劉威　宣亞楠　袁曉婷等

摘要：研究不同濃度白花三葉草（Trifolium repense L.）水浸液對(duì)草地早熟禾、高羊茅、多年生黑麥草3種禾本科草坪草種子萌發(fā)、幼苗生長以及超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）等保護(hù)酶活性和丙二醛含量的影響。結(jié)果表明，白花三葉草水浸液對(duì)3種草坪草種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、幼苗苗高均表現(xiàn)出低濃度促進(jìn)、高濃度抑制的作用趨勢(shì)；對(duì)幼苗根長均有不同程度的抑制作用，水浸液濃度越高，抑制作用基本上也越強(qiáng)；對(duì)種子發(fā)芽指數(shù)、幼苗鮮質(zhì)量的影響則因草坪草種類的不同而不同。在不同濃度的白花三葉草水浸液處理下，3種草坪草幼苗SOD、CAT活性呈現(xiàn)“低濃度上升、高濃度下降”的趨勢(shì)，POD、APX活性和丙二醛含量則不同程度地升高。

關(guān)鍵詞：白花三葉草；草坪草；化感作用；種子萌發(fā)；幼苗生長

中圖分類號(hào)： Q945.79 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）03-0171-04

白花三葉草（Trifolium repense L.）為豆科車軸草屬多年生草本植物，喜陽耐陰，具有適應(yīng)性廣、抗熱抗寒性強(qiáng)、生長迅速、綠期長等優(yōu)點(diǎn)，在世界各地作為優(yōu)良草坪草廣泛栽植。近年來，我國北方寒冷地區(qū)為了改善城市中草坪的適應(yīng)性并延長其綠期，人們常將白花三葉草與冷季型禾本科草坪草混合建植草坪[1-2]。研究表明，白花三葉草會(huì)侵占禾本科草坪，在禾本科草坪上形成小群落，影響原有的景觀效果[1]。白花三葉草入侵禾本科草坪過程中，化感作用（allelopathy）被認(rèn)為是一個(gè)重要因素[3-6]。植物的化感作用是植物通過莖葉揮發(fā)、雨水淋溶、根系分泌、殘?bào)w分解等途徑向環(huán)境中釋放化感物質(zhì)（allelochemicals），從而對(duì)其他植物或自身的生長發(fā)育產(chǎn)生促進(jìn)或抑制作用[6-7]?；凶饔脧V泛存在于自然界中，是生態(tài)系統(tǒng)中自然的化學(xué)調(diào)控現(xiàn)象以及植物適應(yīng)環(huán)境的一種機(jī)制。開展化感作用研究對(duì)于生態(tài)系統(tǒng)中植被形成及演替、植物生長發(fā)育調(diào)控具有重要意義[8]。研究表明，植物通過化感作用造成細(xì)胞傷害進(jìn)而影響自身或其他植物生長發(fā)育過程中，植物細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基代謝失衡進(jìn)而引起自由基積累以及膜脂過氧化，導(dǎo)致膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、功能受到損傷是重要原因之一[9-11]。超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）等酶類是植物細(xì)胞在長期進(jìn)化過程中形成的防御活性氧自由基毒害的保護(hù)酶系統(tǒng)，以維持植物體內(nèi)活性氧自由基代謝的動(dòng)態(tài)平衡[11-12]。目前，關(guān)于白花三葉草對(duì)冷季型草坪草化感作用研究主要集中在植株水浸液、揮發(fā)物、根系分泌物、腐解液等對(duì)受體植物種子萌發(fā)、幼苗生長的影響。研究表明，雨水淋溶是植物活體、殘?bào)w釋放化感物質(zhì)的主要途徑之一[13]。本研究以我國北方寒冷地區(qū)草坪建植中經(jīng)常使用的3種冷季型禾本科草坪草即草地早熟禾、高羊茅、多年生黑麥草為材料，用蒸餾水浸提白花三葉草植株模擬自然雨水淋溶過程，研究不同濃度白花三葉草水浸液對(duì)3種草坪草種子萌發(fā)、幼苗生長、SOD等保護(hù)酶活性以及丙二醛（MDA）含量的影響，旨在為進(jìn)一步研究白花三葉草侵占禾本科草坪的原因提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮的生長良好的白花三葉草全株采自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)。受體植物草地早熟禾（Poa pratensis L.）、高羊茅（Festuca arundinaces Schreb.）、多年生黑麥草（Lolium perenne L.）種子均購自江蘇圣園種子培育基地。

