薛 磊

(貴州省遵義市湄潭縣農(nóng)牧局，貴州湄潭564100)

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犬瘟熱病毒GZ-Z株H基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建

薛 磊

(貴州省遵義市湄潭縣農(nóng)牧局，貴州湄潭564100)

利用實驗室構(gòu)建的含有犬瘟熱病毒H基因的pMD18-H質(zhì)粒，根據(jù)其序列設(shè)計帶有BamHⅠ 和HindⅢ 酶切位點的引物，對H基因ORF進(jìn)行PCR擴增，得到約1 949 bp的片段。將該片段克隆到pMD18-T載體內(nèi)，用BamHⅠ 和HindⅢ 進(jìn)行雙酶切鑒定、質(zhì)粒PCR鑒定，篩選出陽性克隆。將陽性克隆再用BamHⅠ 和HindⅢ 進(jìn)行雙酶切，純化回收CDV H基因ORF片段；將原核表達(dá)載體pET32a(+)用同樣的方法酶切，回收載體片段，并用T4連接酶將以上兩回收片段連接，構(gòu)建原核表達(dá)載體質(zhì)粒pET32-H，后經(jīng)BamHⅠ 和HindⅢ 雙酶切、質(zhì)粒PCR、測序進(jìn)行系列鑒定。結(jié)果表明，pET32-H原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功，其中插入片段大小為1 842 bp，可編碼607個氨基酸殘基。該實驗為下一步H蛋白的原核表達(dá)及單克隆抗體的制備奠定了基礎(chǔ)。

犬瘟熱病毒；原核表達(dá)；PCR；H基因

犬瘟熱(Canine Distemper,CD)是由犬瘟熱病毒(Canine Distemper Virus,CDV)引起的一種高度接觸性、致死性、急性病毒傳染病[1, 2]，是目前威脅養(yǎng)犬業(yè)、毛皮動物飼養(yǎng)和野生動物保護(hù)的主要疫病之一[3]。本病廣泛分布于世界各地，而且容易繼發(fā)其他細(xì)菌、病毒的混合感染和二次感染，死亡率可高達(dá)30%～80%[4]。犬瘟熱的臨床特征為早期表現(xiàn)雙相熱、急性鼻卡他，隨后以支氣管炎、卡他性肺炎、嚴(yán)重的胃腸炎、結(jié)膜炎、角膜炎[5]和神經(jīng)癥狀為特征。少數(shù)病例出現(xiàn)鼻部和腳墊的高度角質(zhì)化。犬瘟熱的臨床癥狀受毒株毒力、環(huán)境、宿主年齡、宿主免疫狀況和感染種類的影響。在所有易感宿主中，呼吸系統(tǒng)、胃腸道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和體表組織是最易感染的部位。

CDV在分類上屬副粘病毒科，麻疹病毒屬[6]。它與麻疹病毒(MV)、牛瘟病毒(RPV)、小反芻獸疫病毒(PPRV)、海豹瘟熱病毒(PDV)、海豚瘟熱病毒(PMV)同屬于副粘病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒屬(Morbillivirus) 的成員[7，8]。CDV為不分節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒，呈圓形或不正形，有時呈長絲狀，直徑100～300 nm不等，大小差異較大。CDV的核衣殼由基因組與蛋白N組成，呈螺旋狀盤曲在病毒粒子的中央，外面裹著1層脂質(zhì)的囊膜，囊膜上密布有纖突[9]。多呈球形或不規(guī)則形，亦有畸形和長絲狀的病毒粒子，粒子中心含有寬徑為15～17 nm的螺旋形核衣殼，由基因組RNA和許多核衣殼蛋白亞單位組成。核衣殼外面包被1層由細(xì)胞膜和脂質(zhì)衍生而來的雙層脂質(zhì)囊膜。膜上排列有由H和F 2種糖蛋白組成的桿狀纖突，該纖突只含血凝素，無神經(jīng)氨酸酶[7]。

