孫紅梅　曹連賓　郝力壯等

摘要：為研究酵母培養(yǎng)物（YC）對牦牛瘤胃體外培養(yǎng)青藏高原高寒草甸4期牧草發(fā)酵產(chǎn)物及甲烷產(chǎn)量的影響，選取3頭健康的4歲瘺管牦牛為瘤胃液供體，采用體外產(chǎn)氣法，全年4期牧草作為發(fā)酵底物，每期牧草中分別添加0、1%、2%、3%、4% YC，篩選YC在每期牧草中的最佳添加量。結(jié)果顯示，YC可使枯草期產(chǎn)氣量下降（P<0.05），對返青期和枯黃期產(chǎn)氣量影響不顯著（P>0.05），添加2%YC組青草期產(chǎn)氣量顯著下降（P<0.05）；YC對發(fā)酵液的pH值和銨態(tài)氮濃度影響不顯著；在體外培養(yǎng)條件下，在維持牦牛瘤胃正常發(fā)酵環(huán)境且有改善牧草發(fā)酵后能量轉(zhuǎn)化率的情況下，分別在枯草期、返青期、青草期和枯黃期添加3%、2%、1%、2%YC可使其甲烷生成量比對照組顯著降低（P<005）。綜合考慮各試驗(yàn)組，4期中枯黃期甲烷生成量最少，其中添加3%YC組最低。

關(guān)鍵詞：酵母培養(yǎng)物；牦牛；青藏高原；瘤胃；體外產(chǎn)氣；牧草；發(fā)酵參數(shù)；甲烷

中圖分類號： S858.236.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）03-0177-06

酵母培養(yǎng)物（yeast culture，YC）是一種將酵母菌經(jīng)特定厭氧發(fā)酵培養(yǎng)后形成的微生態(tài)制品，主要活性成分是酵母菌的各類代謝產(chǎn)物、發(fā)酵變異的培養(yǎng)基及少量酵母細(xì)胞，包括肽、有機(jī)酸、寡糖、氨基酸和一些芳香烴類物質(zhì)[1]。YC作為反芻動(dòng)物日糧添加劑的趨勢已越來越明顯，它有改善動(dòng)物對飼料的消化率、增加瘤胃微生物蛋白（MCP）[2]、增加泌乳生產(chǎn)性能、提高動(dòng)物免疫力的優(yōu)勢[3]，是繼抗生素類添加劑之后作為綠色健康標(biāo)簽而倍受矚目的新型飼料添加物。基于這些優(yōu)勢，目前很多研究集中在YC對于動(dòng)物瘤胃發(fā)酵、生產(chǎn)性能和飼料消化率的影響方面，而涉及對動(dòng)物甲烷生成量影響的報(bào)道較少，在牦牛研究領(lǐng)域上也是一個(gè)空缺。因此，本試驗(yàn)旨在探討YC對牦牛甲烷生成量的影響和對瘤胃發(fā)酵的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)

青海省高原放牧家畜營養(yǎng)與生態(tài)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地、青海省高原放牧家畜動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和青海省高原牦牛研究中心進(jìn)行牧草營養(yǎng)成分測定和體外產(chǎn)氣培養(yǎng)及相關(guān)指標(biāo)評定。

1.2 試驗(yàn)材料

根據(jù)青藏高原高寒草地實(shí)際情況采集4期牧草樣品，在三江源區(qū)核心區(qū)設(shè)置采樣樣地，采用1.0 m×1.0 m樣方，齊地面刈割，挑出不可食部分，稱質(zhì)量并記錄，風(fēng)干稱質(zhì)量帶回實(shí)驗(yàn)室，粉碎，過40目篩備用[4]。YC為市售商品。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物管理及日糧

選擇3頭健康、體質(zhì)量接近、裝有永久性瘤胃瘺管的4歲牦牛作為瘤胃液供體，單獨(dú)飼喂。試驗(yàn)日糧為燕麥青干草和小麥秸稈組成，全天自由采食，自由飲水，預(yù)飼15 d后開始正試期，晨飼前采集瘤胃液，采集至保溫瓶中迅速帶到實(shí)驗(yàn)室。