1.2 方法

1.2.1 白花三葉草水浸液的制備

將白花三葉草全株去除雜質(zhì)，用蒸餾水洗凈后用吸水紙吸干水分。取白花三葉草全株25 g，用剪刀剪成長1～2 cm的小段，倒入三角瓶中，加入 250 mL 蒸餾水浸泡48 h（每隔12 h用玻璃棒攪動(dòng)1次），用布氏漏斗過濾，得到0.100 g/mL白花三葉草水浸液。用蒸餾水稀釋該水浸液，分別獲得0.005、0.025 g/mL水浸液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 草坪草種子萌發(fā)試驗(yàn)

采用培養(yǎng)皿濾紙法進(jìn)行種子萌發(fā)試驗(yàn)。首先用0.1%HgCl2溶液對(duì)3種草坪草種子消毒10 min，用自來水沖洗，最后用蒸餾水沖洗2～3次。分別選擇大小均一、籽粒飽滿的3種草坪草受體種子各100粒，用消毒過的鑷子將其均勻放置于鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿中，分別加入不同濃度（0.005、0.025、0.100 g/mL）的白花三葉草水浸液10 mL，以蒸餾水為對(duì)照（CK），每處理重復(fù)3次。試驗(yàn)期內(nèi)適量補(bǔ)充蒸餾水以保持培養(yǎng)皿內(nèi)濾紙濕潤。將加有受體種子的培養(yǎng)皿放入人工氣候箱中，于25 ℃進(jìn)行培養(yǎng)，每隔 24 h 觀察并記錄萌發(fā)種子數(shù)（胚根或胚軸突破種皮1～2 mm為萌發(fā)）。3 d后計(jì)算發(fā)芽勢(shì)（GE），7 d后計(jì)算發(fā)芽率（GR）、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)（GI）[6]。7 d后從每個(gè)培養(yǎng)皿隨機(jī)挑選10株草坪草幼苗，用吸水紙吸干水分，用電子天平稱量鮮質(zhì)量，用直尺測(cè)量苗高、根長。各指標(biāo)計(jì)算公式如下：

式中：IR為抑制率，%；C為對(duì)照值，T為處理值；當(dāng)IR>0時(shí)，表示抑制作用；當(dāng)IR<0時(shí)，表示促進(jìn)作用。IR絕對(duì)值大小代表化感作用強(qiáng)弱[6]。

1.2.3 保護(hù)酶活性、丙二醛含量的測(cè)定

7 d后從每個(gè)培養(yǎng)皿隨機(jī)挑選若干株草坪草幼苗，用蒸餾水洗凈，用濾紙吸干水分，液氮冷凍后置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存待用。采用氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）法[14]測(cè)定SOD活性，以抑制NBT光化還原的50%為1個(gè)酶活性單位。采用過氧化氫還原法[14]測(cè)定CAT活性，以1 min 240 nm處吸光度減少0.01定義為1個(gè)活性單位。采用愈創(chuàng)木酚法[14]測(cè)定POD活性，將1min 470 nm處吸光度增加0.01定義為1個(gè)活力單位。參照陳建勛等的方法[15]測(cè)定APX活性，以1 min 290 nm處吸光度降低0.01定義為1個(gè)酶活性單位。采用硫代巴比妥酸法[14]測(cè)定丙二醛含量，每個(gè)指標(biāo)均重復(fù)測(cè)定3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007、SPSS 12.0軟件處理數(shù)據(jù)，用Duncans方法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 白花三葉草水浸液對(duì)草坪草種子萌發(fā)的影響

從表1可以看出，不同濃度白花三葉草水浸液對(duì)3種草坪草種子的發(fā)芽率均表現(xiàn)為“低促高抑”的雙重作用。與對(duì)照相比，0.005 g/mL白花三葉草水浸液處理下，草地早熟禾、高羊茅、多年生黑麥草種子的發(fā)芽率均提高，但差異均不顯著；隨著白花三葉草水浸液濃度的增加，對(duì)3種草坪草種子的發(fā)芽率抑制率提高，0.100 g/mL白花三葉草水浸液處理的抑制作用最強(qiáng)。

