張歡歡，韓瑨，游春蘋，劉振民，郭本恒，吳正鈞

(1.乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 光明乳業(yè)股份有限公司，上海 200436;2.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306)

糖尿病是21 世紀(jì)主要的公共健康問題之一，2型糖尿病，又稱非胰島素依賴型糖尿病，占糖尿病總數(shù)的85%以上，主要特征為胰島素抵抗，機(jī)體對(duì)胰島素敏感性降低，患者體內(nèi)的胰島素相對(duì)缺乏［1］。2 型糖尿病可選擇α-葡萄糖苷酶抑制劑、胰島素增敏劑、促胰島素分泌劑等多種方式來對(duì)餐后血糖進(jìn)行調(diào)控。α-葡萄糖苷酶抑制劑以其相對(duì)較好的調(diào)控作用，已成為比較成熟的治療糖尿病首選藥物，廣泛應(yīng)用于臨床。其作用機(jī)制為:競(jìng)爭(zhēng)性抑制位于小腸的各種α-葡萄糖苷酶［2-3］。

天然來源的α-葡萄糖苷酶抑制劑主要來自動(dòng)植物、微生物。與動(dòng)植物來源相比，微生物來源的α-葡萄糖苷酶抑制劑報(bào)道相對(duì)較少。自然界中的微生物資源豐富，目前臨床使用的3 種葡萄糖苷酶抑制劑:阿卡波糖、米格列醇及伏格列波糖都與微生物有關(guān)［4-5］。目前乳酸菌防治糖尿病的功能已受到高度重視，乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室韓瑨等研究表明，植物乳桿菌ST-III 發(fā)酵大豆豆?jié){發(fā)酵液具有顯著的α-葡萄糖苷酶抑制作用［6］，但是沒有對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制劑進(jìn)行進(jìn)一步的研究及其分離純化。

色譜法是一種常用的物質(zhì)分離和分析方法，其基本原理是利用混合物中各組分在同一基質(zhì)上的吸附或溶解性能的不同，或和其它親和作用性能的差異，使混合物的溶液流經(jīng)該種物質(zhì)，進(jìn)行反復(fù)的吸附或分配等作用，從而將各組分分開。本研究采用薄層色譜法、硅膠柱色譜法、高效液相色譜法對(duì)植物乳桿菌ST-III 發(fā)酵豆?jié){中α-葡萄糖苷酶抑制劑進(jìn)行分離提純。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌ST-III(L.plantarum CGMCC0847)，在MRS 瓊脂上傳代培養(yǎng)，采用添加15%(v/v)甘油的MRS 肉湯于－ 80 ℃保存;MRS 培養(yǎng)基;大豆(Glycine max Merrill)，從本地市場(chǎng)采購;α-葡萄糖苷酶(E.C 3.2.1.20)、pNPG(4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷)、阿卡波糖，均購于美國(guó)Sigma 公司;乙酸乙酯、正己烷、甲醇均為分析純;硅膠預(yù)制板(H 型，10 cm×20 cm);硅膠，200 ～300 目。

J-30I 高速冷凍離心機(jī);PHS-25 型pH 計(jì);HD-3型紫外檢測(cè)儀;Laborota4000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 α-葡萄糖苷酶抑制劑體外測(cè)定模型的建立

將Pierre C 等［7］使用的以PNPG 為底物的α-葡萄糖苷酶抑制劑體外篩選模型加以改良，主要步驟如下:取100 μL 待測(cè)樣品于1.5 mL EP 管，接著加入50 μL α-葡萄糖糖苷酶(100 mU/mL)，混勻，37 ℃溫育15 min，然后加入80 μL PNPG(2 mmol/L)，混勻，37 ℃反應(yīng)15 min，最后加入80 μL(0.2 mol/L)Na2CO3終 止 反 應(yīng)，再 離 心 2 min (4 ℃、10 000 r/min)，取200 μL 上清液于96 孔微孔板，在405 nm 波長(zhǎng)下用Spectra Max M5 多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices 公司)測(cè)定吸光度值。

