郭潔　袁洪水

摘要：為了得到多糖收率較高的冬蟲夏草菌株，從西藏那曲地五高山草甸中采集的新鮮冬蟲夏草子實(shí)體初步分離得到50株菌株，并對(duì)其進(jìn)行形態(tài)觀察和18S rDNA-ITS序列分析鑒定，采用超聲輔助熱水浸提法進(jìn)行冬蟲夏草多糖的提取。結(jié)果表明，CC-3菌株Cladosporium sp.的模式菌株JN084020的18S rDNA-ITS同源相似性為100%，初步確定為冬蟲夏草的無性型，經(jīng)過超聲輔助熱水浸提后多糖收率最高為6.619%。

關(guān)鍵詞：冬蟲夏草；真菌；篩選；rDNA-ITS序列；Cladosporium sp.

中圖分類號(hào)： S182 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）03-0240-03

冬蟲夏草（Ophiocordyceps sinensis）是中國傳統(tǒng)的名貴中藥材，系麥角菌科蟲草屬真菌寄生于蝙蝠蛾的幼蟲所形成的的菌蟲復(fù)合體[1]。2001年統(tǒng)計(jì)，全球冬蟲夏草種類已有400種，其中中國記載有105種左右[2]。

冬蟲夏草在中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)里已經(jīng)流傳1 300多年，最早記載冬蟲夏草的文獻(xiàn)始于唐朝前期公元710年的《月王藥診》，記載冬蟲夏草能治療肺部疾病。公元780年《藏本草》記載的冬蟲夏草具有潤肺、補(bǔ)腎的作用；1765年，趙學(xué)敏在《本草綱目拾遺》中記載冬蟲夏草的作用是潤肺、補(bǔ)腎、益精氣，理諸虛百損；1757年，吳儀洛所著《本草從新》中指出冬蟲夏草保肺益腎，止血化痰。其后，《黔囊》《文房肆考》《四川通志》《本草圖說》等100多部古書都記載了冬蟲夏草名貴藥材[3]。

目前，研究證實(shí)冬蟲夏草有降血糖、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、抗纖維化、抗炎等功效，對(duì)肺臟、腎臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、心臟、肝臟等均有較好的臨床保護(hù)作用[4]。由于冬蟲夏草的生長環(huán)境及人們過于采挖，冬蟲夏草已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足醫(yī)療的需求，人們開始研究冬蟲夏草成分與功能的關(guān)系，冬蟲夏草多糖作為冬蟲夏草的重要活性成分，具有抗疲勞、抗衰老、提高免疫力的作用[5-6]。表明冬蟲夏草多糖在新藥開發(fā)方面有廣闊的前景。

已報(bào)道的冬蟲夏草的無性型菌株涉及13個(gè)屬，22個(gè)種名[7]，包括細(xì)腳擬青霉（Paecilomyces tenuipes）、蟲草蚧霉屬（Lecanicilliuum sp.）、輪枝孢屬（Verticillium sp.）、被毛孢屬（Hirsutella）、頭孢屬（Cephalosporium sp.）等，其中部分冬蟲夏草的無性型還有待進(jìn)一步確定[8]。冬蟲夏草的無性型研究已成為研究熱點(diǎn)。

本研究分離篩選了50株能夠產(chǎn)多糖的菌株，分子生物學(xué)鑒定分別為蟲草蚧霉屬、枝孢菌屬、黑粉菌屬。超聲輔助熱水浸提法提取冬蟲夏草多糖，CC-3菌株的多糖得率最高為6.619%。研究結(jié)果為應(yīng)用發(fā)酵方法生產(chǎn)冬蟲夏草多糖替代冬蟲夏草應(yīng)用于醫(yī)療，以及進(jìn)一步確定冬蟲夏草多糖的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮冬蟲夏草采自西藏那曲地五高山草甸。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

PDA加富培養(yǎng)基：土豆200 g/L、葡萄糖20 g/L、酵母膏 1 g/L、蛋白胨1 g/L、KH2PO4 1g /L、瓊脂240 g/L、MgSO4 0.5 g/L、蠶蛹粉1 g/L。pH值6.7，121 ℃蒸汽滅菌30 min。

種子瓶液體培養(yǎng)基：KH2PO4 3 g/L、MgSO4 1.5 g/L、蛋白胨10 g/L、葡萄糖20 g/L。pH值6.7，121 ℃蒸汽滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖9 g/L、麥芽糖19 g/L、蛋白胨 10 g/L、KH2PO4 0.5 g/L、MgSO4 1 g/L、MnSO4 0.5 g/L。pH值6.7，121 ℃蒸汽滅菌30 min。

