代安亞，王 方，馮文莉

(重慶醫(yī)科大學 檢驗醫(yī)學院 臨床血液學教研室 臨床檢驗診斷學教育部重點實驗室， 重慶 400016)

?

研究論文

腺病毒介導的AIF及其突變體對K562細胞凋亡的影響

代安亞，王 方，馮文莉*

(重慶醫(yī)科大學 檢驗醫(yī)學院 臨床血液學教研室 臨床檢驗診斷學教育部重點實驗室， 重慶 400016)

目的構建凋亡誘導因子(Ad-AIF)及其突變體的重組腺病毒(Ad-DMLS-AIF和Ad-DHBD-AIF)，觀察其對白血病K562細胞凋亡的影響。方法擴增AIF、DMLS-AIF和DHBD-AIF片段，分別克隆至pAd-Track-CMV-HA質(zhì)粒中，經(jīng)過PCR、雙酶切和測序鑒定后，分別與pAd-Easy1質(zhì)粒重組得到腺病毒質(zhì)粒，經(jīng)包裝和擴增后得到腺病毒，以無外源序列的腺病毒作為空載腺病毒。Western blot驗證重組腺病毒在K562細胞中的表達，免疫共沉淀檢測AIF、DMLS-AIF和DHBD-AIF是否與HSP70相結合，Hoechst33258染色和流式細胞術檢測AIF、DMLS-AIF和DHBD-AIF對K562細胞凋亡的影響。 結果重組腺病毒構建成功，能夠在K562 細胞中表達；AIF和DMLS-AIF與HSP70相結合，DHBD-AIF不結合HSP70； Ad-DHBD-AIF引起K562細胞染色質(zhì)凝集，而Ad-AIF和Ad-DMLS-AIF處理的K562細胞染色質(zhì)分布均勻； Ad-DHBD-AIF引起K562細胞凋亡數(shù)明顯高于Ad-AIF和Ad-DMLS-AIF(P<0.05)。 結論成功構建了腺病毒Ad-AIF、 Ad-DMLS-AIF和Ad-DHBD-AIF，其中Ad-DHBD-AIF對K562細胞的凋亡影響明顯高于Ad-AIF和Ad-DMLS-AIF，為K562細胞凋亡受阻的進一步研究奠定了基礎。