CDV的基因組包含15 690個核苷酸，由7個基因組成，從3’端到5’端依次為：3’端前導(dǎo)序列、核衣殼蛋白基因N、磷蛋白基因P、膜蛋白基因M、融合蛋白基因F、血凝素蛋白基因H、大蛋白基因L和5’端前導(dǎo)序列。各基因上有自己的開放性閱讀框架，其中P基因包含2個部分重疊的ORF。其中H蛋白基因由1 944～1 946個核苷酸組成，它的mRNA的5’端有20個核苷酸的非編碼區(qū)， 3’端有100個或更多核苷酸的非編碼區(qū)，在5’端或3’端的非編碼區(qū)序列中沒有發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。CDV H蛋白有廣泛的糖基化位點，糖基化位點末被蛋白酶剪切。在麻疹病毒屬所有結(jié)構(gòu)蛋白中，血凝蛋白(H蛋白)作為宿主免疫系統(tǒng)的目標(biāo)抗原，其基因序列的變異程度是最高的[10]，在免疫壓力作用下，CDV抗原表位可能發(fā)生漂移，尤其是較大的H蛋白極易發(fā)生變異，從而引起CDV毒力變化[11]。H蛋白是病毒侵襲宿主所必需，同時H蛋白上存在許多中和性抗原表位，是誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體的主要抗原之一，在抗CDV免疫中起著重要作用[12]。H蛋白決定CDV宿主的特異性，并協(xié)助F蛋白使CDV以囊膜與宿主細(xì)胞膜發(fā)生融合的方式進(jìn)入宿主細(xì)胞。

CD呈世界性分布，并且能在種間進(jìn)行傳播流行，傳播途徑多元化，實驗證明，傳播的途徑主要是呼吸道，其次是消化道，如通過飛沫、食物或不潔的醫(yī)療衛(wèi)生用具以及眼結(jié)膜、口腔、鼻腔黏膜感染，另外還可以經(jīng)陰道、直腸黏膜感染。CD康復(fù)犬可獲得終身免疫力[13]。目前控制該病主要依賴于接種弱毒疫苗，并取得了顯著的成效，然而隨著使用的廣泛，發(fā)現(xiàn)其存在許多缺陷和缺乏有效的檢測疫苗免疫效果的方法[14,15]。沒有吃初乳或母犬有很少或沒有CDV抗體的少于6周齡的幼犬，對CDV易感，但3周齡之前接種的效果又不好，此時犬的抗體反應(yīng)和細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)還沒有完全徹底地起作用，不能對CDV產(chǎn)生免疫應(yīng)答，直到6周齡免疫系統(tǒng)才健全。

犬瘟熱還沒有可以治愈的藥物，目前靠疫苗尤其是弱毒疫苗來控制本病，但疫苗存在一定的不安全性，同時犬瘟熱病毒自身的基因發(fā)生突變，導(dǎo)致犬瘟熱在各地時有發(fā)生。鑒于此，本實驗根據(jù)實驗室已構(gòu)建并測序的含H基因的質(zhì)粒序列，設(shè)計1對特異性引物，擬擴增CDV H ORF，并構(gòu)建原核表達(dá)載體，為該病及其病原的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

質(zhì)粒：pMD18-H克隆質(zhì)粒由貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院實驗室鑒定保存；克隆載體：pMD18-T Vector(TA連接試劑盒)，購自大連寶生物公司；表達(dá)載體：pET32a(+)由本實驗室保存；菌株：E.coLiDH5α由貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院實驗室保存；BL21(DE3) Competent Cell購自TIANGEN；TaKaRa La PCRTM Kit Ver.2.1(PCR擴增試劑盒)，購自大連寶生物工程有限公司。

2 方法

2.1 H基因的擴增

2.1.1 引物的設(shè)計與合成：根據(jù)實驗室已構(gòu)建并測序的含H基因的質(zhì)粒序列，利用Primer Premier 6.0 軟件設(shè)計1對特異性引物：

CDV-H-ExS: 5’-CgCggATgCTCTCCTACCAAgACAAg-3’

CDV-H-ExAs: 5’-CCCAAgCTTTCAgggATTTgAACggTTACAT-3’