1.4 牧草常規(guī)養(yǎng)分分析法

牧草的干物質(zhì)（DM）、有機(jī)物質(zhì)（OM）、粗蛋白質(zhì)（CP）、粗脂肪（EE）、酸性洗滌纖維（ADF）、中性洗滌纖維（NDF）、非結(jié)構(gòu)性碳水化合物（NFC）、灰分（Ash）、鈣（Ca）、磷（P）含量的測定均參照文獻(xiàn)[5]中的推薦方法。

1.5 體外產(chǎn)氣法

分別以全年4期天然混合牧草作為發(fā)酵底物，4期牧草培養(yǎng)為4個(gè)單因素獨(dú)立試驗(yàn)，底物為220 mg，另外設(shè)置空白組（僅瘤胃液和培養(yǎng)液），作為產(chǎn)氣量校正。YC添加水平為0、1%、2%、3%、4%，每個(gè)水平設(shè)3個(gè)重復(fù)。通過瘤胃瘺管在晨飼前抽取牦牛瘤胃液混合后立即放入保溫瓶中備用，防止微生物區(qū)系發(fā)生變化。采用Menke 等的方法[6]準(zhǔn)備緩沖液，并將緩沖液與瘤胃液以2 ∶1的比例混合，將混合好的培養(yǎng)液在發(fā)酵前通入CO2保證厭氧環(huán)境后，分液至對應(yīng)編號的培養(yǎng)管內(nèi)（30 mL），放入水?。?9±0.5） ℃的搖床上開始培養(yǎng)。

1.6 產(chǎn)氣量的記錄

從培養(yǎng)管放入培養(yǎng)箱中開始計(jì)時(shí)，在0、2、4、6、8、12、14、16、24、36、48 h快速讀數(shù)記錄。當(dāng)讀數(shù)超過80 mL時(shí)，為了防止氣體超過刻度而無法讀數(shù)，需要排氣，收集氣體到對應(yīng)編號集氣袋中，記錄排氣后的刻度值。

1.7 發(fā)酵參數(shù)測定

體外培養(yǎng)48 h后，將培養(yǎng)管取出放入冰水混合物中停止發(fā)酵。將發(fā)酵液排到50 mL玻璃管內(nèi)，測定pH值；取部分發(fā)酵液經(jīng)離心（4 000 r/30 min），取上清液進(jìn)行氨態(tài)氮（NH3-N）濃度測定，測定方法參照改進(jìn)的比色法[7]進(jìn)行。

產(chǎn)氣量（mL）=該時(shí)間段內(nèi)培養(yǎng)管產(chǎn)氣量（mL）-對應(yīng)時(shí)間段內(nèi)空白管平均產(chǎn)氣量（mL）；短鏈脂肪酸含量SCFA（mmol/L）=0.022 2×GP-0.004 25（r2=0.94）[8]；有機(jī)物質(zhì)消化率OMD（%）=0.904 2×GP+0.049 2×CP+0038 7×CA+16.49（n=85，r2=0.93）；代謝能ME（MJ/kg，干物質(zhì)）=0136×GP+0.005 7×CP+0.000 286×CP2+220（n=200，r2=0.94）；泌乳凈能NEL（MJ/kg，干物質(zhì)）=0.096×GP+0003 8×CP+0.000 173×CP2+0.54（n=200，r2=0.93）[6]。其中：GP為24 h凈產(chǎn)氣量，mL；CP為粗蛋白含量，%；CA為灰分含量，%。

發(fā)酵氣體甲烷含量的測定委托蘭州中科安泰分析科技有限公司進(jìn)行，分析條件[9]為儀器GC 3420 （北分瑞利氣相色譜儀）；檢測器FID（氫火焰檢測器）；柱長30 m，內(nèi)徑 0.53 mm，膜厚20 μm；柱溫80 ℃；汽化溫度120 ℃；檢測溫度130 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.8 產(chǎn)氣動(dòng)力學(xué)參數(shù)

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，SAS 9.1統(tǒng)計(jì)軟件中單因素試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析采用Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較，在0.05水平進(jìn)行差異顯著分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 4期牧草常規(guī)營養(yǎng)成分

