郭廣富　曹軍平　朱愛(ài)萍等

摘要：從泰州市姜堰區(qū)某豬場(chǎng)發(fā)生的疑似偽狂犬病病豬中采集病料，接種PK15細(xì)胞，收取細(xì)胞病毒液并提取DNA，經(jīng)PCR檢測(cè)及間接免疫熒光鑒定，結(jié)果表明該分離株為豬偽狂犬病毒，命名為T(mén)AIZ130417。分離的病毒在PK15細(xì)胞上的生長(zhǎng)滴度可以達(dá)到108.12 TCID50/mL。將該病毒接種家兔，家兔很快出現(xiàn)奇癢并最終死亡等偽狂犬癥狀。

關(guān)鍵詞：豬偽狂犬病毒；分離；鑒定

中圖分類號(hào)： S858.285.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）03-0200-03

偽狂犬?。╬seudorabies，PR） 是由偽狂犬病病毒 （pseudorabies virus，PRV）引起多種家畜和野生動(dòng)物以發(fā)熱、奇癢（豬除外）和腦脊髓炎為主要癥狀的急性傳染病[1]。以豬的感染最為普遍，該病毒能引起母豬的繁殖障礙，主要表現(xiàn)為流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等；新生仔豬發(fā)生感染時(shí)，死亡率可高達(dá)100%；此外，育肥豬感染往往致使其生長(zhǎng)緩慢，種公豬感染則導(dǎo)致精液品質(zhì)下降甚至喪失種用價(jià)值[2]。偽狂犬病最早在美國(guó)發(fā)現(xiàn)，我國(guó)于20世紀(jì)40年代末在貓中首次發(fā)現(xiàn)了該病毒，60年代初在豬群中也出現(xiàn)了該病毒流行。目前，該病在我國(guó)廣泛流行，嚴(yán)重威脅著豬群的健康，并造成了養(yǎng)豬業(yè)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。本研究對(duì)泰州市某豬場(chǎng)疑似偽狂犬病患豬采集肝、腎及脾等組織病料，進(jìn)行PRV的分離、鑒定，以期為今后深入研究和科學(xué)地防控該病提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料

疑似偽狂犬病病豬的肝、腎及脾等組織，于2013年4月17日采自泰州市姜堰區(qū)某豬場(chǎng)。將采集的病料研碎，按 1 g ∶5 mL 加入無(wú)菌含雙抗的PBS溶液，混勻，反復(fù)凍融3次，離心取上清，用孔徑0.22 μm濾器過(guò)濾后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑、細(xì)胞、陽(yáng)性血清及家兔

基因組DNA快速抽提試劑盒（動(dòng)物）、Taq DNA聚合酶、dNTP Mix、25 mmol/L MgCl2及10×PCR buffer均為上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品，100 bp DNA Ladder和6×DNA 凝膠載入染料（Loading Dye）購(gòu)自Fermentas公司。PK15細(xì)胞由江蘇省動(dòng)物流行病學(xué)研究中心保存。豬源抗PRV陽(yáng)性血清，購(gòu)自VMRD公司，羊抗豬IgG-FITC，購(gòu)自SANTN CRUZ公司。胰酶細(xì)胞消化液，購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；新生牛血清和DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。健康的家兔4只，購(gòu)自江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院農(nóng)場(chǎng)。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)文獻(xiàn)[5]方法，合成1對(duì)PRV引物，片段針對(duì)PRV gH基因中的一段序列，擴(kuò)增片段長(zhǎng)355 bp。引物序列為：上游引物5′-GCGTGTACTGCGACTGCGTGTT-3′；下游引物 5′-CGACCTGGCGTTTATTAACCGAGA-3′，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 病毒核酸的提取及PCR

用基因組DNA快速抽提試劑盒，按說(shuō)明書(shū)上的操作方法提取組織病料DNA。以提取的組織病料DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR采用50 μL反應(yīng)體系：5 μL 10×buffer、3 μL 25 mmol/L MgCl2、1 μL 10 mmol/L dNTPs、20 μmol/L上下游引物各1 μL，用滅菌超純水補(bǔ)足50 μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下觀察電泳圖譜，拍照記錄結(jié)果。

1.5 病毒的分離

將上述“1.1”節(jié)處理的經(jīng)PCR檢測(cè)呈PRV陽(yáng)性的病料懸液接種于PK15單層細(xì)胞上，37 ℃孵育1 h后棄接種液，加入含2%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱，每日觀察，盲傳至細(xì)胞病變穩(wěn)定、病變率達(dá)80%時(shí)收毒，對(duì)收獲的病毒液PCR檢測(cè)PRV。

1.6 病毒的IFA鑒定

將分離毒接種至長(zhǎng)滿單層的PK15細(xì)胞，37 ℃孵育1 h后，吸取病毒液，PBS洗滌2次，加入維持液于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h；同時(shí)以未接種病毒的PK15細(xì)胞作為陰性對(duì)照。待檢細(xì)胞使用PBS洗滌3次，冰甲醇4 ℃固定 30 min；PBS洗滌3次，加入豬源抗PRV陽(yáng)性血清，37 ℃孵育1 h；PBS洗滌3次，再加入FITC標(biāo)記的羊抗豬抗體，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌3次后，置于Olympus倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.7 病毒滴度測(cè)定

