薄維超,李謝,鄭霞,羅 麗（連云港師范高等專科學校,江蘇 連云港 222000）

蝴蝶蘭組培瓶苗的微生物污染防治研究

薄維超,李謝,鄭霞,羅 麗
（連云港師范高等?？茖W校,江蘇 連云港 222000）

摘要：對工廠化快速繁殖蝴蝶蘭過程中出現(xiàn)的組培瓶苗污染問題開展研究工作。分離純化得到6種污染微生物，采用濾紙片法篩選出100mg/L鏈霉素+100mg/L硫酸慶大霉素+100mg/L苯甲酸為最佳使用抑菌劑組合，并且對蝴蝶蘭苗的增殖影響不大。

關鍵詞：蝴蝶蘭；組培瓶苗；污染；防治

蝴蝶蘭（Phalaenopsis hybrids）是名貴花卉之一，以花大、色艷、花期長而著稱，具有很高的觀賞價值。蝴蝶蘭屬單莖氣生蘭，極少發(fā)育側枝，難以進行常規(guī)的無性繁殖。通過組織培養(yǎng)技術可以在短期內(nèi)快速繁殖獲得大量幼小植株，適應市場的大量需求，也是工廠化育苗的重要途徑。工廠化育苗為保證母株的優(yōu)良特點，如花型、花色等商品要求，需要采用花梗上的營養(yǎng)芽作為原代培養(yǎng)的起始材料，將花梗截取成每段帶單芽的4-5cm小梗，接種至原代培養(yǎng)基中誘導單芽萌發(fā)；當單芽萌發(fā)生長具有長度達到1cm的1葉時，切割除去花梗，取生長的芽轉接到初代培養(yǎng)基中增高和壯芽培養(yǎng)1個月；切去培養(yǎng)壯實的芽苗葉片和頂芽以去除頂端優(yōu)勢，然后將不高的莖段沿著節(jié)間分割，將帶有腋芽的每節(jié)段，培養(yǎng)到增殖培養(yǎng)基中誘導多芽的產(chǎn)生，通常單次增殖率小于等于3，繼代培養(yǎng)次數(shù)不超過8次，以免畸形芽的產(chǎn)生；通過不斷的增殖實現(xiàn)快速繁殖；再通過壯苗、生根、煉苗等培養(yǎng)方可出瓶進入溫室培養(yǎng)階段。在蝴蝶蘭的整個快速繁殖培養(yǎng)過程中都可能出現(xiàn)污染[1]。本文主要是對蝴蝶蘭瓶苗增殖培養(yǎng)過程中的污染進行研究。

1 試驗器材

1.1 實驗材料和試劑

蝴蝶蘭污染瓶苗（由連云港振興蘭業(yè)股份有限公司組培中心提供）。

革蘭氏染色試劑盒、鏈霉素、青霉素、硫酸慶大霉素、苯甲酸（均購自上海國藥集團）。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基

（1）蝴蝶蘭增殖培養(yǎng)基：花寶1號+6-BA3mg/L+NAA0.5mg+蔗糖3%+活性炭4g/L+馬鈴薯10%+瓊脂0.8%,pH5.8。（2）牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基。（3）PDA固體培養(yǎng)基。

1.2.2 菌種分離與純化

（1）平板劃線分離：在污染的瓶苗培養(yǎng)基中挑取出污染菌，分別在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基平板和PDA固體培養(yǎng)基平板上劃線分離。蠟膜封口，倒扣于溫箱中培養(yǎng)。前者培養(yǎng)溫度為37℃，3-5d；后者為28℃，7-10d。

（2）平板劃線純化：刮取平板上的單菌落上的少量細胞，劃線純化培養(yǎng)2次，以得到純化菌種，將純化的菌種接種于蝴蝶蘭增殖培養(yǎng)基中復感染培養(yǎng)，觀察菌落的形態(tài)是否與取樣時瓶苗內(nèi)的污染一致。25℃培養(yǎng)室培養(yǎng)，光照1500lux，光周期16h/d，培養(yǎng)10-15d。對復感染一致的菌種進行編號，4℃保存。

1.2.3 純化菌種的初步鑒定

（1）菌落形態(tài)觀察：將活化的菌種平板劃線培養(yǎng)2-10d，觀察單菌落的生長形態(tài)并記錄。

（2）對污染細菌進行鑒定：對獲得的純化菌進行革蘭氏染色鏡檢，確定基本形態(tài)大小和革蘭氏屬性。

1）確定形態(tài)大?。河^察形態(tài),使用顯微測微尺對革蘭氏染色涂片上的菌體細胞進行大小測量。

2）確定革蘭氏屬性：對制作的涂片進行革蘭氏染色，鏡檢結果，藍紫色為G+，紫紅色為G—。

（3）對污染真菌進行鑒定：制作水浸片染色鏡檢觀察菌絲及繁殖器特征，查閱《真菌鑒定手冊》確定屬。

1.2.4 平板抑菌實驗

采用濾紙片法以鏈霉素、青霉素、硫酸慶大霉素、苯甲酸等及混合抑菌劑對分離到的菌種進行抑菌實驗，采用的平板培養(yǎng)基為蝴蝶蘭增殖培養(yǎng)基[2]。

（1）菌種活化：將保存在冰箱4℃的分離純化菌種轉接到蝴蝶蘭增殖培養(yǎng)基平板上，細菌類37℃培養(yǎng)48h，真菌類培養(yǎng)28℃培養(yǎng)4-7d。