全年4期高寒草地牧草常規(guī)營養(yǎng)含量（干物質(zhì)基礎(chǔ)）見表1。

2.2 添加不同水平Y(jié)C時(shí)4期牧草的累積產(chǎn)氣量

體外產(chǎn)氣試驗(yàn)結(jié)果（表2）顯示，以枯草期牧草為發(fā)酵底物，添加YC降低了48 h累積產(chǎn)氣量，添加1%YC組與對照組差異不顯著（P>0.05），當(dāng)添加量加大時(shí)，48 h累計(jì)產(chǎn)氣量顯著下降（P<0.05），但在發(fā)酵前12 h，枯草期添加3%、4%YC組，返青期添加1%、2%YC組，枯黃期添加4%YC組的產(chǎn)氣量均較其對照多（P<0.05）。在返青期，添加YC可以提高牧草的48 h累積產(chǎn)氣量，1%、2%YC組較對照組顯著提高（P<005），前12 h，YC對產(chǎn)氣量影響較小，之后出現(xiàn)顯著變化趨勢。在青草期，2%YC添加組各時(shí)間點(diǎn)的產(chǎn)氣記錄顯著低于對照（P<0.05）。枯黃期試驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)YC對累積產(chǎn)氣量影響顯著。

由表3可知，當(dāng)在枯草期添加≥2%YC時(shí)，快速降解部分的產(chǎn)氣量A顯著增大（P<0.05），而慢速降解部分的產(chǎn)氣量B減小，其中添加4%YC組顯著減?。≒<0.05），A+B下降，與48 h累積產(chǎn)氣量的下降吻合。YC對返青期A影響較小，因此在發(fā)酵前12 h各組間累積產(chǎn)氣量差異不顯著（P>005），B增加導(dǎo)致各組48 h累積產(chǎn)氣量升高；青草期A除添加2%YC組外均顯著升高（P<0.05），而B在添加1%、2%YC時(shí)顯著下降（P<0.05），添加2%YC組的A+B顯著下降（P<0.05），相應(yīng)48 h累積產(chǎn)氣量也顯著減少（P<0.05）；YC對枯黃期各部分發(fā)酵影響不顯著（P>0.05）。各期YC不同添加水平對產(chǎn)氣速率常數(shù)c影響不顯著（P>0.05）。

2.3 添加不同量YC時(shí)4期牧草的發(fā)酵參數(shù)與甲烷產(chǎn)量

由表4可知，在4期牧草體外培養(yǎng)試驗(yàn)中添加YC對pH值和NH3-N濃度影響在各期內(nèi)均不顯著（P>0.05）；SCFA、OMD、ME、NEL的值在各期試驗(yàn)統(tǒng)一添加水平時(shí)的變化趨勢一致，枯草期除添加2%YC組較對照組顯著下降（P<0.05）外，其余添加量組變化較?。≒>0.05），隨添加水平的增加呈先減小后增大的趨勢；返青期這4個(gè)值受YC添加量的影響，隨添加量加大呈先增大后減小趨勢，添加2%YC組的各值較對照顯著增大（P<0.05）；在青草期添加2%YC時(shí)，這4個(gè)值比對照顯著?。≒<0.05），當(dāng)YC的添加量>2%時(shí)回升，但與對照組差異不顯著（P>0.05）；在枯黃期添加YC后，這4個(gè)值均與對照差異不顯著（P>0.05）。YC的存在可減少各期牧草體外發(fā)酵的甲烷產(chǎn)量，其中在枯草期添加≥2%YC組的甲烷產(chǎn)氣量顯著減小（P<0.05）；返青期YC各添加水平均能顯著降低甲烷產(chǎn)量（P<0.05）；青草期添加1%、2%、3%YC組的甲烷產(chǎn)量顯著減?。≒<0.05），添加4%YC組的甲烷產(chǎn)量也低于對照，但差異不顯著（P>0.05）；枯黃期添加>1% YC能使甲烷產(chǎn)量顯著減?。≒<0.05）。

