汪 丹，蔡 甜，吳志軍，謝萬霓，鄒 亮

(1.成都大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與護(hù)理學(xué)院，四川 成都 610106;2.四川大學(xué) 華西藥學(xué)院，四川 成都 610041;3.中國科學(xué)院 成都有機(jī)化學(xué)所，四川 成都 610041;4.中國科學(xué)院 成都生物研究所，四川 成都 610041;5.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院，四川 成都 610072)

0 引 言

金錢草是一種常見中藥材，它為報(bào)春花科植物過路黃的干燥全草.中醫(yī)認(rèn)為，金錢草主治濕熱黃疸、癰腫疔瘡等癥［1］.研究表明，金錢草含有多種化學(xué)成分，如黃酮、酚酸、萜類等［2－4］.中藥材的成分組成和含量與藥材產(chǎn)地及生長周期密切相關(guān)，傳統(tǒng)的分離純化鑒定方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且存在大量已知的化學(xué)成分被多次重復(fù)分離的問題，而分離所消耗的原藥材和試劑的用量大，不便于快速篩選不同產(chǎn)地之間金錢草的化學(xué)成分的差異及尋找未報(bào)到的新化合物［5－6］.此外，傳統(tǒng)的高效液相色譜法在缺乏對(duì)照品時(shí)，難以對(duì)所檢測到的色譜峰提供有效的檢測信息，故需要用一種靈敏度高、專屬性好的分析方法對(duì)天然產(chǎn)物的成分來進(jìn)行快速準(zhǔn)確檢測［7－8］.目前，已有文獻(xiàn)記錄采用液質(zhì)聯(lián)用的方式分析天然產(chǎn)物的化學(xué)成分，依靠質(zhì)譜檢測到準(zhǔn)分子離子峰或碎片離子峰并進(jìn)行分析，能快速獲取分子式及結(jié)構(gòu)信息，并經(jīng)過鑒定得到其化學(xué)成分［9］.在此基礎(chǔ)上，本研究建立了一種LC-ESI-MS(Q-TOF)方法，來對(duì)野生采集的金錢草進(jìn)行定性檢測分析.

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材 料.

金錢草采集于四川省資陽市雁江區(qū)，經(jīng)中國科學(xué)院成都生物研究所顧建教授鑒定為報(bào)春花科植物過路黃的全草.

1.1.2 試 劑.

實(shí)驗(yàn)所用試劑包括:甲醇(Fisher Scientic Pittsburgh，PA，USA)，無水乙醇(成都市科龍化工試劑廠)，蒸餾水.

1.1.3 儀 器.

實(shí)驗(yàn)所用儀器包括:Agilent 1100 系列高效液相色譜儀(四元泵、二極管陣列檢測器、自動(dòng)進(jìn)樣器和柱溫箱使用)(美國安捷倫儀器公司)，Bruker micrOTOF-Q 質(zhì)譜儀(德國布魯克道爾頓儀器公司)，F(xiàn)W-100型高速萬能粉碎機(jī)(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)，SHIMADZU AUX120 萬分之一電子天平(日本島津儀器公司)RE2000 型旋蒸揮發(fā)儀(上海雅榮儀器公司).

1.2 方 法

1.2.1 金錢草粗提物的制備.

稱取金錢草粉末(1.000 g)，精密稱定，置于50 mL 圓底燒瓶中，加入25 mL 80%乙醇溶液，浸漬24 h 后，于50 ℃超聲提取30 min，過濾;藥渣再加25 mL 80%乙醇，超聲提取1 次，過濾;合并兩次提取的濾液，于40 ℃下減壓回收制備金錢草粗提物.

1.2.2 空白樣品制備.

同“1.2.1”項(xiàng)下制備方法，不加藥材，制備得空白樣品.

1.2.3 樣品及空白樣品溶液的制備.

將“1.2.1”項(xiàng)和“1.2.2”項(xiàng)制備的金錢草粗提取物和空白樣品，用2 mL 80%乙醇溶液超聲15 min溶解，離心(12 000 r/min)，取上清液，制得樣品和空白樣品溶液，待LC-MS 測定分析.

1.2.4 色譜條件.

