李志紅,買旭林（義馬煤業(yè)集團(tuán)煤生化高科技工程有限公司,河南 三門峽 472300）

分光光度法測(cè)定脂肪酶活性的優(yōu)化研究

李志紅,買旭林（義馬煤業(yè)集團(tuán)煤生化高科技工程有限公司,河南 三門峽 472300）

針對(duì)該分光光度法，在研究過(guò)程中任何一個(gè)因素的改變都會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果造成偏差，為此對(duì)各個(gè)因素進(jìn)行了優(yōu)化：體積比為0.25的橄欖油微乳液4ml、酶液1ml、體系溫度35℃、體系pH7.0、反應(yīng)時(shí)間20min。在該組合條件下所測(cè)酶活數(shù)值為最大。

脂肪酶;活力測(cè)定;分光光度;條件優(yōu)化

1 概述

該方法在對(duì)不同來(lái)源的脂肪酶活力測(cè)定較為常見(jiàn)，但由于沒(méi)有統(tǒng)一的國(guó)家或地方性的標(biāo)準(zhǔn)，該研究對(duì)各個(gè)條件進(jìn)行了優(yōu)化，在該體系條件下所測(cè)酶活力達(dá)到最大，說(shuō)明此時(shí)為最適條件。從而建立一套準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好的脂肪酶活的測(cè)定方法[1]。

2 試劑和溶液

脂肪酶（食品級(jí)，深圳綠微康生物工程有限公司）；脂肪酸（分析純，天津市恒津化學(xué)制劑制造有限公司）；橄欖油（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；吐溫-80（分析純，上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司）；醋酸銅（分析純，天津市恒津化學(xué)試劑制造有限公司）；正己烷（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）其他均為國(guó)產(chǎn)分析純；0.05mol/L磷酸鹽緩沖液（pH =7.5）。

3 儀器和設(shè)備

磁力攪拌器、高速離心機(jī)、振蕩器、超聲儀、分光光度計(jì)等。

4 試驗(yàn)

4.1 顯色劑用量對(duì)吸光度的影響

本方法所用顯色劑使用5%的醋酸銅溶液，加入吡啶并將pH調(diào)至6.1，在波長(zhǎng)為710nm時(shí)，銅皂在此溶液的吸光度最大，所以此法配制的顯色劑較為理想。但顯色劑的添加量又對(duì)最終吸光度的影響較大，添加過(guò)少或過(guò)多都不能真實(shí)反映脂肪酸的生成量。需要試驗(yàn)以確定顯色劑的添加量[2]。

根據(jù)本試驗(yàn)要求，取脂肪酸的苯溶液4ml于100ml錐形瓶中，依次添加0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4ml不同量的顯色劑，磁力攪拌2min，靜止片刻，取上層有機(jī)相在710nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，同時(shí)以4ml苯作為空白樣。根據(jù)顯色劑用量的曲線圖確定最佳用量。

4.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

酶分子和底物的反應(yīng)，在初期速度呈線性，即為酶反應(yīng)的初速度，此階段的時(shí)間和產(chǎn)物生成量呈正比，時(shí)間的計(jì)算才有意義。時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，產(chǎn)物產(chǎn)量趨于平緩，再計(jì)算平均速度已無(wú)實(shí)際意義。

為考察時(shí)間對(duì)酶反應(yīng)的影響，設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，其他條件如3，反應(yīng)時(shí)間分別為10、15、20、25、30min，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)吸光度計(jì)算不同組脂肪酸的產(chǎn)生量。

4.3 反應(yīng)體系的pH值對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

其它條件如3，調(diào)節(jié)緩沖液的pH值分別為3、4、5、6、7、8、9?？疾旆磻?yīng)體系pH對(duì)酶活力測(cè)定的影響。

4.4 反應(yīng)體系溫度對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

其它條件如3，調(diào)節(jié)水浴溫度分別為25、30、35、40、45、50℃，考察反應(yīng)體系溫度對(duì)酶活力測(cè)定的影響。

4.5 底物濃度對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

其它條件如3，考察底物濃度（橄欖油）分別為0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35（V/V）時(shí)對(duì)酶活測(cè)定的影響。底物濃度和酶液濃度的最佳值都是相對(duì)而言的，由于酶促催化反應(yīng)存在酶飽和現(xiàn)象，當(dāng)橄欖油濃度低時(shí)，脂肪酶沒(méi)有完全被橄欖油飽和，因而酶活力隨著底物濃度的增大而增加。當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到一定值后，脂肪酶被完全飽和，隨著底物濃度增大而酶促反應(yīng)速率開(kāi)始放緩，此時(shí)可測(cè)得最大酶活。

5 結(jié)果與討論

5.1 顯色劑用量對(duì)吸光度的影響

分別測(cè)得顯色劑在不同添加量0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 ml時(shí)的吸光度分別為0.801、0.843、0.877、0.881、0.889、0.902 L/（g.cm）。以吸光度為縱軸、顯色劑用為橫軸作圖，得到圖1所示顯色劑用量-吸光度曲線圖，從曲線中看出當(dāng)用量達(dá)到1.0ml時(shí)吸光度增大不明顯，因此選取1.0ml較為合適[3]。