凋亡誘導因子；細胞凋亡；腺病毒載體；K562細胞

慢性粒細胞白血病(chronic myeloid leukemia, CML)是以9號染色體和22號染色體易位形成BCR-ABL融合蛋白為特點的造血功能紊亂的疾病，其通過激活多條信號傳導通路引起細胞凋亡受阻[1]。凋亡誘導因子(apoptotic inducing factor, AIF)是參與細胞非依賴caspase凋亡途徑的重要因子之一，其基因存在于X染色體上[2- 3]。在細胞處于正常狀態(tài)時，AIF在線粒體內(nèi)借助其NADH和FAD結合區(qū)域參與氧化還原過程，起傳遞電子的作用；當細胞受到凋亡刺激時，AIF從線粒體中釋放，進入細胞核中，與DNA結合，引起染色質(zhì)聚集并將DNA切割成約50 kb的大片段，最終導致細胞死亡[2- 5]。在Cos和Rat- 1細胞中上調(diào)靶向線粒體膜的Bcl- 2蛋白，可延緩AIF異位和核凋亡[6]；AIF進入細胞漿后， HSP70等蛋白與其結合，使其失去進入細胞核的能力，最終細胞凋亡受阻[6- 7]，而AIF在凋亡異常的CML細胞中的作用目前仍不明確，其參與的凋亡過程是否與HSP70有關也不清楚，因此構建含野生型凋亡誘導因子(Ad-apoptosis-inducing factor，Ad-AIF)、缺線粒體定位信號結構域的凋亡誘導因子突變體(Ad-apoptosis-inducing factor-defected mitochondria localization sign, Ad-DMLS-AIF)和在DMLS-AIF基礎上缺HSP70結合位點的凋亡誘導因子突變體(Ad-apoptosis-inducing factor-defected HSP70 banding domain, Ad-DHBD-AIF)的重組腺病毒，觀察三者對K562細胞凋亡的影響，為研究慢性粒細胞白血病凋亡異常提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株和細胞系:腺病毒穿梭質(zhì)粒pAd-Track-cmv-HA及骨架質(zhì)粒pAd-Easy1，E.coliDH5α及E.coliBJ5183，AD293細胞及K562細胞均為本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑:RNA提取試劑盒、PrimeScript RT reagent kit、PrimeSTART? HS DNA聚合酶、T4 DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶 (SalⅠ、NotⅠ)(Takara公司)；限制性內(nèi)切酶PmeⅠ和PacⅠ(NEB公司)；質(zhì)粒提取及純化試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]；瓊脂糖膠(Gene公司)；lipofectamineTM2000和Opti-MEM(Invitrogen公司)；鼠抗HA單克隆抗體、兔抗β-actin單克隆抗體和辣根過氧化酶-羊抗鼠或羊抗兔IgG抗體(Santa Cruz公司)；基因轉(zhuǎn)染增強劑Polybrene和Hoechst33258試劑(Sigma公司)；免疫共沉淀試劑盒(Thermo公司)；RIPA細胞裂解液(Cell Signaling公司)；DMEM和RPMI-1640培養(yǎng)液(Gibco公司)；胎牛血清(四季青公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng):含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)AD293細胞，含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)K562細胞，均在37 ℃、5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)。

1.2.2 目的基因的擴增:根據(jù)GenBank中人AIF cDNA序列(AF100928)設計引物, 由華大基因合成。 AIF上游:5′-ACGCGTCGACATGTTCCGGTGTGG AGGCCTGGCGGCGGGTGC-3′，DMLS-AIF上游:5′-A CGCGTCGACGAGGAAGTTCCTCAAGACAAGGCGC-3′，DHBD-AIF上游：5′-ACGCGTCGACACTGGGAAGAA GGTAGTACAGCTGG-3′，以上三者的共同下游: 5′-ATAAGAATGCGGCCGCTCAGTCTTCATGAATGTTGA ATAG-3′(下劃線加粗部位為SalⅠ酶切位點，下劃線部分為NotⅠ酶切位點)。提取K562細胞總mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板，利用PCR擴增獲得AIF片段。PCR反應體系為：5×PCR Primer STAR緩沖液10 μL，dNTP混合物4 μL，模板1 μL，引物各1 μL，DNA聚合酶0.5 μL,補水至50 μL。PCR反應條件為：98 ℃預變性1 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸80 s，共32個循環(huán)，72 ℃再延伸10 min。DMLS-AIF及DHBD-AIF基因的擴增同AIF基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并進行回收純化。

1.2.3 重組腺病毒穿梭質(zhì)粒的構建:將AIF、DMLS-AIF和DHBD-AIF基因分別連接到pAd-Track-CMV-HA質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化至DH5α,増菌擴增后提取質(zhì)粒,經(jīng)SalⅠ和NotⅠ雙酶切、PCR鑒定正確后送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測序。

1.2.4 重組腺病毒質(zhì)粒的構建、包裝和擴增:將重組穿梭質(zhì)粒與 pAd-Easy1質(zhì)粒重組，轉(zhuǎn)化至DH5α中,提取質(zhì)粒,PacⅠ酶切鑒定正確后進行腺病毒包裝。