不同濃度白花三葉草水浸液對(duì)3種草坪草種子的發(fā)芽勢(shì)亦表現(xiàn)為“低促高抑”的雙重作用。0.005 g/mL白花三葉草水浸液處理的促進(jìn)作用最強(qiáng)，0.005 g/mL白花三葉草水浸液處理下，高羊茅、多年生黑麥草發(fā)芽勢(shì)與對(duì)照相比差異顯著（P<0.05）。當(dāng)白花三葉草水浸液濃度≥0.025 g/mL時(shí)，對(duì)3種草坪草的發(fā)芽勢(shì)整體呈抑制作用，且水浸液濃度越高，抑制作用越強(qiáng)。不同濃度白花三葉草水浸液對(duì)3種草坪草種子的發(fā)芽指數(shù)影響不同，但在高濃度下均呈抑制作用，明顯延緩了草坪草種子的發(fā)芽進(jìn)程。不同濃度白花三葉草水浸液對(duì)草地早熟禾、高羊茅的發(fā)芽指數(shù)均表現(xiàn)為“低促高抑”的雙重作用，0005 g/mL白花三葉草水浸液處理提高了2種草坪草的發(fā)芽指數(shù)，但只有高羊茅處理與對(duì)照相比差異顯著（P<005）。與對(duì)照相比，0.100 g/mL白花三葉草水浸液處理顯著降低了草地早熟禾、高羊茅的發(fā)芽指數(shù)。不同濃度白花三葉草水浸液均對(duì)多年生黑麥草的發(fā)芽指數(shù)產(chǎn)生抑制作用，隨著水浸液濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)。

2.2 白花三葉草水浸液對(duì)草坪草幼苗生長的影響

從表2可以看出，不同濃度白花三葉草水浸液對(duì)草坪草幼苗苗高整體表現(xiàn)為“低促高抑”的雙重作用（除多年生黑麥草）。0.005 g/mL 白花三葉草水浸液處理對(duì)3種草坪草幼苗苗高的促進(jìn)作用不明顯，與對(duì)照相比均無顯著差異。隨著白花三葉草水浸液濃度的增加， 對(duì)3種草坪草苗高的抑制作用愈加明顯。

不同濃度白花三葉草水浸液對(duì)3種草坪草幼苗根長均有不同程度的抑制作用，基本表現(xiàn)為白花三葉草水浸液濃度越高，抑制作用越強(qiáng)。0.100 g/mL白花三葉草水浸液處理對(duì)草地早熟禾、高羊茅根長的抑制作用最強(qiáng)，與對(duì)照相比差異顯著（P<0.05）。0.025 g/mL白花三葉草水浸液處理對(duì)多年生黑麥草根長的抑制作用最強(qiáng)。不同濃度白花三葉草水浸液對(duì)3種草坪草幼苗鮮質(zhì)量的影響因草坪草種類的不同而不同。白花三葉草水浸液對(duì)草地早熟禾的鮮質(zhì)量表現(xiàn)為強(qiáng)烈的促進(jìn)作用。不同濃度白花三葉草水浸液對(duì)高羊茅、多年生黑麥草鮮質(zhì)量整體表現(xiàn)為“低促高抑”的作用趨勢(shì)。

2.3 不同濃度白花三葉草水浸液對(duì)草坪草幼苗保護(hù)酶活性、丙二醛含量的影響

由表3可知，不同濃度白花三葉草水浸液對(duì)3種草坪草幼苗SOD、CAT、POD、APX等保護(hù)酶的活性及丙二醛含量均產(chǎn)生明顯的影響，但影響趨勢(shì)不同。

不同濃度白花三葉草水浸液對(duì)3種草坪草幼苗SOD、CAT活性均表現(xiàn)出低濃度促進(jìn)、高濃度抑制的作用趨勢(shì)。當(dāng)白花三葉草水浸液濃度為0.005 g/mL時(shí)，3種草坪草幼苗SOD、CAT活性均高于對(duì)照，但差異不顯著。當(dāng)白花三葉草水浸液濃度≥0.025 g/mL時(shí)，3種草坪草幼苗SOD、CAT活性均受到明顯抑制，且抑制作用隨著水浸液濃度的增加而增強(qiáng)。不同濃度白花三葉草水浸液均不同程度提高了3種草坪草幼苗POD、APX活性以及丙二醛含量。各處理下3種草坪草幼苗APX活性與對(duì)照相比均顯著提高（P<0.05）。低濃度白花三葉草水浸液（0.025 g/mL）處理提高3種草坪草幼苗丙二醛含量的作用不明顯。當(dāng)白花三葉草水浸液濃度 ≥0.025 g/mL 時(shí)，除多年生黑麥草0.025 g/mL處理外，其他處理下3種草坪草幼苗丙二醛含量與對(duì)照相比均顯著提高（P<0.05）。