平行實(shí)驗(yàn)3 次，取平均值。代入以下公式計(jì)算α-葡萄糖苷酶抑制劑抑制率。同時(shí)以阿卡波糖作為陽性對(duì)照進(jìn)行模型的驗(yàn)證。

陰性對(duì)照組為0.1 mol/L、pH=6.8 的磷酸鹽緩沖液(PBS)替代待測(cè)樣品;陰性空白組為PBS 替代陰性對(duì)照組中的α-葡萄糖苷酶;樣品空白組為PBS替代樣品組中的α-葡萄糖苷酶。

1.2.2 α-葡萄糖苷酶抑制劑粗提液的制備 發(fā)酵樣品的制備:將植物乳桿菌ST-III 接入到固形物含量5%(w/w)的豆?jié){中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h 后取出，發(fā)酵豆?jié){→沸水浴10 min →離心(4 ℃，10 000 r/min，15 min)→上清液經(jīng)乙酸乙酯萃取→取酯相并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮直至蒸干，之后加一定量的乙酸乙酯配成質(zhì)量濃度為40 mg/mL 的α-葡萄糖苷酶抑制劑粗提液，以備后續(xù)分離研究。

1.2.3 豆?jié){對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用研究 將固形物含量5%(w/w)的豆?jié){37 ℃靜置24 h 后取出，豆?jié){→沸水浴 10 min →離心(4 ℃，10 000 r/min，15 min)→取上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至質(zhì)量不再減少→加蒸餾水配成質(zhì)量濃度為50 mg/mL 的溶液，作為溶液S1。

將植物乳桿菌ST-III 接入到固形物含量5%(w/w)的豆?jié){中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h 后取出，發(fā)酵豆?jié){→沸水浴10 min→離心(4 ℃，10 000 r/min，15 min)→取上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至質(zhì)量不再減少→加蒸餾水配成質(zhì)量濃度為50 mg/mL 的溶液，作為溶液S2。

分別將溶液S1 和S2 調(diào)pH 至6.8 后，測(cè)α-葡萄糖苷酶抑制率。

1.2.4 薄層層析(TLC)分析 采用H 型硅膠預(yù)制板(10 cm×20 cm)，對(duì)上一步制備的粗提液用不同的展開劑組合進(jìn)行薄層層析，反復(fù)實(shí)驗(yàn)，碘缸顯色，找出最優(yōu)分離時(shí)的展開劑組合。

1.2.5 硅膠柱分離 稱取硅膠200 g 溶于適量的乙酸乙酯-正己烷(2∶3，v/v)混合體系中，制成硅膠勻漿。將勻漿慢慢倒入玻璃柱(45 mm ×300 mm)中裝柱。裝好的硅膠柱用乙酸乙酯-正己烷(2 ∶3，v/v)混合體系進(jìn)行平衡，流速控制在1 mL/min，平衡一個(gè)柱體積后干法上樣:取濃度為40 mg/mL，1.5 mL α-葡萄糖苷酶抑制劑粗提液于研缽中，加入1.0 g硅膠，充分研磨，至硅膠粉變得干燥均勻后，倒入稱量紙中，然后緩緩均勻倒入硅膠柱上表面，確保樣品加入后硅膠柱上表面平整。上樣后按乙酸乙酯-正己烷(2∶3，v/v)、乙酸乙酯-正己烷(3∶2，v/v)、乙酸乙酯-正己烷(4∶1，v/v)梯度洗脫，每個(gè)梯度洗脫一個(gè)柱體積。樣品洗脫開始后，用自動(dòng)收集器開始收集，每6 min 收集1 管。收集的洗脫液經(jīng)減壓去除有機(jī)溶劑后，每管加0.5 mL 超純水溶解，測(cè)試其對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用。

1.2.6 高效液相色譜檢驗(yàn)樣品純度 將獲得的活性抑制組分用超純水溶解進(jìn)行HPLC 檢測(cè)。

1.2.7 半抑制率測(cè)定 對(duì)分得活性抑制組分樣品進(jìn)行凍干后用超純水配成不同濃度，測(cè)定不同濃度的抑制率，得出半抑制率(IC50)值，并和阿卡波糖比較。

