張航，陳曦，馮進(jìn)輝，鮑錦庫(kù)，吳洽慶，朱敦明

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高通量篩選具有催化活性和立體選擇性羰基還原酶

張航1，陳曦2，馮進(jìn)輝2，鮑錦庫(kù)1，吳洽慶2，朱敦明2

1 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610064 2 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所工業(yè)酶國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室天津市生物催化技術(shù)工程中心，天津 300308

張航, 陳曦, 馮進(jìn)輝, 等. 高通量篩選具有催化活性和立體選擇性羰基還原酶.生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(2): 220–230.Zhang H, Chen X, Feng JH, et al. High throughput screening of active and stereoselective carbonyl reductases. Chin J Biotech, 2015, 31(2): 220–230.

根據(jù)羰基還原酶催化可逆氧化還原反應(yīng)的原理，利用與偶氮還原酶催化偶氮染料還原反應(yīng)耦合的顏色變化，建立了一種新的羰基還原酶篩選方法。由于羰基還原酶在催化醇底物氧化反應(yīng)時(shí)會(huì)產(chǎn)生NAD(P)H，當(dāng)在反應(yīng)體系中加入偶氮還原酶AzoB和偶氮染料金橙Ⅰ的時(shí)候，偶氮還原酶可以利用NAD(P)H作為電子的供體與底物金橙Ⅰ發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致反應(yīng)體系顏色的變化，這樣就能夠根據(jù)明顯的顏色變化推斷出該羰基還原酶是否對(duì)所選底物表現(xiàn)出特定的活性，進(jìn)而可以篩選出有活性的羰基還原酶。同時(shí)，使用不同構(gòu)型的手性醇作為底物時(shí)，根據(jù)體系的顏色變化，可以實(shí)現(xiàn)羰基還原酶的活性和立體選擇性的同時(shí)篩選。

手性醇，羰基還原酶，偶氮還原酶，偶氮染料，篩選方法

手性醇是一類非常重要的化合物，廣泛應(yīng)用于藥物研發(fā)、有機(jī)合成、材料科學(xué)、毒理學(xué)以及環(huán)境化學(xué)等眾多領(lǐng)域。手性醇可以直接通過(guò)化學(xué)不對(duì)稱催化和生物不對(duì)稱轉(zhuǎn)化相應(yīng)的酮底物獲得，能夠?qū)崿F(xiàn)手性醇合成的生物催化劑是羰基還原酶。羰基還原酶是氧化還原酶的一種，能夠?qū)⑼€原為手性醇 (醛還原為一級(jí)醇) 或?qū)⑹中源佳趸癁橥?(一級(jí)醇氧化為醛)[1-3]。在氧化反應(yīng)過(guò)程中，酶能夠催化底物的氫轉(zhuǎn)移至輔因子，生成還原態(tài)NAD(P)H。羰基還原酶的研究與應(yīng)用已經(jīng)有了飛速的發(fā)展，來(lái)源于酵母和馬肝的羰基還原酶均有商品供應(yīng)，可以像有機(jī)催化試劑一樣購(gòu)買。羰基還原酶在還原脂肪酮底物，特別是當(dāng)羰基兩邊的取代基團(tuán)相差不大時(shí)，表現(xiàn)出了化學(xué)催化劑不具有的高立體選擇性。但是由于酶本身的特點(diǎn)，在催化一些非天然底物的時(shí)候會(huì)出現(xiàn)酶活性低，立體選擇性差等問(wèn)題。目前針對(duì)這些問(wèn)題的解決方法主要是野生酶的大規(guī)模篩選以及酶的定向進(jìn)化與改造，在此過(guò)程中，液相色譜(HPLC) 和氣相色譜(GC) 是兩種最常用的檢測(cè)立體選擇性的方法[4-8]，但是這兩種方法目前都無(wú)法對(duì)羰基還原酶的立體選擇性實(shí)現(xiàn)高通量篩選。