3 結(jié)論與討論

白花三葉草原產(chǎn)于歐洲、北非，作為優(yōu)質(zhì)牧草在全世界范圍內(nèi)廣泛栽植。近年來，在我國北方寒冷地區(qū)，白花三葉草常與冷季型禾本科草坪草混合栽培應(yīng)用。白花三葉草植株低矮，根系發(fā)達(dá)，主莖短，莖節(jié)上長出匍匐莖，莖節(jié)向下產(chǎn)生不定根，根部具有較強(qiáng)的分蘗能力、再生能力，成坪迅速，具有很強(qiáng)的侵占性。研究表明，同其他草坪草競(jìng)爭(zhēng)光照、水肥等是白花三葉草侵占禾本科草坪的原因之一[16]。白花三葉草能夠通過釋放化感物質(zhì)來抑制禾本科草生長，從而形成單一群落或者侵入禾本科草草坪[2-6]。本研究以白花三葉草為材料，用蒸餾水浸提白花三葉草植株模擬自然雨水淋溶過程，采用生物測(cè)定法研究不同濃度白花三葉草水浸液對(duì)草地早熟禾、高羊茅、多年生黑麥草3種常見冷季型草坪草種子萌發(fā)、幼苗生長的影響，并對(duì)不同處理下3種草坪草幼苗SOD、CAT、POD、APX等保護(hù)酶活性以及丙二醛含量進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，白花三葉草水浸液對(duì)3種草坪草的種子萌發(fā)、幼苗生長均產(chǎn)生不同程度的影響，SOD等保護(hù)酶的活性以及丙二醛含量均發(fā)生不同程度的變化，由此可知白花三葉草對(duì)草坪草具有化感作用，可以通過雨水淋溶釋放化感物質(zhì)影響草坪草的生長。不同濃度的白花三葉草水浸液對(duì)3種草坪草的種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、幼苗苗高均表現(xiàn)出低濃度促進(jìn)、高濃度抑制的雙重作用。不同濃度白花三葉草水浸液對(duì)3種草坪草種子發(fā)芽指數(shù)影響不同，但在高濃度下（≥0.025 g/mL）均表現(xiàn)為抑制作用，明顯延緩了草坪草種子的發(fā)芽進(jìn)程。不同濃度白花三葉草水浸液對(duì)3種草坪草幼苗根長均有不同程度的抑制作用，水浸液濃度越高，抑制作用越強(qiáng)。不同濃度白花三葉草水浸液對(duì)3種草坪草幼苗鮮質(zhì)量的影響因草坪草種類不同而不同，這可能與種子體內(nèi)物質(zhì)的種類、濃度及轉(zhuǎn)化途徑不同有關(guān)[6]。研究表明，化感物質(zhì)對(duì)受體植物生長發(fā)育的化感作用機(jī)制是通過影響其細(xì)胞生長分化實(shí)現(xiàn)的[17-18]。Cruz等認(rèn)為，化感物質(zhì)破壞細(xì)胞膜的功能也是對(duì)受體植物產(chǎn)生化感抑制作用的機(jī)制之一[19]。SOD等植物保護(hù)酶系統(tǒng)具有清除活性氧自由基、減輕膜脂過氧化程度等作用。本研究表明，與對(duì)照相比，低濃度白花三葉草水浸液處理（0.005 g/mL）增加了3種草坪草幼苗SOD、CAT、POD、APX活性，說明3種草坪草幼苗自身能夠通過某些調(diào)節(jié)機(jī)制，提高SOD、CAT、POD、APX活性以減輕膜脂過氧化程度。隨著白花三葉草水浸液濃度的增加，植物受傷害程度加大，SOD、CAT活性逐漸下降，POD、APX活性仍然維持在較高水平。這與劉迎等研究白花三葉草對(duì)苘麻、稗草的化感作用[10]以及張來等研究白花三葉草提取液對(duì)白菜等3種植物種子萌發(fā)、幼苗生長的影響結(jié)果一致[13]。MDA 作為膜脂過氧化的最終產(chǎn)物，其累積量會(huì)隨著細(xì)胞傷害程度的加劇而不斷增大[20]。在不同濃度的白花三葉草水浸液處理下，3種草坪草幼苗中丙二醛含量均高于對(duì)照，說明發(fā)生了膜脂過氧化反應(yīng)，致使細(xì)胞膜系統(tǒng)遭到了破壞。研究證實(shí)，植物體內(nèi)化感物質(zhì)的種類、濃度、相互作用顯著影響其對(duì)受體植物的化感作用，酚類物質(zhì)是重要的水溶性化感物質(zhì)之一[21-22]。白花三葉草水浸液中含有多種酚類物質(zhì)，酚類物質(zhì)在不同濃度的白花三葉草水浸液中含量不同，會(huì)產(chǎn)生不同的協(xié)同或拮抗作用[18]。此外，草地早熟禾等3種草坪草具有不同的生物特性，因此在感受不同濃度的白花三葉草水浸液的化感作用時(shí)，并未表現(xiàn)出整齊一致的作用規(guī)律[6]。

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