李雪巖，黃 亮，劉 剛，尹洪娜△，孫忠人

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱150001;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱150040)

腦部出血后，腦血腫會(huì)很快形成，由于血腫的不斷刺激，引起出血點(diǎn)周圍壓力增加，導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)代謝障礙。更多的實(shí)驗(yàn)表明:在腦出血的初步階段，血管通透性增強(qiáng)，進(jìn)而引起腦細(xì)胞水腫。為了解決這一難題，導(dǎo)師在臨床中用本法治療腦出血患者，收到較好療效，針刺可以激活受傷的腦細(xì)胞，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)一步的分化自救，并且針刺具有促進(jìn)腦內(nèi)大部分血腫吸收、減輕腦水腫的相關(guān)作用［1］。IL-6 作為一種促炎癥介質(zhì)，伴隨出血參與發(fā)病的全過(guò)程。因此本研究通過(guò)觀察分析百會(huì)透懸厘針刺法對(duì)腦出血急性期模型大鼠腦組織中白細(xì)胞介素-6 表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

Wistar 大鼠(健康、清潔級(jí)、雄性)80 只，每只(280 ±10)g。

1.2 設(shè)備

①數(shù)碼相機(jī)Japan;②自動(dòng)脫水機(jī)XGQ-15/20 泰州世紀(jì)康峰機(jī)電制造有限公司;③微量注射器;④生物組織包埋機(jī)KH-BL，湖北孝感闊海醫(yī)療科技有限公司;⑤307-6 型臺(tái)式牙鉆機(jī)，中國(guó)上海齒科醫(yī)械廠;⑥石蠟切片機(jī)LEICA RM 2135，中國(guó)天津航空機(jī)電公司;⑦電熱恒溫箱;⑧展片機(jī)TEC-2601 型 常州市郝思琳醫(yī)用儀器有限公司;⑨烤片機(jī)PPTHK-21B，上海精密儀器儀表有限公司;○10恒溫低溫冰箱;○1電子天平FA1004N，鄭州時(shí)代儀器設(shè)備有限公司;○12病理圖像分析系統(tǒng)JD801，江蘇省捷達(dá)科技發(fā)展有限公司;○13Motic image 3.2 圖像分析軟件，Motic 公司生產(chǎn)○14立體定位儀ZH-藍(lán)星B 型，中國(guó)安徽儀器廠。

1.3 試劑

①PV-6001 二步法免疫組化檢測(cè)試劑，北京中杉金橋生物有限;②IL-6 免疫組化試劑盒，武漢博士德生物有限公司;③DAB 顯色試劑盒，天津百浩生物科技有限公司;④多聚賴氨酸，廣州市一科生物有限公司;⑤Na2HPO4·12H2O，分析純，北京康普匯維科技有限公司;⑥多聚甲醛，分析純，北京康普匯維科技有限公司;⑦NaCl，分析純，廣州市一科生物有限公司;⑧NaH2PO4·2H2O，分析純 北京康普匯維科技有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

將80 只大鼠，隨機(jī)取8 只為A 組，剩余72 只造模成功后，隨機(jī)分為B 組、C 組、D 組各24 只，分為2 天、7 天、14 天時(shí)間段，每段8 只大鼠。C 組與D 組于造模成功6 h 后，給予相應(yīng)的藥物與針刺治療，然后在對(duì)應(yīng)的2 天、7 天、14 天時(shí)間段停止治療，先給予神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分，之后取材。

A 組(對(duì)照組):不做手術(shù)處理，斷頭取材。

B 組(模型組):造模后2 天、7 天、14 天分別先給予神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分，然后取材。

C 組(西藥組):造模成功6 h 后，給予腦活素稀釋液灌胃(按人:大鼠體重為200∶1 配置)。2 天組連續(xù)灌胃2 天，1 ml tidpo;7 天、14 天同上，于各時(shí)間點(diǎn)后先給予神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分，然后取材。

D 組(針刺組):造模成功6 h 后，針刺病灶側(cè)百會(huì)穴透懸厘穴，取穴方法參照華興邦等制定的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位圖譜》，留針30 min，期間捻轉(zhuǎn)1 次，時(shí)長(zhǎng)控制在1 min，頻率為200 轉(zhuǎn)/min。針刺治療2 天、7 天、14 天后，先給予神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分，然后取材。

1.5 腦出血模型的制備

首先確定尾殼核位置。采用腦內(nèi)靶向注射膠原酶誘發(fā)大鼠ICH 模型。定點(diǎn)定位后，用牙科鉆鉆直徑為1.0 mm 的圓孔，深達(dá)硬腦膜表面，將微量注射器固定于立體定位儀上，沿鉆孔垂直進(jìn)針約6 mm，用自動(dòng)推進(jìn)器按每只0.8 U(0.1 U/μL)膠原酶Ⅶ，以1 μL/min的速度緩慢勻速注入右側(cè)尾狀核，緩慢出針?？p合頭皮，局部皮膚采用碘酚消毒，防止局部感染影響指標(biāo)觀察。