本實驗預(yù)期擴增的基因片段大小為1 949 bp，引物由大連寶生物公司合成。

2.1.2 目的基因的擴增：以實驗室鑒定保存的pMD18-H克隆質(zhì)粒DNA為模板，用上述設(shè)計合成的特異性引物進(jìn)行H基因的ORF擴增，反應(yīng)體系如下：

pMD18-H質(zhì)粒DNA 0.5 μL

CDV-H-ExAs 2.0 μL

CDV-H-ExS 2.0 μL

2×TaqPCR Mastermixture 12.5 μL

ddH2O 8.0 μL

將此反應(yīng)體系按如下反應(yīng)條件進(jìn)行反應(yīng)： 94 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃變性30 s，48 ℃ 復(fù)性1 min， 72 ℃延伸2 min,進(jìn)行35個循環(huán)；最后72 ℃延伸 10 min。

反應(yīng)結(jié)束后取出5 μL擴增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳， 80 V電泳1 h后，于凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。

2.2 H基因的克隆及鑒定

2.2.1 瓊脂糖凝膠電泳：(1)稱取瓊脂糖1 g于200 mL 三角燒瓶中，加入1×TAE溶液100 mL。(2)在微波爐中加熱溶化，完全溶解瓊脂糖，直至無顆粒狀結(jié)晶為止。(3)冷卻至60 ℃左右，加入溴化乙錠10 μL，緩慢倒入膠槽中，盡量不要產(chǎn)生氣泡。(4)室溫靜置30 min，待膠變硬、呈現(xiàn)乳白色且不透明時，除去梳子，取出膠板。(5)將配制好的 5×TAE 緩沖液稀釋后倒入電泳槽。(6)取DL 2 000(Takara)marker 3 μL點樣。(7)取PCR產(chǎn)物5 μL點在膠孔中。(8)將點好樣的膠板放入電泳槽中，加樣部位于負(fù)極，蓋上槽板。(9)選擇80 V電壓進(jìn)行電泳1 h。(10)取出于凝膠成像系統(tǒng)成像觀察電泳結(jié)果，保存照片以備分析結(jié)果。

2.2.2 PCR產(chǎn)物的回收與純化：參照E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit(50)試劑盒進(jìn)行膠回收，具體操作如下：(1)在紫外燈下切出含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面的液體。此時應(yīng)注意盡量切除不含目的DNA部分的凝膠，盡量減小凝膠體積，提高DNA回收率。(2)稱量膠塊重量，計算膠塊體積。計算膠塊體積時，以1 mg=1 μL進(jìn)行計算。(3)加入與回收膠等體積的Binding Buffer(×P2)，與60 ℃水中溶化。(4)將HiBind DNA column 放入2 mL Collection tube中。(5)將(1)中的溶液全部轉(zhuǎn)入上述HiBind DNA column中，室溫10 000 r/min 離心1 min。(6)倒掉液體，加入300 μL Binding Buffer(×P2)，室溫10 000 r/min離心 1 min。(7)倒掉液體，加入SPW 700 μL，室溫10 000 r/min 離心1 min。(8)重復(fù)步驟(5)1次，倒掉液體，以大于13 000 r/min室溫空離心2 min。(9)將HiBind DNA column放入新的1.5 mL Ep管中，在HiBind DNA column中央小心加入Elution Buffer 30 μL，室溫靜置10 min，以大于13 000 r/min室溫空離心2 min。(10)將Ep管中的液體于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 PCR產(chǎn)物與pMD18-T SimpIe vector的連接：將回收純化的PCR產(chǎn)物與pMD18-T Simple vector連接構(gòu)建重組質(zhì)粒,在新的Ep管中依次加入下列成分：