偶氮染料一般具有明亮的顏色，偶氮還原酶是細(xì)菌降解偶氮染料的關(guān)鍵酶。一種偶氮還原酶可作用于一種或幾種偶氮染料，它通過(guò)還原特定的偶氮染料的偶氮鍵而使染料的顏色褪去[9-11]。目前人們已經(jīng)在許多細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了對(duì)氧不敏感的偶氮還原酶的基因，如球形芽胞桿菌ssp. OY1-2[12]、金黃色葡萄球菌[13]、大腸桿菌[14]、球形紅細(xì)菌[15]、銅綠假單胞菌[16]以及糞腸球菌[17]等，并且已經(jīng)克隆、表達(dá)與鑒定了很多基因。這些對(duì)氧不敏感的偶氮還原酶主要分為核黃素依賴型偶氮還原酶和非核黃素依賴型偶氮還原酶兩類[18]。B是從K24中克隆并鑒定的一種偶氮還原酶基因[18-19]。它編碼一種由203個(gè)氨基酸組成的21 295 Da的非核黃素依賴型的偶氮還原酶AzoB。該酶可以利用NAD(P)H作為電子供體，還原偶氮染料金橙Ⅰ的偶氮鍵使其顏色消失。該酶對(duì)其他的偶氮染料如甲基紅、金橙Ⅱ、莧菜紅、麗春紅S等都沒(méi)有活性。上述的偶氮染料除金橙Ⅰ外都可以被在糞腸球菌中發(fā)現(xiàn)的偶氮還原酶AzoA所還原[17]。

根據(jù)羰基還原酶催化可逆的氧化還原反應(yīng)的原理，本文利用羰基還原酶可以在NAD(P)+存在的條件下催化相應(yīng)的醇類底物生成對(duì)應(yīng)的酮類物質(zhì)以及NAD(P)H，而偶氮還原酶則利用羰基還原酶生成的NAD(P)H，作用于偶氮染料，引起偶氮染料的顏色變化，利用目測(cè)的方式可以直接實(shí)現(xiàn)羰基還原酶活性和立體選擇性的高通量篩選 (圖1)。

圖1 篩選方法的作用機(jī)制

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑

偶氮染料金橙Ⅰ、金橙Ⅱ、甲基紅、莧菜紅、麗春紅S，均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；NAD(P)+、NAD(P)H購(gòu)自羅氏公司；篩選實(shí)驗(yàn)所選底物購(gòu)自美國(guó)Sigma公司及日本TCI公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

限制性內(nèi)切酶、T4連接酶購(gòu)自Thermo公司；質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；表達(dá)載體購(gòu)自Stratagene公司。

1.2 菌株培養(yǎng)、表達(dá)與純化

大腸桿菌菌株BL21(DE3) AzoB-pET-11a在含有氨芐青霉素(50 μg/mL) 的LB培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)12 h。按照Omega公司試劑盒的說(shuō)明對(duì)該菌株進(jìn)行質(zhì)粒提取。利用Ⅰ和HⅠ對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切處理，并利用T4連接酶將目的基因連接到同樣處理過(guò)的表達(dá)載體pET-28a (帶有組氨酸標(biāo)簽) 上，轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行功能表達(dá)。BL21(DE3) AzoB-pET-28a在含有卡那霉素(50 μg/mL) 的LB培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)12 h后，以10%的接種量進(jìn)行轉(zhuǎn)接，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后加入異丙基--d-硫代半乳糖苷 (IPTG，0.1 mmol/L) 進(jìn)行誘導(dǎo)，37 ℃再培養(yǎng)2.5 h。6 000×低溫離心收集細(xì)胞后利用高壓勻漿機(jī)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎處理。12 000×低溫離心20 min去除細(xì)胞碎片，上清液用HisTrap HP親和層析柱(5 mL) 進(jìn)行純化。層析柱在上樣前用含有250 mmol/L NaCl的20 mmol/L Tris-HCl (pH 6.8) 緩沖液進(jìn)行平衡。上樣后，用含有500 mmol/L咪唑的上述緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，分別收集各個(gè)洗脫峰，通過(guò)SDS-PAGE電泳檢測(cè)各個(gè)洗脫峰及蛋白純度。