取對數(shù)生長期的AD293細胞，按照每孔1×105個/L細胞接種于6孔板中。將被PacⅠ酶切線性化的腺病毒質(zhì)粒同轉(zhuǎn)染試劑lipofectamineTM2000(腺病毒質(zhì)粒∶lipofectamineTM2000=1∶3)混合，轉(zhuǎn)染AD293細胞，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在12～13 d時，在熒光顯微鏡下可見大量帶有GFP綠色熒光的細胞，離心收集細胞，在-80 ℃與37 ℃之間，經(jīng)5次冷凍-融化-劇烈振蕩后，離心收集上清液，獲得第一代重組腺病毒，命名為Ad-AIF、Ad-DMLS-AIF和Ad-DHBD-AIF，經(jīng)3輪擴增后，收集上清液，-80 ℃保存。

1.2.5 Western blot檢測目的蛋白在白血病K562細胞中的表達:提取空載腺病毒、Ad-AIF、 Ad-DMLS-AIF和Ad-DHBD-AIF感染24 h后的K562細胞蛋白和未處理K562細胞蛋白，進行8% SDS-PAGE，4 ℃，含5%脫脂奶粉的TBST封閉過夜，加入鼠抗HA單克隆抗體和兔抗β-actin單克隆抗體(1∶1000稀釋)4 ℃孵育8 h，TBST洗3次，5 min/次，辣根過氧化物酶-羊抗鼠IgG抗體或辣根過氧化物酶-羊抗兔IgG抗體(1∶1 000稀釋)室溫孵育1 h，TBST洗3次，5 min/次，電化學發(fā)光儀檢測蛋白的表達。 1.2.6 免疫共沉淀分析HSP70與AIF、DMLS-AIF和DHBD-AIF之間的關系:在Ad-AIF感染K562細胞48 h時，離心收集細胞，PBS洗3次，提取蛋白，考馬斯亮藍測其濃度，1 mg蛋白加入HSP70抗體20 μL，裂解/清洗緩沖液補充至300 μL(將此混合液命名為A液)，4 ℃，混勻6 h后，吸取20 μL Pierce A/G Agarose至收集管中，1 000×g離心1 min，100 μL裂解/清洗緩沖液清洗收集管2次，將A液加入至收集管中，4 ℃，混勻1 h后,1 000×g離心1 min，清洗收集管兩次，100 μL 1×條件緩沖液清洗1次，加入50 μL洗脫液，100 ℃煮5 min，4 ℃，13 000×g離心10 min，-80 ℃保存，Ad-DMLS-AIF、Ad-DHBD-AIF及未處理組同Ad-AIF處理，Western blot分析。

1.2.7 Hoechst33258染色和流式細胞術觀察重組腺病毒對白血病K562細胞凋亡的影響:將空載腺病毒、Ad-AIF、 Ad-DMLS-AIF和Ad-DHBD-AIF分別感染K562細胞，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，分別在48 h時收集細胞，采用Hoechst33258染色檢測K562細胞凋亡；將空載腺病毒、Ad-AIF、 Ad-DMLS-AIF和Ad-DHBD-AIF分別感染K562細胞48 h，同時將K562細胞使用泛caspase抑制劑Z-VAD-FMK預處理后再感染Ad-DHBD-AIF 48 h，分別收集細胞，采用流式細胞術(送于重慶醫(yī)科大學生命科學研究院進行檢測，該單位采用7-ADD和Annexin-PE進行標記)進行K562細胞的凋亡檢測。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 目的基因擴增和鑒定

PCR擴增獲得了1 842 bp的AIF片段、1 482 bp的DMLS-AIF片段和1 158 bp的DHBD-AIF片段 (圖1)。

2.2 重組腺病毒的包裝和擴增

包裝重組腺病毒的第8天進行GFP熒光采集(圖2)，包裝的原代腺病毒在12天左右收獲。

2.3 目的蛋白在白血病K562細胞中的表達驗證

在空載腺病毒、Ad-AIF、Ad-DMLS-AIF和Ad-DHBD-AIF分別感染K562細胞24 h后，可檢測到各自相應蛋白的表達(圖3)。

2.4 免疫共沉淀分析AIF、DMLS-AIF和DHBD-AIF是否與HSP70結合

AIF和DMLS-AIF與HSP70結合，而DHBD-AIF不與HSP70結合(圖4)。

A:amplification products of AIF and DMLS-AIF, M.DL2000(+1 500 bp) DNA marker, 1～3.amplification products of DMLS-AIF, 4～6.amplification products of AIF； B.amplification products of DHBD-AIF; 7～10.amplification products of DHBD-AIF; M.DL2000C+1 500 bp DNA marker