將病毒液稀釋成10-1～10-10，分別接種到96孔培養(yǎng)板中長(zhǎng)成融合單層的PK15細(xì)胞上，每個(gè)稀釋度接種8孔，培養(yǎng)板最后2列孔接種稀釋液作對(duì)照，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，96 h后觀察細(xì)胞病變，按照Reed-Muench法計(jì)算病毒的TCID50。

1.8 家兔接種試驗(yàn)

用PRV分離毒株腹側(cè)皮下接種2只家兔，2 mL/只；另取2只作為陰性對(duì)照組，分別注射細(xì)胞維持液，2 mL/只。試驗(yàn)組和對(duì)照組隔離飼養(yǎng)，每日觀察記錄家兔的臨床表現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病料的PCR檢測(cè)

對(duì)疑似PRV感染豬組織病料提取DNA，然后進(jìn)行PCR檢測(cè)，擴(kuò)增出片段大小為355 bp的目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符（圖1）。

2.4 病毒滴度

統(tǒng)計(jì)不同稀釋度的分離毒在96孔細(xì)胞板上PK15細(xì)胞中出現(xiàn)的致細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE），按Reed-Muench法測(cè)得分離毒滴度可達(dá)108.12 TCID50/mL。

2.5 家兔感染試驗(yàn)

2只試驗(yàn)組家兔在接種細(xì)胞病毒液后約48 h表現(xiàn)奇癢癥狀，不斷啃咬腹側(cè)注射部位，掉毛出血；接種后62 h時(shí)出現(xiàn)角弓反張而死亡。注射細(xì)胞維持液的對(duì)照組家兔觀察7 d后均無(wú)異常表現(xiàn)。死亡兔剖檢可見(jiàn)腦膜充血、肺瘀血，并有大小不等的出血斑點(diǎn)，氣管環(huán)充、出血，肝瘀血腫大、有壞死灶等（圖4）。

3 結(jié)論與討論

PR是危害養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病[6]，我國(guó)是一個(gè)養(yǎng)豬大國(guó)，因而對(duì)該病病原的深入研究具有非常重要的意義。

PCR技術(shù)是從分子水平對(duì)病毒進(jìn)行診斷的一種方法，能檢出痕量病毒。PCR具有快速、敏感、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，不僅可以檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)的PRV，而且可以直接檢測(cè)臨床樣品[7]。本試驗(yàn)先對(duì)臨床PR可疑病豬采集病料進(jìn)行PCR檢測(cè)，檢測(cè)陽(yáng)性后才接種到細(xì)胞，提高了細(xì)胞分離的成功率。

PRV具有泛嗜性，能在許多細(xì)胞中增殖。豬的PK-15、SK6、PS細(xì)胞，倉(cāng)鼠的BHK-21，猴的Vero細(xì)胞、GMK細(xì)胞和兔的EP細(xì)胞等都能用于增殖該細(xì)胞，其中PRV對(duì)豬腎細(xì)胞和兔腎細(xì)胞最為敏感，生產(chǎn)上常使用豬細(xì)胞系PK-15或 SK-16 細(xì)胞進(jìn)行PRV的培養(yǎng)。本試驗(yàn)選用PK-15細(xì)胞分離培養(yǎng)，除了PRV對(duì)其具有較強(qiáng)的敏感性外，該細(xì)胞還具有易培養(yǎng)、增殖速度快等特點(diǎn)[8]。

IFA是我國(guó)目前用于PR快速診斷的一種較好方法，該方法具有特異性高，不與細(xì)小病毒、腺病毒、血凝性腦炎病毒及腸道病毒發(fā)生交叉反應(yīng)，以及敏感性較高等特點(diǎn)[9]。對(duì)本次細(xì)胞病毒的鑒定采用了IFA方法，發(fā)現(xiàn)分離病毒感染PK15后呈現(xiàn)明顯的特異性綠色熒光，而未接種PRV的PK15細(xì)胞沒(méi)有觀察到任何特異性熒光。

動(dòng)物接種試驗(yàn)是PR常用的檢測(cè)方法。將病料或分離的病毒上清液皮下接種到家兔或小鼠，根據(jù)家兔或小鼠的臨床癥狀做出判定。若接種液中含有PRV，家兔會(huì)不停啃咬接種部位，隨即后肢麻痹，臥地不起，最后抽搐死亡；小鼠接種含有PRV的病料，也會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，最后死亡。本試驗(yàn)使用學(xué)校牧場(chǎng)飼養(yǎng)的健康家兔，接種細(xì)胞毒后3 d內(nèi)發(fā)病死亡，觀察到典型的神經(jīng)癥狀，且解剖見(jiàn)到明顯的內(nèi)臟病理變化。

本試驗(yàn)將PCR檢測(cè)后PRV陽(yáng)性的病料接種PK15細(xì)胞，經(jīng)IFA鑒定、病毒滴度測(cè)定及家兔接種試驗(yàn)，結(jié)果成功分離出一泰州株P(guān)RV。該毒株的獲得，為今后深入研究該病毒的分子生物學(xué)特性及開(kāi)發(fā)有效的免疫制劑提供了科學(xué)的參考依據(jù)。

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