鄧政東　程愛芳　蒲玉婷

摘要：以黑木耳為原料，采用磷酸緩沖液浸提，在料液比、浸提時(shí)間、浸提溫度等單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以研究黑木耳凝集素的最佳提取工藝。結(jié)果表明，以磷酸鹽緩沖液為提取劑，料液比1 g ∶15 mL，提取溫度為 30 ℃，提取時(shí)間為16 h條件下，黑木耳凝集素的凝集活性最高，達(dá)到0.742。

關(guān)鍵詞：黑木耳；凝集素；提取工藝；凝集活性

中圖分類號(hào)： S646.601；R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）03-0259-02

黑木耳（Auricularia auricula）營(yíng)養(yǎng)豐富，是我國(guó)傳統(tǒng)的食藥兼用菌，含有多糖、凝集素、三萜類等藥用成分，具有提高免疫功能、抗癌、降血脂等功效。隨著雙孢菇、靈芝、金針菇和口蘑等真菌凝集素及抗腫瘤效果的發(fā)現(xiàn)，真菌凝集素的作用被逐漸認(rèn)識(shí)，它具有凝集細(xì)胞、活化淋巴細(xì)胞、免疫調(diào)節(jié)、抑制癌細(xì)胞、抑制植物病原真菌等作用[1-3]。我國(guó)是黑木耳的生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，研究黑木耳中包括凝集素在內(nèi)的多種活性成分的提取工藝，對(duì)黑木耳的開發(fā)和利用具有重要意義。本研究利用磷酸緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）浸提法，采用正交試驗(yàn)，優(yōu)化提取工藝條件，以期為黑木耳凝集素在食品、醫(yī)藥、保健方面的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

黑木耳干品從市場(chǎng)購(gòu)買，經(jīng)粉碎、篩分、密封后存放于陰涼處備用。雞血由武漢生物工程學(xué)院基礎(chǔ)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。試驗(yàn)所需試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黑木耳凝集素的提取方法 取黑木耳干品粉末2.5 g，選取合適的提取試劑，以料液比1 g ∶20 mL在4 ℃條件浸提過夜。浸提液經(jīng)過濾，4 000 r/min冷凍離心30 min。上清液加入固體硫酸銨至飽和度為50%，4 ℃鹽析12 h。沉淀經(jīng)冷凍離心、透析后，用PBS溶解，獲得凝集素粗品。

1.2.2 凝集活性的測(cè)定 采用孫冊(cè)等的方法[4]，檢測(cè)凝集效價(jià)，即凝集素倍比稀釋后，加入等量的2%雞紅細(xì)胞懸液，靜置1 h觀察結(jié)果。根據(jù)紅細(xì)胞凝集分類標(biāo)準(zhǔn)，判定紅細(xì)胞凝集效價(jià)[5]。參照趙則海等的方法[6]，對(duì)凝集效價(jià)定性數(shù)據(jù)賦值，取其加權(quán)平均數(shù)作為量化的凝集活性（agglutinating activity，Aa）。以凝集活性為指標(biāo)，篩選提取的最佳工藝。

1.2.3 提取劑的選擇 分別以PBS（0.05 mol/L，pH值7.2）、0.9%NaCl、蒸餾水作為提取劑，提取黑木耳凝集素，血凝法檢測(cè)凝集效價(jià)和凝集活性，確定最佳提取試劑。

1.2.4 單因素試驗(yàn) 以黑木耳凝集素的凝集活性為指標(biāo)，以PBS為提取試劑進(jìn)行單因素試驗(yàn)。料液比分別為 1 g ∶10 mL、1 g ∶15 mL、1 g ∶20 mL、1 g ∶25 mL、1 g ∶30 mL；提取溫度分別為4、20、30、40 ℃；提取時(shí)間分別為6、12、18、24 h，確定各因素對(duì)試驗(yàn)的影響。

1.2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取料液比、提取溫度、提取時(shí)間3個(gè)因素，以凝集活性為指標(biāo)，進(jìn)行L9（33）正交試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1，對(duì)黑木耳凝集素的提取最佳工藝進(jìn)行研究 [7-8]。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 料液比對(duì)黑木耳凝集素凝集活性的影響 由圖2可知，隨著提取劑PBS用量的增大，提取的凝集素凝集活性也增大，料液比1 g ∶15 mL時(shí)，凝集活性基本達(dá)到最高；此后隨著提取劑用量的增加，凝集素凝集活性有下降的趨勢(shì)。提取劑用量少會(huì)導(dǎo)致提取率低和提取液黏稠，而用量過多會(huì)使提取液濃縮工作的負(fù)荷增加，因此確定最佳料液比為 1 g ∶15 mL。

2.2.2 提取溫度對(duì)黑木耳凝集素凝集活性的影響 由圖3可知，在4～30 ℃，黑木耳凝集素的凝集活性隨溫度升高而增加，30 ℃時(shí)達(dá)到最高；溫度超過30 ℃時(shí)，凝集活性明顯下降。結(jié)果表明黑木耳凝集素對(duì)溫度比較敏感，提取溫度過高可能導(dǎo)致凝集素變性失活，凝集活性下降，因此提取溫度應(yīng)選擇30 ℃。

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)黑木耳凝集素凝集活性的影響 由圖4可知，提取時(shí)間在12 h以內(nèi)，黑木耳凝集素的凝集活性隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，12 h時(shí)達(dá)到峰值；此后，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，凝集素的凝集活性緩慢下降。綜合考慮凝集素的提取率、凝集活性以及提取進(jìn)度，確定提取時(shí)間為12 h。

2.3 正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)結(jié)果和極差分析見表2，方差分析結(jié)果見表3。影響黑木耳凝集素提取因素的主要順序?yàn)椋禾崛r(shí)間（C）>提取溫度（B）>料液比（A）。由表3可知，因素C有顯著差異，說明提取時(shí)間對(duì)凝集素凝集活性的影響最明顯；因素A、B沒有顯著差異，對(duì)凝集素凝集活性沒有顯著性影響。結(jié)合極差和方差分析、單因素試驗(yàn)，確定黑木耳凝集素提取的最佳工藝參數(shù)是A1B2C3，即提取溫度30 ℃、料液比1 g ∶15 mL，浸提時(shí)間16 h。此組合沒有出現(xiàn)在正交表中，經(jīng)過3次驗(yàn)證試驗(yàn)后，提取的凝集素的凝集活性平均為0.742，大于正交組合中的任一組合。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)以單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)相結(jié)合，對(duì)黑木耳凝集素提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳提取工藝為：以PBS為提取劑，料液比1 g ∶15 mL，提取溫度30 ℃，提取時(shí)間為 16 h，經(jīng)飽和度50%的硫酸銨鹽析、透析后，獲得的黑木耳凝集素的凝集活性達(dá)到0.742。

本試驗(yàn)以凝集素的凝集活性為指標(biāo)，考察不同因素對(duì)提取的影響。在血凝法試驗(yàn)中，如何確定凝集素提取液的凝集效價(jià)比較困難。相比較其他方法，通過對(duì)凝集效價(jià)加權(quán)平均數(shù)獲得量化的凝集活性，在凝集素提取及凝集活性研究中，可操作性更強(qiáng)。由于凝集素的本質(zhì)是蛋白質(zhì)或糖蛋白，蛋白質(zhì)含量與凝集活性之間有相關(guān)性，因此在凝集素的提取過程中，可以參考蛋白質(zhì)的提取和檢測(cè)方法。

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