圖1 PCR擴增AIF、 DMLS-AIF和DHBD-AIF產(chǎn)物
Fig 1 Amplification products of AIF,DMLS-AIF and DHBD-AIF by PCR

圖2 熒光顯微鏡檢測在重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)化AD293細胞第8天時GFP熒光蛋白的表達Fig 2 The expression of GFP protein in AD293 cellsat 8th day transformed with recombinant adeno-virus plasmid was detected through fluore-scence microscope(×100)

2.5 重組腺病毒對白血病K562細胞凋亡的影響

Ad-DHBD-AIF處理組的K562細胞呈凋亡形態(tài)改變，細胞核變亮，核內(nèi)染色質(zhì)濃縮呈環(huán)狀或團狀或串珠狀，Ad-AIF和Ad-DMLS-AIF處理組，K562細胞核染色均勻(圖5)；Ad-DHBD-AIF引起K562細胞凋亡數(shù)目明顯高于其他處理組， caspase失活可促進Ad-DHBD-AIF引起的細胞凋亡(圖6)。

圖3 Western blot驗證AIF、DMLS-AIF和DHBD-AIF在白血病K562細胞中的表達Fig 3 Identification of AIF, DMLS-AIF and DHBD-AIFexpressing in leukemia K562 cells throughWestern blot

圖4 CO-IP檢測HSP70與AIF、DMLS-AIF或DHBD-AIF的關系Fig 4 The relationship between HSP70 and AIF， DMLS-AIF or DHBD-AIF was detected by CO-IP

圖5 Hoechst33258染色評價重組腺病毒對白血病K562細胞凋亡的影響Fig 5 Apoptotic effect of recombinant adenovirus on leukemia K562 cells analyzed by Hoechst33258 staining(×400)

3 討論

慢性粒細胞白血病是一種細胞凋亡受阻的惡性血液性腫瘤，對新發(fā)的慢性期患者，伊馬替尼治療效果較好，但是隨著治療的進行，對伊馬替尼耐藥和復發(fā)現(xiàn)象也隨即出現(xiàn)[8- 9]，因此對慢性粒細胞白血病細胞凋亡異常的研究尤為重要。由于腫瘤的發(fā)生原因之一是細胞凋亡受阻，因此再次激活細胞凋亡成了消除腫瘤的主要目標，也是多種血液性腫瘤包括急慢性T淋巴細胞白血病放化療的目標[10]。凋亡誘導因子(apoptosis-inducing factor，AIF)參與非依賴caspase的凋亡途徑，首先在線粒體中被剪切成為成熟的AIF，當線粒體膜通透性增加時，被釋放進入胞質(zhì)，再進入細胞核中發(fā)揮促凋亡作用。有研究者發(fā)現(xiàn)在Jurkat細胞中，聯(lián)合維甲酰酚胺和吲哚美辛可誘導AIF入核，使約90%的細胞發(fā)生凋亡[11]；在Jurkat細胞和急性淋巴細胞白血病病人的細胞中，鋅螯合劑TPEN通過誘導產(chǎn)生過氧化氫而引起線粒體膜通透性增加，AIF釋放入核，引起細胞凋亡[12]。