回收的CDV-H 4.5 μL

pMD18-T Vector 0.5 μL

Ligation Solution Ⅰ 5.0 μL

將此反應(yīng)體系16 ℃連接過夜，取出直接轉(zhuǎn)化到E.coLiDH5α感受態(tài)細(xì)胞中。

2.2.4 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞E.coLiDH5α的制備：(1)從37 ℃培養(yǎng)12～16 h的大腸桿菌E.coLiDH5α平板上無菌挑取生長良好的劃線保存的單個菌落接種到10 mL LB肉湯中， 37 ℃， 200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。(2)次日轉(zhuǎn)移2 mL活化后的培養(yǎng)液至裝有50 mL LB 肉湯的100 mL三角瓶中，繼續(xù) 37 ℃振蕩培養(yǎng)2～3 h，使其D600 nm達(dá)到0.4左右時將菌液取出立即冰水浴冷卻10 min。(3)在無菌條件下將此細(xì)菌培養(yǎng)物轉(zhuǎn)至滅菌過的50 mL離心管中。(4) 4 ℃ 3 500 r/min離心10 min以收集細(xì)胞，傾棄上清液并盡可能吸去所有培養(yǎng)液。(5)加入 25 mL 預(yù)冷的新配制的0.1%CaCl2溶液重懸菌體。(6)冰水浴30 min后， 4 ℃ 3 500 r/min離心10 min，棄上清并盡可能吸去所有培養(yǎng)液。(7)再用0.5～1.0 mL預(yù)冷的0.1%CaCl2溶液重懸菌體。(8)置 4 ℃冰箱12～24 h，即可應(yīng)用于轉(zhuǎn)化。新鮮的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞可于 4 ℃儲存24～48 h，但在儲存的最初12～24 h轉(zhuǎn)化效率最高。如1次制備的感受態(tài)不能用完，可凍存保留。其方法為：將感受態(tài)分裝成 100 μL 1份，每份加20%體積的甘油保存液，置-70 ℃冰箱，低溫保存可達(dá)3個月。

2.2.5 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coLiDH5α感受態(tài)細(xì)胞[16]：(1)無菌狀態(tài)下取新鮮感受態(tài)細(xì)胞100 mL，如果使用凍存的感受態(tài)細(xì)胞時，則將其從-70 ℃冰箱取出，握于手中，待其解凍后立即吸取100 mL轉(zhuǎn)移至1.5 mL滅菌Ep管內(nèi)。(2)待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒 1 μL (連接產(chǎn)物10 μL)，加入感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕旋轉(zhuǎn)以混合內(nèi)容物，在冰上放置30 min。(3)將離心管放到42 ℃水浴中熱休克90 s，不要搖動離心管。(4)迅速將離心管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻 1～2 min。(5)加入800 μL無抗生素的LB培養(yǎng)基， 37 ℃溫和振蕩(轉(zhuǎn)速200 r/min)培養(yǎng)45 min。(6)用無菌彎頭玻璃鋪菌器將200 μL菌液涂布于含有氨芐青霉素(終濃100 μg/L)的LB瓊脂培養(yǎng)基平板上， 37 ℃倒置培養(yǎng)16 h。

2.2.6 質(zhì)粒的小量制備(堿裂解法):本實驗用滅菌Tip頭分別挑取培養(yǎng)所見的白色單個菌落6個，記為1#～6#，分別接種于20 mL含AMP 10 μL的LB肉湯的小三角瓶中， 37 ℃水浴振蕩培養(yǎng)10 h，分別取0.5 μL菌液穿刺于2份上述制備的Ep管中，于37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(1份用于測序，另1份用于保存)，余下的菌液用堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA。

具體步驟如下：(1)菌液全部轉(zhuǎn)入50 mL離心管中， 4 000 r/min室溫離心10 min，棄上清。(2)向細(xì)菌沉淀加入100 μL冰水預(yù)冷的溶液Ⅰ[50 mM葡萄糖， 25 mM Tris-HCl(pH 8.0),10 mM [EDTA(pH 8.0)]，于漩渦振蕩器劇烈振蕩，使沉淀迅速充分分散。(3)將分散后的菌液轉(zhuǎn)入EB管中，加入200 μL新配制的溶液 Ⅱ (1%SDS， 0.2 mol/L NaOH)，蓋緊管口，溫和顛倒數(shù)次。(4)加入150 μL用冰水預(yù)冷的溶液Ⅲ(5 mol/L乙酸鉀60 mL,冰乙酸11.5 mL，水 28.5 mL)，蓋緊管口，溫和顛倒數(shù)次至出現(xiàn)白色絮狀沉淀后， 4 ℃ 12 000 r/min 離心10 min。(5)小心轉(zhuǎn)移上清至另一Ep管中，加入等體積的異丙醇，室溫靜置10 min后， 4 ℃ 12 000 r/min離心10 min。(6)棄上清，加入70%乙醇700 μL洗滌DNA沉淀， 4 ℃ 12 000 r/min 離心5 min。(7)棄上清，自然干燥后加入含蒸餾水50～100 μL溶解質(zhì)粒DNA。(8)加入 10 mg/mL的RNaseA 5 μL，置37 ℃恒溫水浴箱消化30～60 min。(9)棄3 μL進(jìn)行電泳，觀察結(jié)果。余下的DNA則保存于-20 ℃冰箱中備用。