1.2.8 質(zhì)譜檢測(cè) 將分得活性抑制組分樣品采用AB4800MALDI-TOF-TOF 質(zhì)譜儀測(cè)定其分子量。

2 結(jié)果與討論

2.1 豆?jié){對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用研究

溶液S1、S2 的α-葡萄糖苷酶抑制率結(jié)果見表1。

由表1 可知，沒有接入植物乳桿菌ST-III 的豆?jié){經(jīng)過一些處理后的溶液S1 對(duì)α-葡萄糖苷酶沒有明顯的抑制作用，而含有同樣固形物的豆?jié){接入植物乳桿菌ST-III 后經(jīng)過相同處理后的溶液S2 具有顯著的α-葡萄糖苷酶抑制作用，由此可以得知，本研究中要分離的目標(biāo)活性物質(zhì)是植物乳桿菌ST-III在豆?jié){生長(zhǎng)環(huán)境中產(chǎn)生的，并非來自豆?jié){本身。

表1 溶液S1、S2 的α-葡萄糖苷酶抑制率Table 1 The inhibitory effect to alpha-glucosidase of solution S1 and S2

2.2 薄層層析結(jié)果

TLC 結(jié)果顯示，α-葡萄糖苷酶抑制劑粗提液在乙酸乙酯∶正己烷=4∶1 時(shí)，分離效果最好，碘缸顯色結(jié)果見圖1。

圖1 α-葡萄糖苷酶抑制劑粗提物TCL 結(jié)果Fig.1 TCL profile of α-GI crude extract

對(duì)圖1 中1、2、3 所標(biāo)示的3 個(gè)斑點(diǎn)的硅膠在未經(jīng)碘缸顯色時(shí)小心刮下，經(jīng)過甲醇溶解、離心取上清液、蒸干等步驟后，把干物質(zhì)用超純水溶解配成0.5 mg/mL溶液，調(diào)pH 至6.8 后進(jìn)行抑制率測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 TLC 不同斑點(diǎn)所示物質(zhì)對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率Table 2 The inhibitory effect to alpha-glucosidase of different fractions in corresponding TLC spots

由表2 可知，1 號(hào)和2 號(hào)斑點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的物質(zhì)即為分離提純的目標(biāo)物。

2.3 硅膠柱層析結(jié)果

2.3.1 硅膠柱層析后收集的每管樣品抑制率的測(cè)定結(jié)果 樣品經(jīng)硅膠柱層析后，每管洗脫液對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率見圖2。

圖2 α-葡萄糖苷酶抑制劑抽提物硅膠柱層析結(jié)果Fig.2 The eluting profile of the crude alphaglucosidase extract on silica gel column

可以看出34 ～37 管、47 ～52 管兩個(gè)區(qū)域的洗脫物抑制率明顯高于其它管數(shù)的抑制率，將34 ～37管以及47 ～52 管的樣品分別收集、減壓去除有機(jī)溶劑后，凍干，作為組分F1 和組分F2。

2.3.2 HPLC 檢測(cè)結(jié)果 將組分F1 和F2 用超純水溶解后配成0. 5 mg/mL 進(jìn)行HPLC 檢測(cè)，柱溫35.5 ℃;流動(dòng)相為水;凝膠柱為TSK SW2000 凝膠柱;流速1 mL/min;進(jìn)樣量50.0 μL，結(jié)果見圖3、圖4。

圖3 組分F1 經(jīng)HPLC 檢測(cè)結(jié)果Fig.3 HPLC result of F1

圖4 組分F2 經(jīng)HPLC 檢測(cè)結(jié)果Fig.4 HPLC result of F2

可以看出組分F1 和組分F2 都是純度較高的單一組分。

2.3.3 半抑制率測(cè)定結(jié)果 不同濃度的組分F1 和F2 對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用見圖5。