CTAB提取液：NaCl 1.4 mol/L、EDTA 20 mmol/L、CTAB 20 g/L、Tris-Cl 100 mmol/L、巰基乙醇2 g/L、pH值8.0。

苯酚 ∶氯仿 ∶異戊醇溶液=25 ∶24 ∶1。

RNA酶：1 mg/mL。

真菌通用引物：ITS1和ITS4。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 冬蟲夏草菌株的分離純化

無菌條件下將新鮮的冬蟲夏草用1%HgCl2溶液消毒，用無菌水沖洗干凈，并用無菌的濾紙吸干表面的水分，分離冬蟲夏草的蛹體和子座部分，分別研磨成粉，用無菌濕棉簽蘸取粉末涂于加入氯霉素1 g/L 的PDA加富平板上，倒置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)。挑選菌絲色澤潔白、生長健壯、無雜菌污染的菌株，轉(zhuǎn)接加入氯霉素1 g/L 的PDA加富試管斜面中，28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～10 d，直至整個(gè)斜面都長滿菌絲，選取生長健壯，無雜菌的菌株即為分離得到的菌株。

1.3.2 菌種的鑒定

1.3.2.1 菌體形態(tài)觀察

將分離得到的菌株梯度劃線接種于PDA平板中，用無菌鑷子取無菌蓋玻片，斜插入培養(yǎng)基中，每天觀察并記錄菌落生長情況，7 d后，拔出插片，顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)及產(chǎn)孢形式。

1.3.2.2 菌株的ITS序列測定

（1）基因組DNA的提取。采用CTAB法[9]提取基因組DNA。

（2）ITS序列分析。

ITS序列引物為真菌通用引物，ITS1和ITS4[10]。ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；

ITS4：5′- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（25 μL）：DNA 2 μL、TaqDNA聚合酶0.3 μL、10×TaqBuffer（含Mg2+）2.5 μL、ITS1 2 μL、ITS4 2 μL、dNTP 2 μL、ddH2O 14.2 μL。endprint

PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性30 s、55 ℃ 退火30 s、72 ℃ 延伸50 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

（3）瓊脂糖凝膠電泳及測序。

PCR產(chǎn)物擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，條帶清晰，用蛋白核酸測定儀測定后無蛋白和核酸殘留，送北京寶銳通生物技術(shù)有限公司測序。

（4）ITS測序數(shù)據(jù)分析。

在NCBI中對(duì)菌株的ITS序列進(jìn)行BLAST分析，然后用MEGA5進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.3.3 提取冬蟲夏草多糖

1.3.3.1 冬蟲夏草菌絲體的制備

在無菌條件下挖取1 cm2的分離菌株的培養(yǎng)菌苔接種于裝有100 mL種子培養(yǎng)基的三角瓶（容量500 mL）中，180 r/min、28 ℃搖床培養(yǎng)7 d。

按10%的接種量，接種于裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶（容量500 mL）中，180 r/min、28 ℃搖床培養(yǎng)7 d。

發(fā)酵液 8 000 r/min 離心10 min。收菌絲體、80 ℃烘干、粉碎、過80目篩，備用。

將烘干的冬蟲夏草菌絲體粉碎，過40目篩，備用。

1.3.3.2 超聲輔助熱水浸提法提取冬蟲夏草多糖

取干燥恒重的冬蟲夏草菌絲粉10 g，提取溶液為去離子水（首次加量料液比為1 g ∶20 mL，浸泡30 min之后，加水量料液比按前加量的75%遞減）。提取條件：溫度90 ℃、提取4次、每次浸提時(shí)間90 min，超聲功率150 W。

1.3.4 冬蟲夏草多糖含量測定

采用苯酚-硫酸比色法[11-12]測定。

1.3.4.1 繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

取烘干至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品配置成最終濃度為0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，取9支試管分別取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL，各補(bǔ)加蒸餾水至1.0 mL，然后加入5%苯酚1.0 mL，迅速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻，靜置10 min。于40 ℃水浴中加熱 30 min，以蒸餾水替代葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液為空白對(duì)照，于D490 nm波長處測吸光度。

1.3.4.2 冬蟲夏草多糖含量的測定

取冬蟲夏草多糖提取濾液，稀釋一定的倍數(shù)，取1 mL稀釋液，加入5%苯酚溶液 1 mL，搖勻、迅速加入5mL濃硫酸，搖勻、靜置10 min。于 40 ℃ 水浴中加熱30 min，以蒸餾水作空白對(duì)照，在D490 nm處測定吸光度。按回歸方程計(jì)算稀釋液多糖含量。按下式計(jì)算多糖含量：多糖含量（mg/g）=待測液中多糖濃度（mg/mL）×溶液體積（mL）×稀釋倍數(shù)/原料質(zhì)量（g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 冬蟲夏草菌株的分離純化