將1#～6#質(zhì)粒DNA凝膠于80 V電泳50 min，初步鑒定為陽性的質(zhì)粒DNA作進(jìn)一步的鑒定，即酶切和PCR鑒定。

2.2.7 重組克隆載體陽性菌株的鑒定：選取6#陽性克隆質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切、PCR擴增和測序方法進(jìn)行鑒定。

(1)質(zhì)粒PCR鑒定：

6#質(zhì)粒DNA 2.0 μL

CDV-H-ExAs 2.0 μL

CDV-H-ExS 2.0 μL

2×TaqPCR Mastermix 12.5 μL

ddH2O 6.5 μL

將此反應(yīng)體系按如下反應(yīng)條件進(jìn)行反應(yīng)：95 ℃預(yù)變性5 min； 95 ℃變性30 s， 65 ℃ 復(fù)性30 s,72 ℃延伸90 s,進(jìn)行35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

(2)重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定：根據(jù)設(shè)計的上下游引物所帶的酶切位點，選用BamHⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切。反應(yīng)體系為20 μL體系，即：

重組質(zhì)粒 6.0 μL

10×K Buffer 2.0 μL

BamHⅠ 1.0 μL

HindⅢ 1.0 μL

ddH2O 10.0 μL

離心混合均勻，置37 ℃水浴消化2 h，1%瓊脂糖凝膠電泳觀察酶切結(jié)果。將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒記為pMD18-T-H。

2.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

2.3.1 目的基因與載體的連接：分別將pMD18-T-H和pET32a(+)空載體用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，用凝膠回收試劑盒回收目的片段。

pMD18-T-H雙酶切體系：

重組質(zhì)粒DNA 35.0 μL

10×K Buffer 5.0 μL

BamHⅠ 1.5 μL

HindⅢ 1.5 μL

ddH2O 7.0 μL

pET32a(+)空載體雙酶切體系：

pET32a(+)空載體 25.0 μL

10×K Buffer 5.0 μL

BamHⅠ 1.5 μL

HindⅢ 1.5 μL

ddH2O 17.0 μL

將上述酶切目的基因片段與表達(dá)載體進(jìn)行連接。

連接體系：

10×T4 DNA Ligase Buffer 1.5 μL

酶切后的載體 2.0 μL

酶切后的目的基因 7.0 μL

T4 DNA Ligase 0.5 μL

ddH2O 4.0 μL

總體積15 μL， 16 ℃連接過夜。

2.3.2 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化：將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到 BL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐青霉素100 μg/μL的LB平板上， 37 ℃培養(yǎng)20 h。挑取抗性菌落，以PCR和酶切方法鑒定陽性克隆。

2.3.3 陽性克隆的鑒定：主要按以下2種方法進(jìn)行：

(1)質(zhì)粒PCR鑒定：

質(zhì)粒DNA 1.0 μL

CDV-H-ExAs 2.0 μL

CDV-H-ExS 2.0 μL

2×TaqPCR Mastermix 12.5 μL

ddH2O 7.5 μL

(2)雙酶切方法鑒定：將PCR陽性菌液，提取重組質(zhì)粒DNA，根據(jù)設(shè)計的上下游引物所帶的酶切位點及表達(dá)載體上的酶切位點的位置，選擇限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ進(jìn)行酶切。

所加樣品如下：

重組質(zhì)粒 6.0 μL

10×K Buffer 2.0 μL

BamHⅠ 1.0 μL

HindⅢ 1.0 μL

ddH2O 10.0 μL

總反應(yīng)體系為20 μL

以上各組分混勻，短暫離心后，于37 ℃溫浴2 h，酶切產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。

2.3.4 陽性克隆的序列測定：將經(jīng)2.3.3鑒定陽性的質(zhì)粒，穿刺后送大連寶生物工程有限公司測序。

3 結(jié)果

3.1 H基因擴增結(jié)果 以本實驗室鑒定保存的pMD18-H克隆質(zhì)粒為模板擴增H基因，所獲得PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，得大小約1 900 bp條帶，與預(yù)期大小相符。見圖1。

1:目的片段； M:DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000 圖1 CDV GZ-Z株H基因的RT-PCR擴增結(jié)果

