徐志偉　劉泉　時(shí)小艷等

摘要：利用湖羊生產(chǎn)羊抗人ApoB，將人ApoB免疫原經(jīng)湖羊皮下與皮內(nèi)及淋巴結(jié)多點(diǎn)接種并進(jìn)行多次加強(qiáng)免疫，建立利用湖羊生產(chǎn)人ApoB多抗血清免疫的新方法，獲得高效價(jià)抗人ApoB抗體，并且采用瓊脂擴(kuò)散方法檢測(cè)抗體效價(jià)。結(jié)果顯示，5次免疫后的羊抗人ApoB多抗血清效價(jià)達(dá)210以上，試驗(yàn)結(jié)果達(dá)到預(yù)期，湖羊采用合適的免疫程序完全可以生產(chǎn)抗血清，經(jīng)濟(jì)效益可觀。

關(guān)鍵詞：湖羊；人ApoB；抗血清；瓊脂擴(kuò)散法

中圖分類號(hào)： S852.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）03-0186-02

傳統(tǒng)的畜禽養(yǎng)殖業(yè)利潤(rùn)較少，且受市場(chǎng)行情及疾病影響較大，抵御市場(chǎng)風(fēng)險(xiǎn)能力差，亟需轉(zhuǎn)變傳統(tǒng)養(yǎng)殖觀念，提高養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益。把生物技術(shù)引入畜禽養(yǎng)殖業(yè)，以畜禽為載體，為人類生產(chǎn)各類生物制品（特定蛋白、特異性抗體、特殊材料等），既可以解決傳統(tǒng)養(yǎng)殖利潤(rùn)低的問題，又可以為人類提供高品質(zhì)蛋白，降低醫(yī)療成本。以羊生產(chǎn)羊抗人的抗體計(jì)算，1只羊利潤(rùn)約1萬(wàn)元，大大高于傳統(tǒng)養(yǎng)羊的利潤(rùn)。載脂蛋白B（ApoB）被認(rèn)為是包含載脂蛋白的脂蛋白的顯著標(biāo)記，ApoB是脂蛋白結(jié)構(gòu)的限制因素[1]。研究表明，人ApoB對(duì)于糖尿病、急性冠狀動(dòng)脈綜合征等心血管疾病的診斷及后期臨床治療具有重要意義[2]。目前通過(guò)免疫羊獲得羊抗人抗體的效價(jià)不高，如何提高抗體效價(jià)是利用羊生產(chǎn)人抗體的主要限制因素之一。本研究利用湖羊制備人ApoB多抗血清，對(duì)原有的常規(guī)免疫程序加以改進(jìn)，建立一套從湖羊免疫、血清采集到抗體效價(jià)檢測(cè)的生產(chǎn)方法，旨在為增加養(yǎng)殖業(yè)附加值、提高養(yǎng)殖戶收入提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選用體質(zhì)量約35 kg的健康青年湖羊25只，免疫前全部打上耳標(biāo)，采用群養(yǎng)放牧飼養(yǎng)方式，白天放牧4 h，上午、下午各 2 h，晚上添加少量精料，有利于羊身體健壯，避免過(guò)肥，自動(dòng)飲水，每天早晚各觀察1次羊的健康狀況。

1.2 抗原

人ApoB抗原自行制備，純度高于98.5%，接種前0.1 mL抗原（含1 mg抗原）+1.9 mL無(wú)菌PBS+2 mL弗氏完全（或不完全）佐劑充分混合，制成4 mL免疫原乳劑備用。

1.3 湖羊免疫方法程序

首免：每只羊接種4 mL免疫原乳劑，注射方式為皮下與皮內(nèi)注射，共計(jì)16個(gè)注射點(diǎn)。分別為頜下、背部皮下各2個(gè)點(diǎn)；后足窩皮下共2個(gè)點(diǎn)；前腹股溝皮內(nèi)各2個(gè)點(diǎn)；后腹股溝皮內(nèi)各3個(gè)點(diǎn)注射。二免：首次后第15天進(jìn)行二免，皮下與淋巴結(jié)注射，共計(jì)18個(gè)注射點(diǎn)。分別為頜下、背部皮下各2個(gè)點(diǎn)；前腹股溝皮下各2個(gè)點(diǎn)；后腹股溝皮下各3個(gè)點(diǎn)；前后腹股溝淋巴結(jié)共計(jì)4個(gè)點(diǎn)。三免：二免后第10天進(jìn)行三免，皮下注射，共計(jì)14個(gè)注射點(diǎn)。分別為頜下、背部皮下各2個(gè)點(diǎn)；前腹股溝皮下各2個(gè)點(diǎn)；后腹股溝皮下各3個(gè)點(diǎn)。四免：三免后第10天進(jìn)行四免，免疫方式同三免。五免：四免后第10天進(jìn)行五免，免疫方式同三免。

1.4 血清制備與血清效價(jià)測(cè)定

分別于三免、四免后7～8 d采靜脈血5～10 mL進(jìn)行血清分離，采用瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)血清抗體效價(jià)，剩余血清 置于-20 ℃ 冰箱凍存，標(biāo)注抗體效價(jià)。第5次免疫注射后第 7～10 天經(jīng)抗體效價(jià)檢測(cè)，若供血羊準(zhǔn)備重復(fù)利用，則每只羊根據(jù)體質(zhì)量采血280～320 mL；若供血羊不準(zhǔn)備重復(fù)利用，則將所有血采完，根據(jù)羊的體質(zhì)量一般可采血900～1 200 mL。將采得的全血放入容器內(nèi)，38 ℃水浴中靜置 1.5～2.0 h，使血清充分析出，取出置于4～5 ℃冰箱中保存過(guò)夜。