對(duì)分離出的50株生長健壯、無雜菌、菌絲潔白的菌株進(jìn)行多糖的提取，并測定多糖含量，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的回歸方程，計(jì)算蟲草多糖得率。回歸方程為y=10.399x-0019 5，r=0.998 7。根據(jù)計(jì)算得到，CC-3菌株的多糖得率最高，達(dá)6.619%。不同菌株的多糖含量結(jié)果見表1。

3 討論與結(jié)論

冬蟲夏草的生活史分為有性型的子囊孢子階段和無性型的分生孢子階段。而人工培養(yǎng)、 液體發(fā)酵菌絲體的冬蟲夏草均為無性型階段，因此，冬蟲夏草無性型及菌種的鑒定至關(guān)重要。

最早人們判定冬蟲夏草有性型和無性型的關(guān)系，依據(jù)假定無性型與蟲草有性型子實(shí)體有相關(guān)性，用人工誘導(dǎo)蟲草子實(shí)體的形成。人工誘導(dǎo)方法在人工誘發(fā)子實(shí)體長出子囊孢子非常困難，培養(yǎng)出的蟲草子實(shí)體寥寥無幾，人工誘導(dǎo)方法只能為蟲草有性型和無性型的鑒定提供依據(jù)。

劉作易等從云南收集的新鮮冬蟲夏草（Cordyceps sinensis），利用微循環(huán)對(duì)其子囊孢子的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察，并與組織和子囊孢子分離的菌株的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對(duì)，還與中國被毛孢（Hirsutella sinensis）的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較。結(jié)果顯示微循環(huán)的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)與分離菌株和中國被毛孢的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)相似，由此確定冬蟲夏草的無性型為中國被毛孢[13]。該方法雖操作簡單，但必須要先明確此菌株的種屬關(guān)系，該方法在冬蟲夏草無性型的鑒定上也還是一種輔助手段。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，RAPD-PCR技術(shù)為確定蟲草的無性型提供了可靠的分子生物學(xué)證據(jù)，但該方法不能很好地確定菌株的種和亞種。ITS序列分析的發(fā)展，為菌株無性型與有性型關(guān)系及菌株的近緣關(guān)系方面提供了可靠證據(jù)。Kang等報(bào)道，甘肅蟲草和冬蟲夏草具有相同的 ITS序列，并認(rèn)為甘肅蟲草可能是冬蟲夏草的分類異名[14]。張澤文對(duì)古尼擬青霉菌種的完整的 rDNA的ITS 區(qū)進(jìn)行序列測定并進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，分離到菌種為古尼蟲草的無性型，即古尼擬青霉（Paecilomyces gunnii）[15]。

本研究從采摘的新鮮冬蟲夏草子實(shí)體中分離得到CC-3菌株，運(yùn)用插片法對(duì)該菌株的菌絲形態(tài)和孢子結(jié)構(gòu)進(jìn)行顯微觀察，初步判斷菌株的菌屬關(guān)系，通過RAPD-PCR技術(shù)，用通用引物ITS1 和ITS4擴(kuò)增出18S rDNA片段，進(jìn)行序列比對(duì)，最后確定該菌株的種屬關(guān)系。

多糖提取方法很多，如水提醇沉方法提取多糖，在醇沉過程中會(huì)損失大量多糖；酶解法提取多糖，條件溫和、質(zhì)量好，但是經(jīng)濟(jì)價(jià)值高；熱水浸提法提取多糖，方法簡單易行，但效率較低。超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動(dòng)和空化效應(yīng)，使細(xì)胞破碎程度增大，加速了多糖的溶出，有利于多糖的提取。本試驗(yàn)采取超聲波輔助熱水浸提法提取蟲草多糖。

多糖測定方法也很多，通常采用硫酸-蒽酮法、苯酚-硫酸法測定多糖的含量。硫酸-蒽酮法由于糖與蒽酮試劑的顯色深度不同，糖混合時(shí)，常因不同糖類比例造成一定的誤差。而苯酚-硫酸法測定多糖，方法簡單、靈敏度高、不受蛋白質(zhì)存在的影響，產(chǎn)生的顏色穩(wěn)定。endprint

從西藏新鮮的冬蟲夏草中初步分離得到50株菌株，經(jīng)過多糖含量測定，CC-3菌株多糖得率最高，為6.619%，多糖含量高達(dá)6.619 mg/g。對(duì)CC-3菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、分子生物學(xué)18S rDNA序列分析，初步鑒定CC-3菌株為Cladosporium sp.菌株。

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