AIF是細胞內(nèi)源性蛋白，在caspase失活或者未被激活的情況下才發(fā)揮作用[7]，然而有研究發(fā)現(xiàn)當使用泛caspase抑制劑后，AIF釋放過程受到影響，不能入核發(fā)揮作用[13]，即使釋放之后，在一些腫瘤細胞中AIF也被HSP70阻滯在細胞漿中[14]，不能入核發(fā)揮促凋亡作用。然而CML細胞凋亡受阻是否與AIF有關還尚不清楚，因此該研究利用腺病毒具有感染率高, 不受細胞種類及增殖狀態(tài)限制, 無遺傳毒性, 攜帶外源基因量大以及操作方便等優(yōu)點[15]，構建了含野生型凋亡誘導因子、缺線粒體定位信號結構域的凋亡誘導因子突變體和在缺線粒體定位信號的基礎上再缺HSP70結合位點的凋亡誘導因子突變體的重組腺病毒，觀察3者對K562細胞凋亡的影響。結果顯示：成功構建了重組腺病毒Ad-AIF、Ad-DMLS-AIF和Ad-DHBD-AIF，其中Ad-DHBD-AIF可引起K562細胞發(fā)生凋亡，并且caspase失活可增強其促凋亡作用，而與HSP70結合的Ad-AIF和Ad-DMLS-AIF對 K562細胞凋亡的影響與空載腺病毒組類似， 因此K562細胞凋亡異常與AIF結合HSP70有密切關系，這為慢性粒細胞白血病細胞凋亡異常的機制研究奠定了基礎。

*P<0.05 compared with empty vector; #P<0.05 compared with Ad-AIF and Ad-DMLS-AIF圖6 流式細胞術檢測重組腺病毒對K562細胞凋亡的影響Fig 6 Effect of recombinant adenovirus on the apoptosis of K562 cells analyzed by flow cytometry

[1] Chen X, Shi XP, Zhao C,etal. Anti-rheumatic agent auranofin induced apoptosis in chronic myeloid leukemia cells resistant to imatinib through both Bcr/ Abl-dependent and -independent mechanisms [J]. Oncotarget,2014, 5: 9118- 9132.

[2] Sevrioukova IF. Apoptosis-Inducing Factor: Structure, Function, and Redox Regulation[J]. Antioxid Redox Signal,2011,14:2545- 2579.

[3] Modjtahedi N, Giordanetto F, Madeo F,etal. Apoptosis-inducing factor: vital and lethal[J]. Trends Cell Biol,2006,16:264- 272.

[4] Delavalle L, Cabon L, Galan-Malo P,etal.AIF-mediated Caspase-independent Necroptosis: A New Chance for Targeted Therapeutics[J].IUBMB Life,2011,63: 221- 232.

[5] Ding ZJ, Chen X, Tang XX,etal. Calpain inhibitor PD150606 attenuates glutamate induced spiral ganglion neuron apoptosis through apoptosis inducing factor pathwayinvitro[J]. PLoS One,2015,10:e0123130-e0123140.doi: 10.1371/journal.pone.0123130.

[6] Loeffler M, Daugas E,Susin SA,etal. Dominant cell death induction by extramitochondrially targeted apoptosis-inducing factor[J]. FASEB J,2001,15:758- 767.

[7] Han B, Wang TD, Shen SM,etal. Annonaceous acetogenin mimic AA005 induces cancer cell death via apoptosis inducing factor through a caspase- 3-independent mechanism [J]. BMC Cancer,2015,15:139- 150.

[8] Chen X, Shi XP, Wang XJ,etal. Novel use of old drug: Anti-rheumatic agent auranofin overcomes imatinib-resistance of chronic myeloid leukemia cells[J]. Cancer Cell Microenviron,2014, 1:e415- 422.doi: 10.14800/ccm.415.

[9] Reavie L,Buckley SM, Loizou E,etal. Regulation of c-Myc Ubiquitination Controls Chronic Myelogenous Leukemia Initiation and Progression[J].Cancer Cell,2013,23:362- 375.