1.3 酶活驗(yàn)證

偶氮還原酶AzoB的酶活測(cè)定根據(jù)文獻(xiàn)中的描述進(jìn)行[18]。通過(guò)測(cè)定室溫(23 ℃) 下偶氮染料金橙Ⅰ在482 nm波長(zhǎng)下光吸收值(ε482 = 22.3 mmol/(L·cm) 的減少，來(lái)計(jì)算偶氮還原酶的酶活。每分鐘消耗1 μmol金橙Ⅰ所需要的酶量定義為一個(gè)酶活力單位，反應(yīng)在200 μL 100 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.8) 中進(jìn)行，反應(yīng)體系中含有200 μmol NADPH，0.15 mmol/L金橙Ⅰ以及72 μg AzoB。

羰基還原酶的酶活測(cè)定通過(guò)檢測(cè)室溫下NADPH在340 nm波長(zhǎng)下光吸收值(ε340= 6.22 mmol/(L·cm) 的變化。反應(yīng)在96孔板中進(jìn)行，反應(yīng)體系共200 μL (100 mmol/磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)、7.0 mmol/L底物(,)-3-甲基環(huán)己醇、0.5 mmol/L NADP+以及50 μg純化的羰基還原酶SSCR M242F/Q245T) 每分鐘生成 1 μmol NADPH所需要的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。沒(méi)有加入羰基還原酶的反應(yīng)體系作為空白組，加入對(duì)該底物沒(méi)有活力的羰基還原酶CMCR設(shè)置為對(duì)照組[20-21]。

羰基還原酶與偶氮還原酶的耦合反應(yīng)在200 μL 100 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.8) 中進(jìn)行，反應(yīng)體系中含有5.0 mmol/L ()-3-甲基環(huán)己醇、0.5 mmol/L NADP+、0.15 mmol/L金橙Ⅰ以及50 μg SSCR M242F/Q245T和72 μg AzoB。

1.4 篩選方法的建立與優(yōu)化

為了探究篩選方法中的組分偶氮染料或偶氮還原酶是否會(huì)影響羰基還原酶的活力，設(shè)計(jì)A、B、C、D四組實(shí)驗(yàn)。A組含有100 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)、5.0 mmol/L底物(,)-3-甲基環(huán)己醇、0.5 mmol/L NADP+以及 50 μg羰基還原酶SSCR M242F/Q245T；B組為A組加入72 μg的偶氮還原酶AzoB；C組為A組加入偶氮染料金橙Ⅰ(0.15 mmol/L AzoB的底物)；D組為B組加入偶氮染料金橙Ⅰ (0.15 mmol/L)。

為了優(yōu)化偶氮染料金橙Ⅰ的加入時(shí)間，設(shè)計(jì)6組實(shí)驗(yàn)。6組反應(yīng)體系中均含有100 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)、5.0 mmol/L底物(,)-3-甲基環(huán)己醇、0.5 mmol/L NADP+、50 μg羰基還原酶SSCR M242F/Q245T以及72 μg偶氮還原酶AzoB。反應(yīng)不同時(shí)間 (0，1，2，3，4，5 min) 后，加入金橙Ⅰ，使其終濃度為 0.15 mmol/L，2 min后，測(cè)定482 nm下光吸收值。采用同樣的方法，對(duì)羰基還原酶底物濃度 (5.0 mmol/L、6.0 mmol/L、7.0 mmol/L)、NADP+濃度 (0.1 mmol/L、0.3 mmol/L、0.5 mmol/L) 以及金橙Ⅰ濃度 (0.15 mmol/L、0.3 mmol/L、 0.45 mmol/L) 進(jìn)行優(yōu)化。