5.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

反應(yīng)分別進(jìn)行10、15、20、25、30 min后測(cè)得脂肪酸的濃度為10、14、18、21、23 μmol/L。以脂肪酸濃度對(duì)反應(yīng)時(shí)間作圖，即得到圖2所示曲線，由圖可看出，反應(yīng)前25min曲線呈線性，該段時(shí)間內(nèi)酶促反應(yīng)處于初速度階段，而為了檢驗(yàn)步驟的簡(jiǎn)便，同時(shí)在保證結(jié)果準(zhǔn)確的情況下，選取20min為宜。

5.3 反應(yīng)體系的pH值對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

該組試驗(yàn)分別在pH為3、4、5、6、7、8、9條件下進(jìn)行，通過(guò)對(duì)緩沖溶液調(diào)節(jié)酸堿度實(shí)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)反應(yīng)后得到的結(jié)果以百分比的形式表示，以測(cè)得酶活的最大值為100%，結(jié)果分別為21%、44%、79%、88%、97%、86%、15%。用百分比對(duì)pH作圖，得到如圖3所示曲線，由圖可看出反應(yīng)最適pH為7，較低或較高的酸堿度都對(duì)結(jié)果影響較大。

5.4 反應(yīng)體系溫度對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

該組試驗(yàn)分別設(shè)置不同的溫度進(jìn)行反應(yīng)，分別為25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，經(jīng)過(guò)反應(yīng)后得到的結(jié)果以百分比的形式表示，以測(cè)得酶活的最大值為100%，結(jié)果分別為51%、93%、98%、89%、58%、5%，用百分比對(duì)溫度作圖，得到如圖4所示曲線，由圖可看出反應(yīng)的最適溫度為35%左右，30%以下、45%以上酶的活力急劇下降降幅在50%左右，這是由于高溫下酶分子的空間結(jié)構(gòu)遭到破壞，酶失去活性，不再具有降低反應(yīng)活化能的功能，而溫度過(guò)低自然會(huì)降低酶反應(yīng)的速率[4]。

5.5 底物濃度對(duì)酶活測(cè)定的影響

該組反應(yīng)分別添加不同量的橄欖油，分別為0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35（v/v），反應(yīng)產(chǎn)生的脂肪酸濃度分別為1.10、1.40、1.62、1.90、2.11、2.20 μmol/L.min。以脂肪酸濃度對(duì)底物濃度作圖，得到如圖5所示曲線，由圖可看當(dāng)?shù)孜餄舛瘸^(guò)0.3時(shí)反應(yīng)速度增加緩慢，不呈線性關(guān)系，為了保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，選取0.25為添加濃度[5]。

5.6 注意事項(xiàng)

（1）固體酶粉的處理應(yīng)確保酶分子充分浸提，稀釋定容過(guò)程中應(yīng)防止交叉污染，否則對(duì)結(jié)果的影響較大。酶液配制完成后應(yīng)在12h內(nèi)使用。

（2）試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，形成微乳液的水來(lái)自酶液，而水含量對(duì)酶活又有較大影響，因此酶液的體積應(yīng)準(zhǔn)確控制。同時(shí)，試驗(yàn)中為降低反應(yīng)體系中水的生成量，可采用在低壓環(huán)境下進(jìn)行。

6 結(jié)論

該方法采用分光光度法，與滴定法相比較而言有較高的靈敏度和可重復(fù)性，失誤率也較低，可作為脂肪酶活性測(cè)定的一個(gè)可靠方法。不足之處是該方法的反應(yīng)條件有待更加嚴(yán)謹(jǐn)?shù)拇_定，可以采用正交分析法或響應(yīng)面分析法，設(shè)計(jì)出多因素、多水平、數(shù)據(jù)更加精確的數(shù)據(jù)，綜合分析出最優(yōu)的組合，從而使結(jié)果更加接近真實(shí)值。該方法的研究也在一定程度上對(duì)酶促反應(yīng)的基本理論的完善奠定了基礎(chǔ)，為行業(yè)進(jìn)一步提高脂肪酶檢測(cè)的效率和準(zhǔn)確率做出了貢獻(xiàn)。

[1]鄭毅,葉海梅.脂肪酶活力測(cè)定研究進(jìn)展.工業(yè)微生物,2005,35（04）:36.

[2]張海燕,丁玉.脂肪酶活力測(cè)定的最新研究.生物學(xué)通報(bào),2007,42（03）:16.

[3]廖朝暉.在有機(jī)介質(zhì)中固定化脂肪酶反應(yīng)特性及其動(dòng)力學(xué)研究.南昌大學(xué)學(xué)報(bào)（理科版）,2000,24（04）:326-331.

[4]五校合編.有機(jī)化學(xué)[M].高等教育出版社,1986.

李志紅（1981-）,本科,助理工程師，研究方向：生物科學(xué)。