經(jīng)雙因素方差分析考察甲烷生成量，得到青草期>返青期>枯草期>枯黃期，且兩兩之間差異顯著（P<0.05）。其中，對照組的甲烷產(chǎn)量顯著高于各YC添加組（P<0.05），添加1%、4%YC組僅次之，差異不顯著（P>0.05），與生成甲烷最少的添加2%、3%YC組也均差異顯著（P<0.05），不同期與不同YC添加水平間存在互作（P<0.05），即不同期要求不同的YC添加量達(dá)到最佳的減少甲烷產(chǎn)量效果。經(jīng)考核發(fā)現(xiàn)，枯黃期添加3%YC時(shí)的甲烷生產(chǎn)量最少。

3 結(jié)論與討論

關(guān)于YC在反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)的作用機(jī)理存在控氧理論、小肽營養(yǎng)代謝扳機(jī)理論和營養(yǎng)理論等3種理論?？匮趵碚撜J(rèn)為，培養(yǎng)物質(zhì)仍存在一些酵母菌，它作為好氧菌將瘤胃中的氧氣消耗掉后有利于瘤胃保持厭氧環(huán)境，對瘤胃微生物厭氧菌群（如纖維菌）生長發(fā)酵形成有利條件；小肽營養(yǎng)代謝扳機(jī)理論認(rèn)為，培養(yǎng)物中所含的活性類似于小肽結(jié)構(gòu)物質(zhì)會(huì)促進(jìn)瘤胃微生物活性而改變瘤胃發(fā)酵；營養(yǎng)理論認(rèn)為，培養(yǎng)物中代謝產(chǎn)物包括有機(jī)酸、維生素、礦物質(zhì)等，有利于微生物繁殖代謝而增強(qiáng)其發(fā)酵活性[12]。

3.1 YC對4期牧草體外發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響

瘤胃發(fā)酵產(chǎn)氣主要來自飼料中OM的降解[6]，這些氣體包括一些揮發(fā)性酸類、CO2、H2及甲烷等[13]，產(chǎn)氣量反映飼料的可發(fā)酵程度，可用以衡量飼料營養(yǎng)價(jià)值[14]?？莶萜谇? h產(chǎn)氣量升高，促進(jìn)牧草OM中易降解部分發(fā)酵，A增大。有研究證實(shí)，YC能增加纖維菌的數(shù)量和活性[3，15]，酵母菌是好氧菌，其代謝過程會(huì)減少瘤胃內(nèi)的氧氣，加強(qiáng)形成瘤胃厭氧環(huán)境，促進(jìn)纖維分解菌等厭氧菌的代謝。飼料碳水化合物被纖維分解菌快速降解產(chǎn)生大量氣體，而隨微生物迅速增殖加大了對瘤胃內(nèi)揮發(fā)性營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，因此累積產(chǎn)氣逐漸減少，同時(shí)A的增大彌補(bǔ)了B減少的量，因此僅添加4%YC組的產(chǎn)氣量顯著下降；在返青期，低濃度YC對牦牛瘤胃微生物的刺激作用較強(qiáng)，與OMD的增大一致，累積產(chǎn)氣量增多；在青草期期添加2%YC時(shí)，底物發(fā)酵被抑制，因?yàn)镺MD顯著下降（P<0.05），發(fā)酵自始至終產(chǎn)氣顯著低于對照（P<0.05），說明添加2%YC對以青草期為底物的瘤胃微生物有抑制作用，其原因可能是青草期牧草營養(yǎng)相對均衡，P含量和Ca含量比例合理，而YC中也含礦物質(zhì)和一些酶類，添加2%YC破壞了這種平衡，對微生物活性和對飼料降解不利；而添加YC對枯黃期牦牛瘤胃體外發(fā)酵產(chǎn)氣和OMD無影響，各添加水平下的變化與對照組差異均不顯著（P>0.05），A+B的變化趨勢與 48 h 累積產(chǎn)氣量趨勢一致。4期試驗(yàn)添加YC對累積產(chǎn)氣量的影響變化不一致，主要受各期牧草營養(yǎng)成分影響，主要受飼料中ADF和NDF含量差異影響[16]。