3.2 重組克隆載體的鑒定結(jié)果

3.2.1 PCR方法鑒定結(jié)果：將H基因的PCR產(chǎn)物與pMD 18-T載體連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-H，再轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取6個白色單個菌落接種于LB肉湯中培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒DNA，取2 μL進(jìn)行電泳,初步鑒定4#、 5#和6#為陽性。見圖2。

M1：DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000； M2：λ-EcoT14 Marker；1: 4#質(zhì)粒PCR產(chǎn)物； 2: 5#質(zhì)粒PCR產(chǎn)物； 3: 6#質(zhì)粒PCR產(chǎn)物圖2 4#、 5#、 6#重組質(zhì)粒的PCR鑒定結(jié)果

3.2.2 雙酶切方法鑒定結(jié)果：選取6#重組質(zhì)粒用BamHⅠ和HindⅢ酶切鑒定，出現(xiàn)與預(yù)期結(jié)果相符的電泳帶，表明重組質(zhì)粒有外源基因片段的插入。并以6#重組質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)并電泳觀察，確定6#重組質(zhì)粒為陽性克隆質(zhì)粒。見圖3。

M:λ-EcoT14 Marker；1:pET32a(+)雙酶切； 2： 6#重組質(zhì)粒雙酶切 圖3 6#重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果

3.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定結(jié)果

3.3.1 PCR方法鑒定結(jié)果：將重組質(zhì)粒pET32-H轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,涂布于含氨芐青霉素培養(yǎng)基上經(jīng)篩選后。挑取抗性菌落進(jìn)行PCR，PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳膠上呈單一條帶。見圖4。

3.3.2 酶切方法鑒定結(jié)果：選取1個PCR陽性重組子，提取質(zhì)粒用BamHⅠ和HindⅢ 酶切鑒定，出現(xiàn)與預(yù)期結(jié)果相符的電泳帶，表明重組質(zhì)粒有外源基因片段的插入。見圖5。

1:表達(dá)質(zhì)粒PCR； M:λ-EcoT14 Marker 圖4 PCR鑒定結(jié)果

3.3.3 測序鑒定結(jié)果：H基因重組質(zhì)粒經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、質(zhì)粒PCR及酶切鑒定為陽性后，穿刺保存2管，取其中1管送至大連寶生物公司測序，本實驗選6#重組質(zhì)粒進(jìn)行測序，其中H基因ORF全長 1 842 bp，可編碼607個氨基酸。具體序列長如下：