1.5 羰基還原酶的活性篩選

為了檢測(cè)該方法的活性篩選可行性，選用實(shí)驗(yàn)室保存的16種羰基還原酶以及5種醇類或手性醇類底物進(jìn)行方法驗(yàn)證。5種底物分別為(,)-3-甲基環(huán)己醇、()-1-苯基-1,2-乙二醇、1-苯基-1,2-乙二醇、1,2-戊二醇以及(-)-薄荷醇。反應(yīng)在96孔板中進(jìn)行，反應(yīng)體系200 μL (100 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)、 5.0 mmol/L底物、0.5 mmol/L NADP+以及50 μg純化的羰基還原酶) 2 min后，加入72 μg純化的偶氮還原酶AzoB，以及偶氮染料金橙Ⅰ(終濃度0.15 mmol/L)，反應(yīng)2 min。不同羰基還原酶對(duì)不同底物的活力可以通過(guò)顏色反應(yīng)直觀地看到。

1.6 羰基還原酶的立體選擇性篩選

為了驗(yàn)證該方法在立體選擇性篩選的可行性，以羰基還原酶CMCR作用不同構(gòu)型的1-苯基-1,2-乙二醇的結(jié)果驗(yàn)證。反應(yīng)在96孔板中進(jìn)行，反應(yīng)體系200 μL (100 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)、5.0 mmol/L底物 (()-1-苯基-1,2-乙二醇或()-1-苯基-1,2-乙二醇)、0.5 mmol/L NADP+以及50 μg純化的羰基還原酶)，2 min后，加入72 μg純化的偶氮還原酶AzoB，以及偶氮染料金橙Ⅰ (終濃度0.15 mmol/L)，反應(yīng) 2 min。觀察顏色變化。

1.7 羰基還原酶的活性、立體選擇性酮底物還原驗(yàn)證

為了驗(yàn)證該方法篩選的羰基還原酶是否具有活性及立體選擇性，以()-3-甲基環(huán)己酮和a-羥基苯乙酮為底物，利用篩選得到的羰基還原酶進(jìn)行還原。反應(yīng)體系為1 mL磷酸鹽緩沖液 (100 mmol/L，pH 6.8) 中含酮底物10 mmol/L、NADP+0.5 mg、葡萄糖脫氫酶0.5 mg、葡萄糖 30 mmol/L和羰基還原酶1 mg，30 ℃過(guò)夜反應(yīng)。等體積乙酸乙酯萃取，無(wú)水硫酸鈉干燥后，產(chǎn)物用GC或HPLC與相應(yīng)的手性標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 偶氮還原酶AzoB的純化

利用限制性內(nèi)切酶Ⅰ和HⅠ對(duì)偶氮還原酶基因B進(jìn)行酶切，連接到表達(dá)載體pET-28a上，并成功轉(zhuǎn)化至BL21 (DE3) 中進(jìn)行功能表達(dá)。BL21 (DE3) AzoB-pET- 28a在含有卡那霉素(50 μg/mL) 的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)離心、破菌處理后，利用?KTA蛋白純化儀器進(jìn)行鎳柱親和層析。結(jié)果如圖2所示，SDS蛋白電泳顯示目的蛋白在表達(dá)宿主BL21(DE3)中得到了成功表達(dá)，蛋白主要存在于上清液中。

2.2 酶活驗(yàn)證

羰基還原酶與偶氮還原酶的耦合實(shí)驗(yàn)表明，羰基還原酶SSCR M242F/Q245T對(duì)底物(,)-3-甲基環(huán)己醇表現(xiàn)出了較高的酶活力，反應(yīng)體系顏色消失；而CMCR對(duì)該底物沒(méi)有表現(xiàn)出任何活力，反應(yīng)體系仍為橙色 (圖3)。

