趙琳琳　李楠　呂志偉等

摘要：以云南元江普通野生稻為供體親本、以?xún)?yōu)良秈稻品種特青為受體親本構(gòu)建了高代回交群體（BC3）。采用全自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定糙米中的總氮含量，用總氮含量乘以5.95估算儲(chǔ)藏的蛋白質(zhì)含量，蛋白質(zhì)含量采用Map Manager QTXb17軟件進(jìn)行數(shù)量性狀基因座（quantitative trait locus，QTL）定位分析，利用QTL檢測(cè)分析2次測(cè)定的儲(chǔ)存蛋白，結(jié)果共發(fā)現(xiàn)14個(gè)對(duì)蛋白質(zhì)含量有較高相關(guān)性的QTL。在第1號(hào)染色體的RM272、RM243、RM23、RM5、RM212、RM306位點(diǎn)和第2號(hào)染色體的RM250位點(diǎn)附近發(fā)現(xiàn)了7個(gè)能提高蛋白質(zhì)含量的QTL，它們均來(lái)源于野生稻；另外7個(gè)QTL位于第6、7、8、10號(hào)染色體上，分別是第6號(hào)染色體的RM345、第7號(hào)染色體的RM295、RM82、RM481、RM172，第8號(hào)染色體的RM25，以及第10號(hào)染色體的RM258附近的QTL，它們來(lái)源于栽培稻親本特青的等位基因作用表現(xiàn)為提高蛋白質(zhì)含量。在檢測(cè)到的QTL中，有6個(gè)QTL在2次分析中均被檢測(cè)到，經(jīng)分析是較穩(wěn)定的低蛋白QTL，它們分別為RM243、RM23、RM5、RM295、RM82、RM258。

關(guān)鍵詞：野生稻基因滲入系；籽粒儲(chǔ)藏蛋白質(zhì)；凱氏定氮法；QTL分析

中圖分類(lèi)號(hào)： Q946.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）03-0050-03

水稻是一種重要的糧食作物，世界上約50%的人口以稻米為主食，稻米蛋白質(zhì)被稱(chēng)作優(yōu)質(zhì)植物蛋白[1]，通過(guò)與其他谷物進(jìn)行比較可知，水稻中必需氨基酸的含量大體上要高于聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）/世界衛(wèi)生組織（WHO）建議的標(biāo)準(zhǔn)水平[2]，其第一限制性氨基酸賴(lài)氨酸含量高于其他谷類(lèi)，是人類(lèi)蛋白質(zhì)的主要來(lái)源之一。在發(fā)展中國(guó)家，約60%的蛋白來(lái)源于谷物，在未來(lái)的幾十年里，谷物仍是世界上2/3人口的主要蛋白來(lái)源[3]。因此，提高稻米蛋白質(zhì)含量已經(jīng)成為當(dāng)今水稻品質(zhì)育種的一個(gè)重要內(nèi)容；同時(shí)，隨著慢性腎功能不全患者不斷增加，培育低蛋白含量，特別是培育低可消化吸收蛋白（谷蛋白）含量水稻品種已成為功能水稻的新育種目標(biāo)。

籽粒儲(chǔ)存蛋白受多基因控制，屬于數(shù)量遺傳性狀，開(kāi)展控制籽粒儲(chǔ)存蛋白含量的數(shù)量性狀基因座（quantitative trait locus，QTL）定位與克隆，不僅對(duì)水稻種質(zhì)資源創(chuàng)新和高蛋白米、低蛋白米的新品種選育有重要的理論意義，而且對(duì)當(dāng)前調(diào)整農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)、保持農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展同樣具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

