王少毅，周曉聰

河北大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院

SD大鼠體外神經(jīng)元培養(yǎng)技術(shù)的簡(jiǎn)介

王少毅，周曉聰

河北大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院

目的：尋求一種簡(jiǎn)單、廉價(jià)的原代SD大鼠神經(jīng)元原代培養(yǎng)方法。方法：采用胰蛋白酶消化法制備游離神經(jīng)細(xì)胞懸液,進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果：通過(guò)多次探索、觀察、成功的進(jìn)行了原代神經(jīng)元原代培養(yǎng)。結(jié)論：本方法適合一般實(shí)驗(yàn)室開展SD新生大鼠神經(jīng)元細(xì)胞的培養(yǎng)。

1、材料和方法

1.1 材料

新生SD大鼠（24h以內(nèi)）；含10%FBS（胚牛血清）的DMEM培養(yǎng)液：0.25%胰蛋白酶；L-多聚賴氨酸；含2%B27（含青鏈霉素）的neurolbasal培養(yǎng)液；阿糖胞苷濃度為10uM的neurolbasal培養(yǎng)液；75%酒精；D-PBS平衡液；無(wú)菌操作器械一套（中號(hào)鑷子、大剪刀、一把眼科剪、一把小彎鑷子、兩把小鑷子、一把止血鉗）、十只5ml離心管、2只50ml離心管、8板細(xì)胞培養(yǎng)板（每板6孔）、12塊蓋玻片、圓形小培養(yǎng)皿、胰蛋白酶濾器、200目細(xì)胞濾器、2只5ml注射器、一只移液管、2把移液槍（一把200ul的，另一把1000ul）、污物缸、小燒杯、無(wú)菌工作臺(tái)、水浴箱、細(xì)胞培養(yǎng)箱、細(xì)胞計(jì)數(shù)板、光學(xué)顯微鏡、泡沫浮板、冰袋。

1.2 神經(jīng)元細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法

1.2.1 取材

取新生24h內(nèi)的SD大鼠（10只），酒精消毒后，斷頭處死，在超級(jí)工作臺(tái)中中暴露大腦，剝離腦膜，去除血管，取下0.5mm×1mm× 2mm的大腦皮質(zhì)組織，置入冰袋上裝有DMEM的小培養(yǎng)皿蓋中，用小彎鑷輕柔搗碎組織，成粥狀。

1.2.2 細(xì)胞分離與培養(yǎng)

將搗碎的組織放入準(zhǔn)備好的胰酶消化管中（10管，每管中約5ml胰酶），蓋上蓋子，37℃溫水浴15分鐘（每5分鐘翻轉(zhuǎn)一次），使之成云霧狀。用一次性無(wú)菌塑料吸管吸出消化的組織，放入15mlDMEM培養(yǎng)液中，終止消化，然后用另一支無(wú)菌塑料吸管輕柔吹打細(xì)胞，大約20次。用5ml注射器吸出組織，經(jīng)帶有篩網(wǎng)的無(wú)菌濾器，注入無(wú)菌的離心管中，待用。用200ul的移液槍，取一滴細(xì)胞，置于細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，計(jì)數(shù)細(xì)胞。

1.2.3 接種細(xì)胞與細(xì)胞純化

將細(xì)胞懸液按每孔1-3毫升移入細(xì)胞培養(yǎng)板中，以大約每孔（120-150）×104個(gè)細(xì)胞的密度種細(xì)胞。接種細(xì)胞后12h更換培養(yǎng)液，neurolbasal+B27（含青鏈霉素）培養(yǎng)液1毫升。之后于接種細(xì)胞后24h加入含阿糖胞苷的neurolbasal培養(yǎng)液1ml。加入阿糖胞苷后，每48h用neurolbasal+B27（含青鏈霉素）的培養(yǎng)液半量更換培養(yǎng)基。

1.3 、形態(tài)學(xué)觀察

與每天固定時(shí)間，將培養(yǎng)的神經(jīng)元置于倒置的顯微鏡下進(jìn)行觀察，注意神經(jīng)元的生長(zhǎng)狀況。

1.4 、MTT法測(cè)定細(xì)胞的存活率

以MTT法測(cè)定細(xì)胞的存活率,細(xì)胞的存活率以正常對(duì)照組OD值均數(shù)為100%,用公式進(jìn)行計(jì)算：細(xì)胞存活率(%)=各孔OD值/正常OD值均數(shù)×100。