1:重組質(zhì)粒雙酶切；M:λ-EcoT14 Marker 圖5 重組質(zhì)粒雙酶切的鑒定結(jié)果

4 討論

4.1 犬瘟熱的診斷方法 犬瘟熱臨床癥狀多樣，主要表現(xiàn)為雙相體溫升高，急性鼻卡他和隨后的支氣管炎、卡他性肺炎、嚴(yán)重胃腸炎和神經(jīng)癥狀等，而且容易繼發(fā)其他細(xì)菌、病毒的混合感染和二次感染，靠傳統(tǒng)的臨床癥狀和流行病學(xué)資料只能作出初步診斷，要想準(zhǔn)確快速地診斷犬瘟熱較為困難，因此必須將傳統(tǒng)方法與實驗室診斷方法結(jié)合起來。目前，用于犬瘟熱診斷的實驗室方法有病原學(xué)檢查、血清學(xué)檢查、包涵體檢查等。隨著分子生物學(xué)研究的不斷發(fā)展，分子生物學(xué)診斷技術(shù)，如核酸雜交技術(shù)和PCR技術(shù)，以敏感性高、特異性強而廣泛應(yīng)用于實驗室和臨床樣品中病毒的檢測。喬軍和李金中等[17～19]分別報道了犬瘟熱病毒RT-PCR診斷方法。孟慶齡等[20]用CDV犬冠狀病毒(CCV)特異性引物對同一樣品中CDV和CCV RNA模板進(jìn)行聯(lián)合RT-PCR擴增并對擴增條件進(jìn)行了優(yōu)化。PCR檢測DNA的敏感性可以檢測DNA的濃度來表示，而檢測RNA的敏感性很難找到一個客觀的指標(biāo)。首先是不同組織或同一組織的不同時期特異性RNA的濃度不同；其次特異性RNA在細(xì)胞總RNA中的含量較低，而且還受RNA分離率和反轉(zhuǎn)錄率的影響；再者還受到所擴增片段在病毒復(fù)制過程中拷貝數(shù)的影響。用于診斷犬瘟熱選擇擴增片段以300～500 bp為宜?，F(xiàn)在人們用分子生物技術(shù)對CDV 的檢測進(jìn)行了很多研究，其中PCR 技術(shù)尤以快速、靈敏、特異成為研究的重點。PCR技術(shù)以其敏感性高，特異性強而廣泛用于病毒的檢測。李金中[21]報道，根據(jù)Barrett報道的犬瘟熱病毒Onderstepoort弱毒株的融合蛋白基因序列，設(shè)計合成了1對能擴增324 bp基因片斷的引物，將提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以此對引物進(jìn)行PCR擴增，得到了與設(shè)計片斷大小和酶切位點相同的產(chǎn)物，且不擴增犬細(xì)小病毒、犬腺病毒和狂犬病病毒3種病原的核酸，表現(xiàn)了PCR的特異性。同年，李金中[22]又利用套式PCR分段擴增了犬瘟熱病毒融合蛋白的全基因。許莎瓊等[23]報道，套式PCR 比RT-PCR 的檢出率更高、更靈敏,可以作為對死前樣品的有效檢測手段。RT-PCR檢測方法具有較高的靈敏度，與其它方法比較有許多優(yōu)越性，相比病毒分離等方法，對實驗室條件要求沒那么高，而且快速方便，比較適合用于臨床快速診斷，為CD的治療提供可靠的依據(jù)，尤其可以在發(fā)病早期準(zhǔn)確診斷，對及時更好地防治CD有很大的意義。迄今為止，病毒性疾病的診斷主要依賴免疫學(xué)方法、病毒分離培養(yǎng)和核酸分子雜交等，前兩種方法敏感性較差，費時，假陰性較多；而用同位素標(biāo)記的核酸探針作分子雜交則有放射性，操作繁雜，易污染；如用同位素標(biāo)記則一般敏感性較差。PCR是病毒性疾病早期診斷的極有力工具，尤其是對難以進(jìn)行病毒培養(yǎng)和血清學(xué)檢驗的病毒感染的診斷具有實用價值。

4.2 犬瘟熱H蛋白基因 H蛋白基因由1 944～1 946 個核苷酸組成，它的mRNA的5’端有20個核苷酸的非編碼區(qū)， 3’端非編碼區(qū)至少含有100個核苷酸，在5’端或3’端非編碼序列中沒有發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，僅有1個開放性閱讀框架。 H蛋白是誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體的主要蛋白之一，是抗CDV免疫的重要抗原。CDV通過H蛋白吸附到細(xì)胞表面的受體上，因此H蛋白決定CDV宿主的特異性，并協(xié)助F蛋白使CDV以囊膜與宿主細(xì)胞膜發(fā)生融合的方式進(jìn)入宿主細(xì)胞，特別在啟動細(xì)胞融合上起重要作用[24]。由此可見，H蛋白可用于CDV的免疫預(yù)防，且具有一定的診斷價值，其抗體可用于CDV感染的診斷或流行病學(xué)調(diào)查。據(jù)報道，H蛋白基因序列的系統(tǒng)發(fā)生分析表明CDV存在不同的基因型，新分離病毒H蛋白基因的遺傳變異可能是近年來爆發(fā)犬瘟熱的重要原因。本研究成功構(gòu)建了H基因的原核表達(dá)載體，為CDV H基因的進(jìn)一步研究打下了基礎(chǔ)。CDV與MV和RPV的H蛋白的同源性分別為53%和52%，而MV和RPV的同源性為64%，三者總體同源性為36%，H蛋白同源性比較結(jié)果表明CDV從RPV分離出來遠(yuǎn)早于MV。H蛋白是誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體的主要蛋白之一，是抗CDV免疫的很重要的抗原，H蛋白的變異率在麻疹病毒屬所有結(jié)構(gòu)蛋白中是最高的(按變異率從高到低依次為H、N、L、P、F、M蛋白)，抗CDV H蛋白7個抗原決定簇中的6個McAb能中和CDV，阻止CDV的感染，但均不能封閉MV的感染及其血凝活性，而能抑制MV血凝活性并且中和MV的抗MVH蛋白的單抗也不能中和CDV，故H蛋白很可能在提議的新麻疹病毒屬成員分類中起決定作用。