迄今為止，大量的研究主要是對(duì)水稻農(nóng)藝性狀的遺傳分析和基因定位，并且對(duì)稻米品質(zhì)性狀的遺傳分析和基因定位研究主要集中于加工品質(zhì)、外觀品質(zhì)和蒸煮及食味品質(zhì)等性狀上[4-9]，而關(guān)于水稻糙米儲(chǔ)存蛋白定位的報(bào)道并不多見(jiàn)，僅限于個(gè)別報(bào)道。于永紅等利用協(xié)青早B/密陽(yáng)46的重組自交系群體對(duì)水稻糙米蛋白質(zhì)含量的QTL分析表明，5個(gè)控制蛋白質(zhì)含量的QTLs（qPc-3、qPc-4、qPc-5、qPc-6、qPc-10）均被檢測(cè)到，單個(gè)QTL對(duì)群體表型變異的貢獻(xiàn)率為4.17%～19.14%；其中第6號(hào)染色體的Wx基因區(qū)域?qū)Φ鞍踪|(zhì)含量具有主效作用[10]。Li等利用亞洲栽培稻和非洲栽培稻的回交高代群體，在第8號(hào)染色體上定位到了1個(gè)QTL[11]。Yoshida等利用DH群體（由花藥單倍體誘導(dǎo)得到）定位到了分別位于第 8、9、11、12號(hào)染色體上的4個(gè)控制稻米蛋白含量的QTLs，其中第11號(hào)染色體RM206位點(diǎn)附近的QTL效應(yīng)較大[12]。Aluko等利用非洲野生稻與秈稻BC3F1回交構(gòu)建的DH群體，分別在第1、2、6、11號(hào)染色體上檢測(cè)到4個(gè)與蛋白質(zhì)含量相關(guān)的QTLs，其中位于第1號(hào)染色體RM226至RM297位點(diǎn)之間的QTL貢獻(xiàn)率較大[13]。張濤等檢測(cè)到6個(gè)QTLs （qPc-3、qPc-6、qPc-7、qPc-8-1、qPc-8-2、qPc-11）對(duì)糙米蛋白質(zhì)含量進(jìn)行控制，它們分別位于第3、6、7、8、11號(hào)染色體上，單個(gè)QTL對(duì)群體表型變異的貢獻(xiàn)率為379%～19.41%[14]。在這些QTL的區(qū)間中，第8染色體的基因區(qū)域?qū)Σ诿椎鞍踪|(zhì)含量具有主效作用。李晨等利用BC4群體共定位到了6個(gè)糙米蛋白QTLs，分別位于第1、2、8、9號(hào)染色體上，其中位于第1號(hào)染色體RM472位點(diǎn)附近的QTL具有主效作用[15]。

野生稻中蘊(yùn)含著豐富的遺傳信息，是栽培稻的祖先，因此發(fā)掘野生稻中的有益基因不僅有利于解決當(dāng)前育種資源狹窄的現(xiàn)狀，而且是突破育種瓶頸的有效方法之一。但是，目前關(guān)于從野生稻中定位QTL的報(bào)道并不多，各個(gè)方面都待完善，因此今后需要進(jìn)一步強(qiáng)化這方面的工作。本研究通過(guò)采用凱氏定氮法對(duì)野生稻染色體片段代換系（簡(jiǎn)稱(chēng)水稻野栽滲入系）的籽粒儲(chǔ)存蛋白質(zhì)含量進(jìn)行分析，并對(duì)控制籽粒儲(chǔ)存蛋白質(zhì)含量的QTL進(jìn)行了檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 群體構(gòu)建

本研究所構(gòu)建的野栽滲入系由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)孫傳清博士提供，是以元江普野為供體親本、秈稻品種特青為受體親本培育而成的。在BC3F2群體的基礎(chǔ)上，連續(xù)自交3次得到BC3F3、BC3F4群體。根據(jù)BC3F2株系表型鑒定和基因分析結(jié)果，滲入系構(gòu)建的基本材料選取了263個(gè)BC3F3、BC3F4單株，最終滲入系由106個(gè)BC3F3、BC3F4候選單株構(gòu)成。

1.2 SSR引物擴(kuò)增及數(shù)據(jù)處理

根據(jù)Temnykh等發(fā)表的水稻SSR序列合成引物，用在親本間有多態(tài)性的112個(gè)SSR標(biāo)記，調(diào)查上述野栽滲入系群體106個(gè)系的基因型[16]。在基因型分析中，“B”表示與親本特青帶型相同，“A”表示與野生稻親本帶型相同，“H”則表示具雜合帶型，“-”表示帶型模糊或由于某種原因缺失。采用MAPMAKER/EXP3.0軟件并參考Temnykh等發(fā)表的水稻SSR連鎖圖譜為框架，構(gòu)建連鎖圖譜，可見(jiàn)112個(gè)SSR標(biāo)記分布于12條染色體上，各染色體上最多的有13個(gè)標(biāo)記，最少的有7個(gè)標(biāo)記，平均每條染色體有9.3個(gè)標(biāo)記，標(biāo)記平均間距17.8 cM，基本能滿(mǎn)足QTL定位需要[16]。