圖5 不同濃度組分F1 和F2 對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.5 The inhibition to α-glucosidase of F1 and F2 in different concentration

由圖5 可知，組分F1 和F2 對(duì)α-葡萄糖苷酶均有較強(qiáng)的抑制作用，并且隨著濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)，說明這兩種組分對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用與它們的濃度之間呈現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。

表3 是組分F1 和F2 半抑制率的濃度(IC50)及其與阿卡波糖半抑制率的濃度(IC50)的比對(duì)，抑制作用越強(qiáng)則其達(dá)到半數(shù)抑制率所需的濃度越低。結(jié)果顯示，組分F1 較F2 有更強(qiáng)的抑制作用。

表3 組分F1 和F2 半抑制率濃度(IC50)及與阿卡波糖半抑制率濃度(IC50)對(duì)比Table 3 The half inhibition concentration (IC50)of F1，F(xiàn)2 and acarbose to alpha-glucosidase

2.3.4 質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果 由圖6 和圖7 可知，組分F1 分子量為271.1，組分F2 分子量為255.1。

圖6 組分F1 質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果Fig.6 Mass spectroscopy result of F1

作為新型抗糖尿病類藥物，α-葡萄糖苷酶抑制劑(α-GI)目前已在臨床上被廣泛應(yīng)用于糖尿病的治療。植物、中草藥是α-葡萄糖苷酶抑制劑優(yōu)良來源［8-9］，但由于其含量低或生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，無法進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)［10］。目前乳酸菌對(duì)人體的免疫調(diào)控、促進(jìn)吸收、疾病預(yù)防［11］等作用已得到廣泛認(rèn)可，部分乳酸菌對(duì)糖尿病的預(yù)防和治療作用在動(dòng)物及人群試驗(yàn)中取得了良好的效果［12］，但關(guān)于其活性成分的研究報(bào)道較少。本研究對(duì)植物乳桿菌ST-III 豆?jié){發(fā)酵液中進(jìn)行了α-GI 的分離純化，為乳酸菌的降血糖作用以及其作為新型α-GI 來源的開發(fā)提供理論依據(jù)。

圖7 組分F2 質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果Fig.7 Mass spectroscopy result of F2

本研究通過TLC 摸索出通過有機(jī)溶劑達(dá)到最佳分離比例，即α-葡萄糖苷酶抑制劑粗提液在乙酸乙酯∶正己烷=4∶1 時(shí)，分離效果最好，之后通過硅膠柱層析得到兩個(gè)具有顯著α-葡萄糖苷酶抑制作用的組分，通過HPLC 檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)為純度較高的單一組分，并通過質(zhì)譜對(duì)這兩種組分的分子量進(jìn)行了測(cè)定，測(cè)得組分F1 分子量為271.1，組分F2 分子量為255.1。有關(guān)α-GI 單一組分的結(jié)構(gòu)還有待通過核磁共振等手段進(jìn)行進(jìn)一步的分析鑒定。此外，本研究?jī)H測(cè)試了組分F1 和F2 對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用，其在體內(nèi)的降血糖活性，還有待通過動(dòng)物模型進(jìn)一步研究其在體內(nèi)對(duì)葡萄糖耐受、餐后血糖波動(dòng)等的影響進(jìn)行評(píng)估，從而為新型降糖藥物或功能性食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

3 結(jié)論

植物乳桿菌ST-III 發(fā)酵豆?jié){是一種優(yōu)良的α-葡萄糖苷酶抑制劑來源，具有潛在的抗高血糖作用。本研究通過硅膠柱層析的方法從植物乳桿菌ST-III發(fā)酵豆?jié){中α-GI 進(jìn)行分離提純，得到兩種純度較高的單一組分，其對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用的IC50分別為0.41 mg/mL(F1)和0.65 mg/mL(F2)，進(jìn)一步通過質(zhì)譜分析，確定了兩種組分的分子量為271.1(F1)和255. 1(F2)，但是其結(jié)構(gòu)還有待進(jìn)一步研究。

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