2.3 篩選方法的建立與優(yōu)化

為了探究偶氮染料或者偶氮還原酶是否會(huì)影響羰基還原酶的活力，設(shè)計(jì)A、B、C、D四組實(shí)驗(yàn)。羰基還原酶的酶活通過(guò)測(cè)定室溫下NADPH在340 nm波長(zhǎng)下光吸收值的變化來(lái)計(jì)算。結(jié)果如表1，由A組和B組實(shí)驗(yàn)可知，偶氮還原酶AzoB對(duì)羰基還原酶的活力影響不大，其中A組為9.0 U/mg，B組為7.6 U/mg。對(duì)比A組、C組和D組可知，偶氮染料金橙Ⅰ的存在明顯影響了羰基還原酶的活力，導(dǎo)致NADPH的生成量減少，為偶氮還原酶提供的電子不足，因而偶氮染料不能被完全降解。

圖2 偶氮還原酶AzoB的純化

圖3 酶活驗(yàn)證及篩選方法建立

表1 偶氮還原酶AzoB和偶氮染料金橙Ⅰ對(duì)羰基還原酶活力的影響

由于金橙Ⅰ的存在明顯影響了羰基還原酶的酶活力，設(shè)計(jì)了6組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，即在不同的反應(yīng)時(shí)間(0、1、2、3、4、5 min) 后再加入金橙Ⅰ。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，如果在加入金橙Ⅰ以及AzoB之前反應(yīng)2 min或更長(zhǎng)時(shí)間，482 nm下的光吸收值已經(jīng)低至0.3以下，說(shuō)明偶氮染料幾乎被全部降解，同時(shí)從反應(yīng)體系的顏色上也可以看到顏色的消失 (圖4)。反應(yīng)時(shí)間不足2 min的，482 nm下的光吸收值在1.0以上 (分別為1.270和1.013)，說(shuō)明還有大量偶氮染料沒(méi)有被降解，因而反應(yīng)體系的顏色沒(méi)有發(fā)生明顯的變化。

同樣，采取設(shè)計(jì)對(duì)照實(shí)驗(yàn)的方法對(duì)NADP+濃度(0.1 mmol/L、0.3 mmol/L、0.5 mmol/L) 以及金橙Ⅰ濃度(0.15 mmol/L、0.30 mmol/L、 0.45 mmol/L) 進(jìn)行優(yōu)化。當(dāng)NADP+的濃度為 0.5 mmol/L時(shí)，反應(yīng)體系顏色會(huì)在2 min之內(nèi)很快消失，當(dāng)NADP+的濃度降低至0.3 mmol/L甚至0.1 mmol/L時(shí)，反應(yīng)需要6 h甚至更長(zhǎng)的時(shí)間才實(shí)現(xiàn)顏色的褪去。當(dāng)金橙Ⅰ的濃度為 0.15 mmol/L時(shí)，反應(yīng)體系會(huì)在2 min之內(nèi)很快消失，當(dāng)金橙Ⅰ的濃度增加到0.30 mmol/L甚至0.45 mmol/L時(shí)，反應(yīng)需要更長(zhǎng)的時(shí)間才能實(shí)現(xiàn)顏色的明顯消失。

表2 不同的反應(yīng)時(shí)間對(duì)篩選結(jié)果的影響

All of the reactions were detected at 482 nm after 2 min.