1.5 瓊脂板配制

配制0.01 mol/L PBS液，配方為NaCl 4.25 g、磷酸氫二鈉1.35 g、磷酸二氫鈉0.195 g、蒸餾水500 mL混勻，pH 值74。取100 mL PBS液置于燒杯中，加入優(yōu)質(zhì)瓊脂1 g，2%疊氮鈉或1%硫柳汞1.0 mL，沸水中融化均勻，將已融化的瓊脂趁熱倒入平皿中，制成3 mm 厚的瓊脂板，冷卻后備用。

1.6 結(jié)果判定

分別設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照孔、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照孔，在標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照孔與抗原孔之間出現(xiàn)明顯的致密白色沉淀線，標(biāo)準(zhǔn)陰性孔不出現(xiàn)沉淀線的前提下，將被測(cè)孔與對(duì)照孔進(jìn)行比對(duì)，以判定陰陽(yáng)性。利用Excel軟件記錄數(shù)據(jù)，并進(jìn)行相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清的產(chǎn)出

從接種人ApoB抗原的羊體中，通過(guò)頸靜脈采血10～20 mL，裝于離心管中傾斜放置，放于38 ℃水浴箱中孵育 1.5～2.0 h，再放入4 ℃ 冰箱過(guò)夜。第2天在無(wú)菌操作臺(tái)上操作，移液器吸取血清上清液，放于指形管中，在指形管標(biāo)記人ApoB及日期成功獲得人ApoB血清上清液。經(jīng)離心沉淀分出血清，根據(jù)每批血清的抗體效價(jià)進(jìn)行抗體標(biāo)準(zhǔn)濃度調(diào)整與稀釋，分裝后置于-20 ℃冰箱冷凍保存。

2.2 血清效價(jià)及檢測(cè)效果

通過(guò)瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)血清效價(jià)，結(jié)果表明，三免后，血清抗體效價(jià)為1 ∶26，四免時(shí)增長(zhǎng)到1 ∶28，五免抗體效價(jià)為 1 ∶210，達(dá)到后續(xù)用于制備檢測(cè)試劑盒或者其他醫(yī)學(xué)用途的抗體水平（表1）。

2.3 抗體生成規(guī)律

如圖1所示，以效價(jià)對(duì)log2作圖，結(jié)果顯示：四免后所采集抗人ApoB血清效價(jià)比三免提高2 個(gè)數(shù)量級(jí)（或更高），五免比四免提高2個(gè)數(shù)量級(jí)（或更高）。筆者認(rèn)為，五免后7 d內(nèi)抗體效價(jià)可能升幅不高，10～20 d左右抗體效價(jià)處于高平臺(tái)期。

3 結(jié)論與討論

聯(lián)合檢測(cè)載脂蛋白A 與載脂蛋白B（ApoB）對(duì)血脂的判斷具有重要的臨床價(jià)值[3-4]。由于ApoB在脂質(zhì)組裝、轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中起核心作用，ApoB基因的遺傳變異可能幫助解釋脂質(zhì)水平與嚴(yán)重動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病之間的關(guān)系。測(cè)定載脂蛋白及脂蛋白HDL、LDL對(duì)分析病理發(fā)生狀態(tài)很有幫助。由此可見ApoB對(duì)于醫(yī)學(xué)診斷及疾病治療的重要性。目前生產(chǎn)大量抗血清，主要采用大型家畜，包括馬、綿羊、山羊等，這類家畜壽命較長(zhǎng)，容易管理，不必施行麻醉即可從頸靜脈采集大量血液，故主要用于抗血清的商品化生產(chǎn)[6]。本試驗(yàn)的主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)在于免疫程序方面，常規(guī)的免疫程序中注射方式一般都為皮下注射，本試驗(yàn)中首免時(shí)將腹股溝的皮下調(diào)整為皮內(nèi)注射，這樣注射的好處是二免時(shí)淋巴結(jié)會(huì)腫大，方便進(jìn)行淋巴結(jié)注射，淋巴結(jié)注射亦是本試驗(yàn)的創(chuàng)新點(diǎn)，淋巴結(jié)是重要的免疫器官，理論上抗體生成效率更高，本試驗(yàn)五免之后的抗體效價(jià)能達(dá)到210，達(dá)到預(yù)期水平，可用于后期的商業(yè)化生產(chǎn)，具有較高的經(jīng)濟(jì)收益。本試驗(yàn)需要免疫5次，抗體效價(jià)才能符合生產(chǎn)要求，一方面2種抗體效價(jià)檢測(cè)方法不同，不具備可比性；另一方面推測(cè)免疫原本身在羊上不易產(chǎn)生高的效價(jià)，尚需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]Uchide T，Tohya Y，Onda K，et a1.Apolipoprotein B （apoB） concentrations in lipopmteins in cows [J]. Vet Med Sci，1997，59（8）：711-714.

[2]姜偉超，張德太，張 科，等. 糖尿病及急性冠狀動(dòng)脈綜合征患者ApoB與ApoA1比值測(cè)定的臨床意義[J]. 臨床血液學(xué)雜志：輸血與檢驗(yàn)版，2013，26（6）：837-840.

[3]Hirata T，F(xiàn)ujioka M，Takahashi Ka，et al. ApoB C7623T polymorphism predicts risk for steroid-induced osteonecrosis of the femoral head after renal transplantation[J]. Journal of Orthopaedic Science，2007，12（3）：199-206.

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