（2）制備菌懸液．

（3）紙片法抑菌實驗．

1.2.5 抑菌劑對組培苗生長的影響

觀察優(yōu)化抑菌劑組合對蝴蝶蘭組培苗生長發(fā)育的影響。通過統(tǒng)計新生葉數(shù)、新生根數(shù)、芽增殖倍數(shù)等評價混合抑菌劑對蝴蝶蘭組培苗生長的影響[3]。

2 實驗結果及分析

2.1 微生物的形態(tài)特征及鑒定

分離的污染微生物菌種特征如下表。

表1 分離污染菌的形態(tài)特征

從表中可以判斷出，1號和2號菌為細菌，3號為酵母菌，4,、5 和6號為霉菌。其中1號為桿菌，G-,2號為球菌，G+。對霉菌的產(chǎn)孢子梗進一步觀察可以鑒別出菌屬，見表2。

表2 三類污染霉菌的產(chǎn)孢子梗形態(tài)

從表2列出的三類霉菌分生孢子梗特征，綜合菌落特征，菌絲特點。查閱《真菌鑒定手冊》可以判斷出4號為綠色木霉，5號為黑曲霉，6號為青霉。

2.2 濾紙片法抑菌實驗結果分析

經(jīng)過表1和表2的結果，可知有2種細菌、1種酵母菌和3種霉菌。選用了鏈霉素、青霉素、硫酸慶大霉素、苯甲酸三種藥品進行抑菌實驗。鏈霉素主要作用于細菌核糖體，影響蛋白質(zhì)的合成功能。故4、5和6號沒有用該藥品處理。青霉素主要作用于革蘭氏陽性細菌細胞壁的肽聚糖，由于3、4、5、6號為真菌，細胞壁中沒有肽聚糖成分，故沒有用該藥品處理。硫酸慶大霉素主要作用于細菌蛋白質(zhì)合成有關的核糖體亞基，對真菌無效，故3、4、5、6號未用該藥品處理。

結果見下表3。

表3 濾紙片法抑菌實驗

從上表可以看出，四種藥品中青霉素的效果最差，因為它主要作用于革蘭氏陽性細菌細胞壁上的肽聚糖，革蘭氏陰性細菌細胞壁中肽聚糖含量較少，故對2號的抑制效果由于對1號菌。其它三種藥品又以苯甲酸的抑菌效果最全面，對6種菌均有抑制作用，而且效果較好。當這三種藥品達到200mg/L時均有較好的抑菌效果。但是考慮到單獨使用一種藥品，高濃度長時間抑菌會使微生物產(chǎn)生抗藥性。因此，將三種藥品加以組合用于蘭苗培養(yǎng)過程中的抑菌。實驗結果見下表。

表4 組合藥品抑菌圈測試

從上表可以看到，鏈霉素、慶大霉素、苯甲酸都是相同濃度組合效果優(yōu)于表3中在相同濃度條件下單獨使用一種藥品的抑菌效果好。隨著濃度的增加，抑菌圈越大，但是考慮到過高藥品濃度會對蝴蝶蘭苗的生長造成影響，以及使微生物產(chǎn)生抗藥性，因此選擇中間濃度的藥品組合用于抑菌[5-7]。

2.3 抑菌劑對蝴蝶蘭瓶苗生長的影響

采用100mg/L和200mg/L的藥品添加到蝴蝶蘭增殖培養(yǎng)基中觀察對蝴蝶蘭苗生長的影響。發(fā)現(xiàn)200mg/L對蝴蝶蘭苗的生長影響較大，葉片生長緩慢，易黃化。而采用100mg/L的組合則沒有受到影響，結果見下表5。

表5 組合抗菌劑對接種90d蝴蝶蘭瓶苗生長的影響

3 結語

本實驗對蝴蝶蘭污染瓶苗中的污染微生物進行分離純化劑初步鑒定，得到常見污染物有6種，其中1號為球菌、2號為桿菌、3號為酵母菌、4號為木霉、5號為黑曲霉，6號為青霉菌。采用100mg/ L鏈霉素+100mg/L慶大霉素+100mg/L苯甲酸處理，可以得到非常好的抑菌效果，同時對蝴蝶蘭苗的增殖生長影響很小。

參考文獻：

[1]李娟.蝴蝶蘭再生體系的建立及組織培養(yǎng)中的污染防治研究[D].

[2]于福科, 張廣軍.玫瑰組織培養(yǎng)污染控制技術措施. 陜西農(nóng)業(yè)科學, 2002(11):47-48.

[3]周俊輝, 周厚高, 劉花全.植物組織培養(yǎng)中的內(nèi)生細菌污染問題[J].廣西植物, 2003,23(01):41-47.

[4]時群.紅掌組織培養(yǎng)污染率控制研究(簡報)[J].亞熱帶植物科學,2010(03):80-81.

[5]潭文澄.觀賞植物組織培養(yǎng)技術[M].北京：中國林業(yè)出版社,1991.

[6]謝鳳琦,張金蓮,董新玉.植物組織培養(yǎng)中常見病原菌種類及污染控制措施[J].林業(yè)科技，2014(02):182-183.

[7] 訾梅廷，徐連峰，李振海等.林木組織培養(yǎng)及工廠化育苗中污染的控制技術[J].防護林科技，2005(03):45-46.

項目支撐：2013年江蘇省大學生創(chuàng)新訓練計劃項目（編號：201311585004Y）

指導教師1：羅麗（1977-），女，副教授。

指導教師2：鄭霞（1977-），女，高級實驗師。

作者簡介：薄維超（1994-），男，漢族。連云港師范高等專科學校海洋港口學院12級學生。