圖4 不同的反應(yīng)時(shí)間對(duì)篩選結(jié)果的影響

AzoB可以利用羰基還原酶生成的NADPH作為電子供體還原偶氮染料，同時(shí)生成NADP+，和羰基還原酶形成循環(huán)反應(yīng)，并且AzoB可以利用的NADPH濃度可以低至1 μmol/L[18]，理論上不需要額外添加NADP+，但如表1所示，金橙Ⅰ的存在抑制了羰基還原酶SSCR M242F/ Q245T的活力，同時(shí)也影響了該循環(huán)反應(yīng)的正常進(jìn)行。同時(shí)，隨著金橙Ⅰ的濃度增加，反應(yīng)體系顏色會(huì)變深，顏色反應(yīng)會(huì)更明顯；但隨著金橙Ⅰ濃度的增加，金橙Ⅰ對(duì)羰基還原酶活力的影響會(huì)增加，同時(shí)降解金橙Ⅰ所需要的NADPH的量也會(huì)增大。在本研究中，在加入金橙Ⅰ和AzoB之前給予2 min的反應(yīng)時(shí)間，如果羰基還原酶的活力明顯或提高羰基還原酶的用量，反應(yīng)所積累的NADPH量足夠降解0.15 mmol/L的金橙Ⅰ。另外，由于羰基還原酶底物是過(guò)量的，5.0 mmol/L的底物濃度也較為合適。

2.4 羰基還原酶的活性篩選

按照上文所述的方法，設(shè)計(jì)篩選實(shí)驗(yàn)，選擇5種底物，對(duì)16種羰基還原酶的活性及立體選擇性進(jìn)行篩選并對(duì)該方法的可行性進(jìn)行驗(yàn)證。所有的反應(yīng)體系均在96孔中進(jìn)行，篩選結(jié)果如圖5所示。

圖5 利用AzoB和OrangeⅠ進(jìn)行的篩選實(shí)驗(yàn)

所選羰基還原酶對(duì)(-)-薄荷醇都沒(méi)有表現(xiàn)活力；共有9種羰基還原酶對(duì)(,)-3-甲基環(huán)己醇表現(xiàn)出明顯活力，包括SSCR、SSCR Q245H、SSCR Q245L、SSCR N207L、SSCR M242C、SSCR M242L/Q245T、SSCR M242C/Q245L、SSCR M242F/Q245T以及Ymr226c；檢測(cè)結(jié)果和相應(yīng)酮底物還原的氣相色譜檢測(cè)結(jié)果一致 (表3)，并且沒(méi)有假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)。但是，陰性結(jié)果中有錯(cuò)誤發(fā)生。例如，SSCR N207Q、Gre2的GC結(jié)果都顯示有活性，而通過(guò)本方法卻沒(méi)有檢測(cè)到活性。原因推測(cè)為SSCR N207Q和Gre2的活力較低 (無(wú)法用NADPH在340 nm波長(zhǎng)下光吸收檢測(cè)酶活) 。另外還有其他的3種底物也用于了本實(shí)驗(yàn)的篩選，其中只有CMCR對(duì)它們表現(xiàn)出了活性，其他羰基還原酶由于酶活力較低，該方法沒(méi)有檢測(cè)出，但是建立羰基還原酶的還原反應(yīng)，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，可以檢測(cè)出相應(yīng)的產(chǎn)物。

由于偶氮染料對(duì)羰基還原酶催化反應(yīng)的抑制作用，導(dǎo)致本方法對(duì)一些活性較低的羰基還原酶不能檢測(cè)到活性，降低了其靈敏度。因而，我們對(duì)其他的偶氮染料如金橙Ⅱ、甲基紅、莧菜紅、麗春紅S也同樣進(jìn)行了研究，利用糞腸球菌中的偶氮還原酶AzoA對(duì)這些偶氮染料進(jìn)行還原。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，金橙Ⅱ、莧菜紅以及麗春紅S都不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)所用的羰基還原酶產(chǎn)生抑制作用。然而，AzoA盡管可以利用NADPH，但偏好NADH[17]，當(dāng)用在此方法時(shí)，需要更長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間 (8 h以上) 才能實(shí)現(xiàn)對(duì)偶氮染料的降解，其檢測(cè)結(jié)果和GC結(jié)果相符 (表4)。