4.3 PCR反應(yīng) PCR的特異性一般取決于引物的特異性、退火溫度、Mg2+濃度等因素，其中退火溫度決定PCR能否高效率地擴增出特異性核酸片段。本試驗以CDV-H-S和CDV-H-As為引物，在48 ℃ 退火進(jìn)行擴增，能高效率獲得特異性核苷酸片段，與理論計算的模板及引物退火溫度基本相符。試驗還對反應(yīng)體系中Mg2+和dNTP濃度進(jìn)行摸索，發(fā)現(xiàn)商品化帶有Mg2+的PCR緩沖液及dNTP均可有效地擴增出目的片段。影響PCR結(jié)果的主要條件因素是MgCl2濃度和循環(huán)溫度。

4.4 質(zhì)粒DNA的提取 質(zhì)粒DNA的提取是基因工程中的基本技術(shù)，目前常用的方法有堿變性法、羥基磷灰石柱層析法、質(zhì)粒DNA釋放法、酸酚法、兩相法以及溴化乙錠-氯化銫密度梯度離心法，其中以堿變性法抽提質(zhì)粒最常見。堿變性法提質(zhì)粒的原理是根據(jù)染色體DNA和質(zhì)粒DNA分子的大小、構(gòu)型及變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離的目的。染色體DNA分子大，為雙螺旋；質(zhì)粒DNA分子小，為超螺旋。在pH 12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，但是螺旋共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的2條互補鏈不完全分離。當(dāng)以pH 4.8的醋酸鈉高鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH到中性時，變性的質(zhì)粒DNA可以恢復(fù)到原來的構(gòu)型并保留在溶液中，而染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。

4.5 H基因的克隆與表達(dá)載體構(gòu)建 本實驗以擴增的H全基因片段為模板，分別設(shè)計引物通過PCR方法擴增部分缺失的H基因片段，將擴增的基因片段克隆到pMD18-T Simple vector中并測序。然后將H基因片段分別克隆入原核表達(dá)載體pET32a(+)，構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET-32a-H，表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)PCR和酶切鑒定。由于CDV是負(fù)鏈RNA病毒，因此在反轉(zhuǎn)錄中必須使用上游引物，而不是下游引物。

5 結(jié)論

5.1 本實驗以實驗室鑒定保存的pMD18-H克隆質(zhì)粒為模板擴增H基因片段，并對其進(jìn)行克隆，成功構(gòu)建了克隆質(zhì)粒pMD18-T-H。

5.2 將擴增得到的基因片段克隆入pET32a(+)載體中，成功構(gòu)建了原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET32a-H。

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Constructing Prokaryotic Expression Vector of Canine Distemper Virus GZ-Z Strain of H Gene

Xue Lei

(Meitan Agricultural Bureau of Guizhou， Meitan Guizhou 564100，China)

In this experimental, previous experiments H construct containing canine distemper virus gene pMD18-T vector, according to pMD18-H sequences withBamHⅠ andHindⅢ restriction sites of the primers, PCR amplification of the H gene, are about 1 949 bp fragments around. The fragment was cloned into pMD18-Tsimple vector withBamHⅠ andHindⅢ restriction enzyme digestion were identified, plasmid PCR identification, and selected positive clones. The positive clones will then beBamHⅠandHindⅢ restriction enzyme digestion,purification of gene fragments recovered CDVH; the original expression vector pET32a(+) digested with the same method,recovery vector fragment with T4 ligase to connect to the recovery of the pET32a(+)vector to construct the prokaryotic expression plasmid pET32-H, after the byBamHⅠ andHindⅢ restriction enzyme digestion, plasmid PCR, sequencing series of identification. The results show that, pET32-H prokaryotic expression plasmid was successfully constructed, which insert size of 1 949 bp, encoding 648 amino acid residues. The experiment for the next H protein expression and lay the foundation for the preparation of monoclonal antibodies

Canine Distemper Virus； Constructing of Expression； PCR； H Gene

2015-08-19

S858.292：Q7

A

1007-1474(2015)06-0016-09