1.3 糙米儲(chǔ)藏蛋白質(zhì)含量的測(cè)定及QTL分析

選用2006年于北京采收的種子，挑選表型一致（如大小、顏色）的水稻籽粒，剝?nèi)シf殼后于干燥箱（105 ℃）中干燥5 h，然后以8粒種子為1組稱(chēng)質(zhì)量，每個(gè)家系重復(fù)5次。采用意大利產(chǎn)全自動(dòng)凱氏定氮儀（UDK 142）測(cè)定糙米中的總氮含量，用總氮含量乘以5.95估算儲(chǔ)藏的蛋白質(zhì)含量[17-18]。為了確保測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，同時(shí)選用2007年采收于北京的種子進(jìn)行同樣的測(cè)定，重復(fù)3次。

采用Map Manager QTXb17軟件，取P<0.05作為判斷QTL存在的閾值，并用單位點(diǎn)分析法對(duì)籽粒儲(chǔ)藏蛋白質(zhì)含量進(jìn)行QTL定位與遺傳分析[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 籽粒儲(chǔ)藏蛋白質(zhì)含量的分布

圖1是不同家系的蛋白質(zhì)含量分布情況。可見(jiàn)滲入系群體的蛋白質(zhì)含量趨于正態(tài)分布，符合數(shù)量性狀的特征，適于QTL定位分析。

2.2 QTL解析

將滲入系群體的籽粒蛋白質(zhì)含量數(shù)據(jù)采用Map Manager QTXb17軟件進(jìn)行QTL定位分析，共檢測(cè)到11個(gè)與蛋白質(zhì)含量相關(guān)的QTL（表1）。其中位于第1號(hào)染色體RM272、RM243、RM23、RM5、RM306位點(diǎn)附近以及位于第2號(hào)染色體RM250位點(diǎn)附近的計(jì)6個(gè)QTL，貢獻(xiàn)率分別為5%、8%、6%、7%、5%、6%，加性效應(yīng)分別為-0.61%、-0.91%、-0.56%、-0.57%、-0.62%、-0.69%，來(lái)源于野生稻的等位基因能夠提高糙米籽粒儲(chǔ)藏蛋白質(zhì)含量。另外5個(gè)QTL位于第6、7、10號(hào)染色體上，分別是第6號(hào)染色體RM345位點(diǎn)，第7染色體RM295、RM481、RM82位點(diǎn)，以及第10染色體RM258位點(diǎn)附近的QTL，貢獻(xiàn)率分別為5%、9%、6%、7%、5%，加性效應(yīng)值分別為084%、0.77%、0.58%、0.59%、047%，來(lái)源于特青的等位基因表現(xiàn)為提高糙米籽粒儲(chǔ)藏蛋白質(zhì)含量。

2007年批次種子的重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，共檢測(cè)到9個(gè)與蛋白質(zhì)含量相關(guān)的QTL。分別位于第1、7、8、10號(hào)染色體上，貢獻(xiàn)率為5%～10%。與表1相比可知，在第2、6號(hào)染色體上沒(méi)有檢測(cè)到QTL，而在第8號(hào)染色體上檢測(cè)到的來(lái)源于特青的、提高蛋白質(zhì)含量的QTL在第1次的結(jié)果中并沒(méi)有檢測(cè)到。

2次結(jié)果均檢測(cè)到的QTL位點(diǎn)見(jiàn)表3，可見(jiàn)有位于第1號(hào)染色體的RM243、RM23、RM5位點(diǎn)附近的3個(gè)QTL，表現(xiàn)為野生稻等位基因提高糙米籽粒儲(chǔ)藏蛋白質(zhì)含量；還有位于第7號(hào)染色體RM295、RM82位點(diǎn)和第10號(hào)染色體RM258位點(diǎn)附近的3個(gè)QTL，表現(xiàn)為特青等位基因提高糙米籽粒儲(chǔ)藏蛋白質(zhì)含量。