2.5 羰基還原酶的立體選擇性篩選

按照上述的方法，驗(yàn)證CMCR對(duì)()-1-苯基-1,2-乙二醇和()-1-苯基-1,2-乙二醇的立體選擇性，結(jié)果如圖6A所示，()-1-苯基-1,2-乙二醇的顏色明顯褪去，而()-1-苯基-1,2-乙二醇則沒(méi)有顏色變化。HPLC的檢測(cè)結(jié)果表明，CMCR還原a-羥基苯乙酮產(chǎn)生()-1-苯基-1,2-乙二醇，本結(jié)果與之相符，表明該方法同樣可以應(yīng)用于立體選擇性的篩選。1-苯基-1,2-乙二醇的消旋體及羰基還原酶CMCR還原a-羥基苯乙酮產(chǎn)物的HPLC結(jié)果見(jiàn)圖6B和6C。

表3 氣相色譜測(cè)定羰基還原酶的活性及立體選 擇性

表4 利用AzoA和莧菜紅進(jìn)行的活性與對(duì)映性篩選

+: had the activity; -: no activity.

圖6 CMCR對(duì)(R)-1-苯基-1,2-乙二醇和(S)-1-苯基-1,2-乙二醇的活性及對(duì)映體選擇性篩選實(shí)驗(yàn)

3 結(jié)論

在本研究中，利用偶氮染料金橙Ⅰ、偶氮還原酶AzoB與羰基還原酶及其相應(yīng)的底物耦合，基于偶氮染料還原的顏色變化，提出并建立了一種新的羰基還原酶篩選方法，并對(duì)該方法進(jìn)行了驗(yàn)證。這種新的篩選方法快速、有效，篩選結(jié)果直觀，當(dāng)所篩選的羰基還原酶對(duì)特定底物有活性時(shí)，會(huì)產(chǎn)生明顯的顏色變化，如果所用的羰基還原酶底物為手性醇，能初步實(shí)現(xiàn)快速的手性篩選，因而該方法在一定程度上可以代替HPLC和GC來(lái)完成大規(guī)模篩選工作。利用偶氮還原酶AzoA與其他偶氮染料對(duì)NADH依賴的羰基還原酶的高通量篩選正在進(jìn)行中。相信未來(lái)會(huì)發(fā)現(xiàn)對(duì)羰基還原酶沒(méi)有抑制作用的偶氮染料及相應(yīng)的NAD(P)H傾向型偶氮還原酶，將提高本方法的靈敏度，使其完善。

致謝：感謝National Center for Toxicological Research, Food and Drug Administration (美國(guó)) 的Dr. Huizhong Chen無(wú)私饋贈(zèng)A和B基因。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

High throughput screening of active and stereoselective carbonyl reductases

Hang Zhang1, Xi Chen2, Jinhui Feng2, Jinku Bao1, Qiaqing Wu2, and Dunming Zhu2

1,,,,610064,,2,,,,300308,

In this study, a fast carbonyl reductases colorimetric screening method for discovering stereoselective carbonyl reductases was established by combining the reverse alcohol oxidation with the azoreductase-catalyzed reduction of azo dye. When azo dye (OrangeⅠ, 4-(4-hydroxy-1-naphthylazo) benzenesulfonic acid) and azoreductase (AzoB) were added into the reaction system of alcohol oxidation catalyzed by carbonyl reductase, the produced NAD(P)H served as electron donor for the azoreductase to reduce the azo dye, resulting the color fade. Hence, the carbonyl reductases can be screened by the obvious color change. When chiral alcohol was used as the substrate, the activity and stereoselectivity of carbonyl reductases can be screened at the same time.

chiral alcohol, carbonyl reductase, azoreductase, azo dye, screening method

May 4, 2014; Accepted: May 30, 2014

Jinhui Feng. Tel: +86-22-24828734; E-mail: feng_jh@tib.cas.cn Jinku Bao. Tel:+86-28-85415171; E-mail: baojinku@scu.edu.cn

Supported by:Key Research Program of the Chinese Academy of Sciences (No. KSEZ-EW-Z-021-2), National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2011CB710800).

中國(guó)科學(xué)院重點(diǎn)部署項(xiàng)目 (No. KSEZ-EW-Z-021-2)，國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃) (No. 2011CB710800) 資助。