3.2 YC對4期牧草體外培養(yǎng)48 h后各發(fā)酵參數(shù)的影響

通常情況下，反芻動(dòng)物采食后瘤胃正常的pH值在5.5～7.5之間變動(dòng)[17]，瘤胃酸堿環(huán)境與動(dòng)物消化機(jī)能密切聯(lián)系，大至瘤胃原蟲，小至諸多作用酶等都對瘤胃內(nèi)pH值很敏感，維持瘤胃正常的酸堿環(huán)境對機(jī)體正常代謝尤為重要[18]。氨態(tài)氮是飼料中蛋白氮和非蛋白氮等含氮物質(zhì)被微生物分解代謝形成的終產(chǎn)物，大部分會(huì)被瘤胃微生物利用合成MCP[19]，成為反芻動(dòng)物的蛋白質(zhì)來源[20]，其濃度是飼料被分解程度和瘤胃微生物合成利用情況的平衡動(dòng)態(tài)值，最適為0.065 8～0367 0 mg/mL[21]，即0.06～0.30 mg/mL[22]。分別進(jìn)行的4期試驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，YC不同添加水平對pH值和NH3-N濃度影響均不顯著（P>0.05），與姜艷美等的結(jié)論[23]一致，說明YC不會(huì)改變動(dòng)物瘤胃的正常運(yùn)作機(jī)能，可使牦牛瘤胃內(nèi)適宜酸堿環(huán)境和氮的循環(huán)保持良好平衡。雖然按照理論推測，因YC可促進(jìn)纖維的快速降解，會(huì)加速有機(jī)酸累積，而使瘤胃pH值下降，但諸多試驗(yàn)并未發(fā)現(xiàn)pH值下降，而是維持在恒定范圍內(nèi)，這是因?yàn)閅C中含有的二羧酸可通過促進(jìn)瘤胃內(nèi)乳酸利用菌的活性增強(qiáng)對乳酸的循環(huán)利用[24-25]，不致瘤胃形成過酸環(huán)境，可達(dá)到穩(wěn)定pH值的效果，調(diào)節(jié)瘤胃內(nèi)對酸環(huán)境敏感的菌群，增加瘤胃微生物菌群多樣性[26]，因此可添加YC防止動(dòng)物因日糧中添加精料而導(dǎo)致酸中毒的現(xiàn)象。據(jù)報(bào)道[27]，YC能使飼料中的CP降解率提高，同時(shí)促進(jìn)MCP合成，瘤胃細(xì)菌數(shù)增加是添加YC最顯著的變化，這是YC可提高動(dòng)物生產(chǎn)力的源動(dòng)力[28]。瘤胃微生物加快增殖，生成更豐富的MCP為機(jī)體提供蛋白質(zhì)，因此YC可改善瘤胃內(nèi)氮循環(huán)。本試驗(yàn)中的NH3-N濃度均未受影響，但蔣小軍等的試驗(yàn)結(jié)果顯示，YC添加后NH3-N濃度降低，因MCP合成迅速增加[29]，與微生物數(shù)量增加的報(bào)道一致，同樣是YC的積極效應(yīng)；而Yoon等發(fā)現(xiàn)，YC能刺激蛋白分解菌增長[30]，一方面導(dǎo)致NH3-N生成增多，另一方面MCP合成加快，因此本試驗(yàn)NH3-N濃度無變化。