3 結(jié)論與討論

本研究以元江普野為供體親本、秈稻品種特青為受體親本構(gòu)建的野栽滲入系群體的種子為材料，在全自動(dòng)凱氏定氮儀中消化并測(cè)定剝掉穎殼后糙米的含氮量，用含氮量乘以595作為糙米蛋白質(zhì)含量的計(jì)算指標(biāo)。用Map Manager QTXb17軟件，取P<0.05作為判斷QTL存在的閾值，并用單位點(diǎn)分析法，對(duì)籽粒儲(chǔ)藏蛋白質(zhì)含量進(jìn)行QTL定位與遺傳分析，2次共定位到14個(gè)QTL位點(diǎn)。其中來(lái)自野生稻親本的高蛋白QTL有7個(gè)，分別分布于第1、2號(hào)染色體上，第1號(hào)染色體上有6個(gè)，第2號(hào)染色體上有1個(gè)。來(lái)源于栽培稻親本特青的高蛋白QTL也有7個(gè)，分別分布于第6、7、8、10號(hào)染色體上，第7號(hào)染色體上有4個(gè)，其余染色體上各有1個(gè)。

通過(guò)與以前的研究結(jié)果相比較，我們發(fā)現(xiàn)有5 個(gè)QTL位點(diǎn)與前人所報(bào)道的QTL位點(diǎn)在同一區(qū)域或者在相臨區(qū)域。位于第1號(hào)染色體上RM23位點(diǎn)附近的QTL與李晨等報(bào)道的qCP1-1[15]在同一區(qū)域。位于第1號(hào)染色體上RM212位點(diǎn)附近的QTL，以及位于第2號(hào)染色體上RM250位點(diǎn)附近的QTL分別與Aluko等報(bào)道的Pro1、Pro2[13]在同一區(qū)域。位于第7號(hào)染色體RM172位點(diǎn)附近的QTL與吳長(zhǎng)明等報(bào)道的Pr3[20]處于相臨區(qū)域。位于第8號(hào)染色體RM25位點(diǎn)附件的QTL與張濤等報(bào)道的qPc-8-2[14]在相近區(qū)域，經(jīng)分析是同一位點(diǎn)。

此外，經(jīng)過(guò)分析有9個(gè)QTL位點(diǎn)與以前報(bào)道的位置不一樣，是檢測(cè)到的新QTL；這9個(gè)QTL位點(diǎn)分別位于第1號(hào)染色體RM272、RM243、RM5、RM306位點(diǎn)附近，第6號(hào)染色體RM345位點(diǎn)附近，第7號(hào)染色體RM295、RM481、RM82位點(diǎn)附近，以及位于第10號(hào)染色體RM258位點(diǎn)附近。

在本研究中，沒(méi)有檢測(cè)到主效QTL，檢測(cè)到的QTL貢獻(xiàn)率最大的為10%，這一結(jié)論與Li等的研究結(jié)果[11，21-22]類(lèi)似，而與于永紅等的研究結(jié)果[10，12-15，23]有所差異，認(rèn)為這種差異可能是由于所用的材料不同造成的。

本研究共從野生稻中檢測(cè)到7個(gè)控制籽粒儲(chǔ)存蛋白質(zhì)的QTL，其中在第1號(hào)染色體上有6個(gè)，在第2號(hào)染色體上有1個(gè)，這為今后進(jìn)一步研究分析和利用這些QTL打下了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]周麗慧，劉巧泉，張昌泉，等. 水稻種子蛋白質(zhì)含量及組分在品種間的變異與分布[J]. 作物學(xué)報(bào)，2009，35（5）：884-891.

[2]王治平. 大米品質(zhì)與主食米飯食用品質(zhì)相關(guān)性的研究[D]. 長(zhǎng)沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2000：2-4.

[3]姚惠源. 稻米深加工[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004.

[4]Tan Y F，Li J X，Yu S B，et al. The three important traits for cooking and eating quality of rice grains are controlled by a single locus in an elite rice hybrid，Shanyou 63[J]. Theoretical and Applied Genetics，1999，99（3/4）：642-648.