[10] Mendivil-Perez M, Jimenez-Del-Rio M, Velez-Pardo C. Glucose starvation induces apoptosis in a model of acute T leukemia dependent on caspase- 3 and apoptosis-inducing factor: a therapeutic strategy[J]. Nutr Cancer,2013,65: 99- 109.

[11] Hojka-Osinska A, Ziolo E, Rapak A. Combined treatment with fenretinide and indomethacin induces AIF-mediated, non-classical cell death in human acute T-cell leukemia Jurkat cells[J]. Biochem Biophys Res Commun,2012,419: 590- 595.

[12] Mendivil-Perez M, elez-Pardo C, Jimenez-Del-Rio M. TPEN induces apoptosis nindependently of zinc chelator activity in a model of acute lymphoblastic leukemia and ex vivo acute leukemia cells through oxidative stress and mitochondria caspase- 3-and AIF-dependent pathways[J]. Oxid Med Cell Longev,2012: 313275- 313289.

[13] Arnoult D, Parone P, Martinou JC,etal. Mitochondrial release of apoptosis-inducing factor occurs downstream of cytochrome c release in response to several proapoptotic stimuli[J].J Cell Biol, 2002,159:923- 929.

[14] Zhu Q, Xu YM, Wang LF,etal.Heat shock protein 70 silencing enhances apoptosis inducing factor-mediated cell death in hepatocellular carcinoma HepG2 cells[J].Cancer Biol Ther,2009,8: 792- 798.

[15] 李千音,黃崢蘭,高淼,等.重組腺病毒Ad5 / F35-HF2S 的構建及其鑒定[J].中國生物制品學雜志,2012,25:1434- 1438.

Effect of adenovirus-mediatedAIF and its mutants on the apoptosis of K562 cells

DAI An-ya, WANG Fang, FENG Wen-li*

(Dept. of Clinical Hematology，Key Laboratory of Medical Diagnostics，Ministry of Education，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China)

Objective To construct the recombinant adenovirus Ad-AIF, Ad-DMLS-AIF and Ad-DHBD-AIF and to detect their apoptotic effect on leukemia K562 cells. Methods AIF gene and its mutants(DMLS-AIF gene and DHBD-AIF gene)were amplified and cloned into the shuttle plasmid pAd-Track-CMV-HA, after identification by PCR, double-enzyme digestion and sequencing, recombined homology with pAdEasy1 to obtain recombinant adenovirus plasmid and then were packaged and amplified, adenovirus without exogenous sequence as empty vector. Western blot was used to analyze expression of the recombinant adenovirus in K562 cells; Co-immunoprecipitation assay (CO-IP) was applied to detect the relationship between HSP70 and AIF or DMLS-AIF or DHBD-AIF; Hoechst33258 dye and FCM were applied to detect the apoptotic effect of the recombinant adenovirus on K562 cells. Results The recombinant adenovirus was successfully constructed and expressed in K562 cells; AIF and DMLS-AIF were connected to HSP70 except DHBD-AIF; the chromatin was agglutinated in K562 cells infected with Ad-DHBD-AIF, that were uniformity in K562 cells infected with Ad-AIF or Ad-DMLS-AIF; the apoptotic efficacy of Ad-DHBD-AIF on K562 cells was better than that of Ad-AIF and Ad-DMLS-AIF. Conclusions Ad-AIF, Ad-DMLS-AIF and Ad-DHBD-AIF were constructed successfully, the apoptotic effect of Ad-DHBD-AIF on K562 cells was higher significantly comparing with that of Ad-AIF and Ad-DMLS-AIF, which may support to explore the anti-apoptosis mechanisms in K562 cells.

apoptosis-inducing factor；cell apoptosis；recombinant adenovirus；K562 cells

2015- 05- 18

2015- 07- 03

國家自然科學基金(81070421)

1001-6325(2015)11-1453-07

R733.3

A

*通信作者(corresponding author)：fengwlcqmu@sina.com