SCFA也被認(rèn)為是揮發(fā)性脂肪酸（VFA），可被瘤胃上皮細(xì)胞和瘤胃微生物直接吸收，是主要來自飼料中碳水化合物的降解產(chǎn)物。試驗(yàn)證明，YC能促進(jìn)纖維素及木質(zhì)素的降解，改善瘤胃發(fā)酵，在總VFA中乙酸和丙酸占絕大多數(shù)，YC活性因子對瘤胃微生物群系有選擇性刺激作用，據(jù)報(bào)道，YC能提高產(chǎn)乙酸菌活性，增強(qiáng)產(chǎn)乙酸菌利用氫，可使乙酸產(chǎn)量增加5倍[31]，因?yàn)闅涓啾挥糜诤铣梢宜?，可被產(chǎn)甲烷菌利用的氫減少，這是本試驗(yàn)得到添加YC后甲烷生成量減少的原因之一。在枯草期和青草期，隨YC添加量加大，SCFA含量先下降后上升，添加2%YC時(shí)顯著下降（P<0.05），而返青期的變化為先上升后下降，添加2%YC時(shí)顯著上升（P<0.05），這些變化與產(chǎn)氣量和OMD變化緊密相關(guān)，都源自YC對瘤胃微生物的刺激作用，進(jìn)而造成飼料被分解程度的差異。在枯黃期添加YC后，SCFA與對照差異不顯著。這與Williams等的結(jié)論[32]一致。不同水平Y(jié)C對4期牧草產(chǎn)生的SCFA量影響變化不一致，主要受牧草營養(yǎng)類型差異的影響，有研究指出，VFA量會(huì)隨YC添加時(shí)間及日糧類型變化而變化[33]。有研究顯示，活性釀酒酵母能提高真菌對纖維的分解能力，顯著提高甲酸、乳酸、乙酸等的濃度[34]，因此SCFA濃度增大；但有報(bào)道，酵母培養(yǎng)物對總VFA無影響[32]。

3.3 YC對4期牧草體外培養(yǎng)生成甲烷量的影響

聯(lián)合國專委會(huì)表示，每年僅反芻動(dòng)物向大氣中排放的甲烷量達(dá)85 Tg，占全球溫室效應(yīng)危害的2%左右[35]，與此同時(shí)，反芻動(dòng)物瘤胃甲烷的產(chǎn)生也浪費(fèi)掉2%～12% 的飼料總能[36]，面臨高寒牧區(qū)天然草場日漸退化的壓力，在可持續(xù)發(fā)展和減排溫室氣體的脅迫下，有效抑制甲烷的研究就變得尤為重要。據(jù)報(bào)道，產(chǎn)乙酸菌生成乙酸的過程需要H2的參與，YC能刺激瘤胃中產(chǎn)乙酸菌利用H2，甚至添加活酵母菌能使乙酸產(chǎn)量及產(chǎn)乙酸菌利用H2效率提高5倍，這樣增強(qiáng)與產(chǎn)甲烷菌競爭氫的作用，會(huì)有效減少甲烷的生成。改變瘤胃發(fā)酵方式，乙酸含量/丙酸含量的值減小[25]，丙酸大量形成消耗氫，可減弱甲烷的生成。但這種效果與日糧類型關(guān)聯(lián)，因此出現(xiàn)不一致的結(jié)論[37]。甲烷的減少還與原蟲數(shù)量減少相關(guān)，YC可減少瘤胃中45%的原蟲[38]。枯草期添加≥2% YC可顯著降低甲烷生成量，但添加2%YC組的SCFA、OMD、ME、NEL顯著減?。≒<0.05）；返青期添加YC各組的甲烷生成量均下降（P<005），其中添加2%YC組對底物發(fā)酵程度的促進(jìn)作用更大，能量轉(zhuǎn)化率顯著增大（P<0.05）；青草期添加4%以下YC組的甲烷生成量顯著下降（P<0.05），對添加1%YC組的飼料能量轉(zhuǎn)換無影響，而添加2%YC組的能量轉(zhuǎn)化效率下降，雖然4%YC使SCFA含量升高，OMD、ME、NEL均提高（P<005），但甲烷未見減少；在不影響能量轉(zhuǎn)化時(shí)，添加2%YC可顯著減少枯黃期的甲烷生成量（P<0.05）。

枯草期產(chǎn)氣量因YC的添加而下降（P<0.05），對返青期和枯黃期產(chǎn)氣量影響不顯著（P>0.05），添加2%YC組的產(chǎn)氣量在青草期顯著下降（P<0.05）。在維持牦牛瘤胃正常發(fā)酵環(huán)境和有效改善飼料能量轉(zhuǎn)化率的情況下，分別在枯草期、返青期、青草期、枯黃期添加3%、2%、1%、2%YC可使甲烷生成量顯著降低（P<0.05）。其中，枯黃期的甲烷生成量最少，且該生育期添加3%YC組為各試驗(yàn)組的最低值。

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