSI with ejaculated spermatozoa in a series of men with distinct ultrastructural flagellar abnormalities. Hum Reprod 2006; 21(8): 2065-2074

19 Eddy EM, Toshimori K, O'Brien DA. Fibrous sheath of mammalian spermatozoa. Microsc Res Tech 2003; 61(1): 103-115

20 Baccetti B, Collodel G, Estenoz M, et al. Gene deletions in an infertile man with sperm fi brous sheath dysplasia. Hum Reprod 2005; 20(10): 2790-2794

21 Turner RM, Musse MP, Mandal A, et al. Molecular genetic analysis of two human sperm fibrous sheath proteins, AKAP4 and AKAP3, in men with dysplasia of the fi brous sheath. J Androl 2001; 22(2): 302-315

22 Turner RM, Foster JA, Gerton GL, et al. Molecular evaluation of two major human sperm fibrous sheath proteins, pro-hAKAP82 and hAKAP82, in stump tail sperm. Fertil Steril 2001; 76(2): 267-274

23 Ben KM, Coutton C, Zouari R, et al. Mutations in DNAH1, which encodes an inner arm heavy chain dynein, lead to male infertility from multiple morphological abnormalities of the sperm fl agella. Am J Hum Genet 2014; 94(1): 95-104

24 Sironen AI, Andersson M, Uimari P, et al. Mapping of an immotile short tail sperm defect in the Finnish Yorkshire on porcine Chromosome 16. Mamm Genome 2002; 13(1): 45-49

25 Sironen A, Thomsen B, Andersson M, et al. An intronic insertion in KPL2 results in aberrant splicing and causes the immotile short-tail sperm defect in the pig. Proc Natl Acad Sci U S A 2006; 103(13): 5006-5011

26 Amaral A, Castillo J, Estanyol JM, et al. Human sperm tail proteome suggests new endogenous metabolic pathways. Mol Cell Proteomics 2013; 12(2): 330-342

（2015-01-08收稿）

**共同通訊作者: 楊慎敏, E-mail: drim2004@126.com, Tel: 13584891093; 馬林偉, E-mail: xht800703@163.com

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2015.03.004

中圖分類號R 698.2

*基金項目資助: 蘇州市科教興衛(wèi)青年項目（KJXW2013025）; 鹽城市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展計劃項目（YK2014058）

A preliminary study on morphology and genetics of dysplasia of the fi brous sheath (3 cases report)*

Wang Jiaxiong1, Yang Shenmin1**, Ma Linwei2**, Cheng Hongbo1, Li Haibo1
1. Center for Reproduction and Genetics, Suzhou Hospital Affiliated to Nanjing Medical University, Suzhou 215002,

Jiangsu, China; 2. Yancheng Institute of Health Sciences
Corresponding author: Yang Shenmin, E-mail: drim2004@126.com, Tel: 13584891093; Ma Linwei, E-mail: xht800703@163.com

AbstractObjective To analyze the sperm morphological characteristics of dysplasia of the fi brous sheath (DFS), and explore the possible genetic origin. Methodsthods Three patients with DFS were identifi ed among severe asthenospermia cases, and their semen samples were collected. Ultra-structural features of semen were studied by scanning and transmission electron microscopy (SEM and TEM). Exons of candidate genes MNS1 and SPEF2 were sequenced to search the mutations. Resultssults Analysis of semen samples from all the three patients showed 100% (or nearly) immotility in sperms, and 26%～80% viability in sperms. The morphological assessment under light and SEM presented severe distorted sperm tails, such as absence, short and thick, coiled, and irregular. The affected spermatozoa were 99.5%, 97.5% and 79.5% respectively. In TEM assays, most spermatozoa showed disorganized fi brous sheath, accompanied by distortion of various cytoskeletal components. The absence of central microtubules (59% to 78%) and dynein arms were observed. No likely pathogenic variants in MNS1 and SPEF2 were identifi ed. Conclusionusion DFS is one cause of severe asthenospermia, and the genetic origin deserves further study.

Key wordsords spermatozoa/ ultrastructure; asthenozoospermia; fl agella