1.5 、免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定

1.5.1 、取片

神經(jīng)元培養(yǎng)10d后，棄去培養(yǎng)液，冷4%甲醛1ml固定15min，之后用PBS平衡鹽溶液沖洗3遍，取出玻片，晾干后，-20度冷凍備用。

1.5.2 、神經(jīng)元免疫化學(xué)染色步驟

將冷凍的玻片取出，用樹膠粘于較大的載玻片上，置于3-8度冷藏15min。之后PBS平衡鹽溶液浸泡10min。浸泡完后用PBS液沖洗3遍，吸水紙擦干水份。TritonX-100，加入目標(biāo)區(qū)域，用于提取膜蛋白，驅(qū)除非離子性污垢。37℃潮濕環(huán)境下，靜置15min。PBS液沖洗玻片，再在PBS液中浸泡5min，吸水紙吸干水分。向目標(biāo)區(qū)域加入兔抗鼠的NSE多克隆抗體（一抗，1：100）。37℃，潮濕環(huán)境下，靜置1h。PBS沖洗兩遍，浸泡1min，加入人抗兔NSE多克隆抗體（二抗）。37攝氏度，潮濕環(huán)境下靜置20min。用PBS沖洗，加入抗二抗，37℃，潮濕環(huán)境下，靜置30min。PBS沖洗，向目標(biāo)區(qū)域加入DAB顯色劑，靜置1min后，清水沖洗。HE染色。中性樹膠封片。顯微鏡下觀察。

2、結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)神經(jīng)元的一般觀察及鑒定

神經(jīng)元細(xì)胞接剛接種于培養(yǎng)基上時(shí)，體積小，透亮，單個(gè)均勻分布，未見(jiàn)突起，半懸浮于培養(yǎng)液中。接種6h后有少量細(xì)胞開始貼壁,剛貼壁的細(xì)胞呈圓形、胞體亮部分呈出芽狀;培養(yǎng)24h各孔細(xì)胞完成貼壁且大部分細(xì)胞伸出三四個(gè)突起,長(zhǎng)度為10～30μm不等,最長(zhǎng)者可達(dá)50μm以上,其中有些細(xì)胞發(fā)生再聚合現(xiàn)象;培養(yǎng)至3d時(shí),神經(jīng)元突起進(jìn)一步增多并延長(zhǎng),形成稀疏的網(wǎng)絡(luò),培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞以多個(gè)突起的錐體細(xì)胞為主,胞體呈三角形或橢圓形,體積較大,長(zhǎng)徑約為8～12μm。其中也有部分2個(gè)突起的雙極神經(jīng)元,胞體呈橢圓形,長(zhǎng)徑為6～8μm。胞體亮、透光性強(qiáng),周邊有光暈,胞漿豐富,核大,核仁隱約可見(jiàn),突起明顯增長(zhǎng)。培養(yǎng)至10d時(shí)，可見(jiàn)神經(jīng)元其胞體較非神經(jīng)元胞體小呈錐體形、卵圓形或梭形,胞體周圍光暈明顯;核呈圓形較亮,核仁清晰可見(jiàn);突起細(xì)長(zhǎng),有的相互交織成網(wǎng)。而培養(yǎng)的非神經(jīng)元細(xì)胞胞體較大,多呈條帶狀,突起較粗。神經(jīng)元位于培養(yǎng)細(xì)胞的表層,而非神經(jīng)元大都位于培養(yǎng)細(xì)胞的深層。

2.2 抗有絲分裂劑阿糖胞苷對(duì)神經(jīng)元純度的影響

加入阿糖胞苷作用24 h,雖使神經(jīng)元存活率一度降低,但其抑制膠質(zhì)細(xì)胞增殖的作用非常明顯。加入阿糖胞苷可使神經(jīng)元純度得到明顯的提高,提高度可達(dá)10%到20%左右。

2.3 鑒定

神經(jīng)元特異標(biāo)記NSE免疫熒光檢測(cè)陽(yáng)性。

3、結(jié)論

采用0.25%胰蛋白酶消化進(jìn)行培養(yǎng)神經(jīng)元的分離,以neurolbasal培養(yǎng)基作為培養(yǎng)基質(zhì)，并在培養(yǎng)第1d，加入神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑阿糖胞苷，于培養(yǎng)10d后可以收獲細(xì)胞存活率35%，神經(jīng)元純度85%的神經(jīng)元細(xì)胞。希望此方法可以為進(jìn)行有關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)問(wèn)題研究的學(xué)者，提供幫助。