色譜柱為，Inertsil ODS-4(C18 柱，5μm 4.6 mm×250 mm，Inertsil ODS-4 GL Sciences Inc)，柱溫30℃.二元線性梯度洗脫，流動(dòng)相為，A 相［水(1‰甲酸)］、B 相(甲醇).梯度為:0 ～2 min 100%A;6 min 92%A 8%B;8 min 65%A 35%B;10 min 50%A 50%B;14 min 40% A 60%B;20 min 30%A 70%B;26 min 20%A 80%B;32 min 10%A 90%B;52 min 6%A 94%B;62～80 min 100%B.流速為0.8 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL.

1.2.5 質(zhì)譜條件.

質(zhì)量分辨率為，10 ×103FWHM(半峰全寬)、922 u.氦氣用作碰撞氣體，高純度氮?dú)庾鳛殪F化器和干燥氣體的流速為0.5 L/min 和4.0 L/min.ESI源條件為:毛細(xì)管電壓為－4 500 V，端板電壓－4 000 V;毛細(xì)管出口電壓120 V，干燥氣體的溫度180 ℃.將0.8 mL/min 的液相流出液，利用三通管分流去掉約93%后，再連接進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)樣，采集二級(jí)質(zhì)譜時(shí)，分別用15 eV、35 eV 的碰撞能量對(duì)樣品進(jìn)行轟擊，以獲得碎片離子峰.同時(shí)，用布魯克指南針軟件(Data Analysis 處理4.0 軟件)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理.

在實(shí)驗(yàn)中，共檢測到295 個(gè)準(zhǔn)分子離子峰，其中篩除掉空白樣品的離子峰、在一級(jí)質(zhì)譜中出現(xiàn)的二級(jí)質(zhì)譜碎片離子峰、糖類物質(zhì)離子峰后，獲得能確定分子式的物質(zhì)峰共計(jì)43 個(gè).在檢測到的這43 種物質(zhì)中，已有文獻(xiàn)報(bào)道的物質(zhì)有12 個(gè)［2－8］，剩余的31個(gè)物質(zhì)，在金錢草化學(xué)成分中未被報(bào)道過.本研究依據(jù)檢測到的這31 種化合物的分子量，首次報(bào)道確立了其分子式、結(jié)構(gòu)特征，并依據(jù)結(jié)構(gòu)特征峰，推論新發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物2 個(gè).所測到的43 種物質(zhì)峰詳情見表1.

2 結(jié)果與討論

本研究利用LC-ESI-MS 方法檢測到的新化合物集中在圖1 中的14 min 到39 min 之間出現(xiàn)，其各峰的保留時(shí)間、測得的精確分子量、誤差、檢測到的準(zhǔn)分子式、化合物分子式、結(jié)構(gòu)推理等信息見表1.

圖1 一級(jí)質(zhì)譜及二級(jí)質(zhì)譜總離子流圖

表1 中，化合物4、6、8、10、11、14、15、16、17、18、19、25、27、31 的質(zhì)譜二級(jí)碎片顯示其結(jié)構(gòu)為黃酮類化合物，其中，化合物4 和化合物10 在已有的文獻(xiàn)中未被報(bào)道過，屬于第一次發(fā)現(xiàn)的新化合物，化合物25、27 用標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比確認(rèn)為槲皮素和山奈酚，其余的化合物與化合物25 或化合物27 有相同的黃酮母核，故確定上述檢測化合物均為黃酮類化合物.因在負(fù)離子模式下能夠檢測到物質(zhì)峰的化合物必須含有羧酸根或多羥基的結(jié)構(gòu)，故化合物1、2、3、5、7、9、12、13、16、20、21、22、23、24、26、29、30、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43 均為酚類或酸類化合物，其中，化合物37、38、42 為不易打碎的鏈狀結(jié)構(gòu)，故推論為脂肪酸.

3 結(jié) 語

利用LC-ESI-MS 分析方法可以快速而準(zhǔn)確地對(duì)金錢草乙醇提取物進(jìn)行分析.本研究通過對(duì)資陽產(chǎn)金錢草的相關(guān)分析，共檢測到化學(xué)成分43 種，其中除已有文獻(xiàn)報(bào)到的黃酮類組分12 種，還檢測到31 種未知化學(xué)組分，尤其是發(fā)現(xiàn)了該產(chǎn)地的金錢草中含有2 種未被報(bào)道過的黃酮類活性成分(化合物4 和化合物10).本研究表明，LC-ESI-MS 方法可為不同產(chǎn)地金錢草藥材化學(xué)成分的鑒定、有效成分的快速篩選與發(fā)現(xiàn)新的活性成分，提供一種有效的解決方案.

［1］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典(一部)［S］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010.

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表1 新化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)信息及分子式

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