1.6 標(biāo)本取材

麻醉，暴露心臟，左心室插管，抵達(dá)升主動(dòng)脈根部，于右心耳剪0.2 cm 口做出口。將9%氯化鈉200 ml灌注，等到流出的變清澈，換100 ml 的4%多聚甲醛灌注，等到標(biāo)本變硬。斷頭取腦，切片、固定、脫水、浸蠟、包埋制成石蠟切片，用于相關(guān)檢測(cè)。

1.7 行為學(xué)的觀察

成功造模后，做好保溫，即于2 天、7 天、14 天評(píng)價(jià)神經(jīng)功能缺損，根據(jù)Berderson 神經(jīng)功能體征評(píng)分方法:帶好防護(hù)手套，提起鼠的尾巴懸至高于桌面20 ～25 cm 位置，記錄前肢病后體位。正常大鼠雙側(cè)前肢向下伸直，無(wú)神經(jīng)功能缺損-0 分;腦病灶對(duì)側(cè)前肢肩部、腕部、肘部屈曲并內(nèi)收-1 分;1 分體征+推大鼠向癱瘓側(cè)時(shí)阻力下降-2 分;2 分體征+自發(fā)性旋轉(zhuǎn)-3 分。

1.8 HE 染色

石蠟切片;脫蠟相關(guān)水化;經(jīng)過(guò)蘇木精后，流水沖;分化后，流水沖;返蘭后，水洗并浸泡;染色，脫水，經(jīng)透明，后封片。

1.9 IL-6 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

①切片脫蠟;②放在30%H202 溶液中孵育8 min，PBS 洗5 min3 次;③熱抗原修復(fù);④滴加血清封閉液;⑤滴加一抗;⑥滴加化二抗工作液;⑦DAB 顯色;⑧蘇木素復(fù)染，脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀測(cè)。

1.10 IL-6 蛋白表達(dá)

胞漿內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色小顆粒，細(xì)胞核有部分著色。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。各實(shí)驗(yàn)組間的兩兩比較采用t檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為有顯著差異，以P ＜0.01 為有極顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較

針刺和西藥治療均能減少神經(jīng)功能缺損評(píng)分。造模后3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)，D 組與B 組比較有顯著性差異(P ＜0.01)，D 組與C 組比較有明顯差異(P ＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分(±s)

表1 各組大鼠神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分(±s)

注:與B 組比較，* P ＜0.05，△P ＜0.01;與C 組比較，●P ＜0.05。

組別 n 造模后2 天 7 天 14 天B 組造模前24 0 1.51±0.49 2.66±0.45 2.34±0.46 C 組 24 0 1.34±0.47 2.16±0.69 1.65±0.46*D 組 24 0 1.15±0.37 1.34±0.46△● 1.18±0.38△

2.2 腦組織IL-6 陽(yáng)性細(xì)胞平均灰度值比較

大鼠腦組織中IL-6 檢測(cè)的陽(yáng)性細(xì)胞平均灰度值，在造模后3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)，D 組與B 組比較有顯著性差異(P ＜0. 01)，D 組和C 組兩者結(jié)果有差異(P ＜0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠IL-6 陽(yáng)性細(xì)胞平均灰度值比較(±s)

表2 各組大鼠IL-6 陽(yáng)性細(xì)胞平均灰度值比較(±s)

注:與A 組比較，＊P ＜0.05;與B 組比較，* P ＜0.05，△P ＜0.01;與C 組比較，●P ＜0.05。

組別 n 2 天 7 天 14天8 166.50±4.29 166.50±4.29 166.50±4.29 B 組 24 179.57±8.34＊ 178.21±5.78＊ 174.51±3.62＊C 組 24 179.68±2.95 177.86±7.01 171.52±3.71*D 組 24 171.85±4.93 170.21±3.51△● 163.83±4.41 A 組△●

3 討論

近年來(lái)，針灸治療腦出血的研究從臨床應(yīng)用向基礎(chǔ)研究發(fā)展，通過(guò)不同視角、不同的研究手段，揭示針刺治療腦出血的作用機(jī)理。廣大學(xué)者充分運(yùn)用現(xiàn)代理化等不同的方式方法，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛷?fù)制等不同方面對(duì)頭穴針刺治療中風(fēng)的作用機(jī)理予以深入的研究探討。在前人研究的基礎(chǔ)上，筆者再次進(jìn)一步的研究了腦出血與運(yùn)動(dòng)功能及腦水腫與炎性因子的變化關(guān)系，以提供更好的臨床治療方法為更多的病患解決病痛。

腦出血后細(xì)胞因子表達(dá)主要包括NF-κB、IL-6、TNF-α、IL-8 和IL-1 等。IL-6 是一種調(diào)節(jié)炎癥和參與免疫反應(yīng)有關(guān)的重要細(xì)胞成員，它主要由內(nèi)皮cell、成纖維cell、T-cell、單核巨噬cell、B-cell 等在外因作用下產(chǎn)生的糖蛋白，那么IL-6 被認(rèn)為是促炎癥介質(zhì)之一，對(duì)多種細(xì)胞都有一定的影響，其生物學(xué)活性也較廣泛，特別是在腦出血后IL-6 能夠調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中的中性粒細(xì)胞功能，直接參與腦損傷。并與多種因子有協(xié)同或加強(qiáng)的作用，比如TNF 和IL-1 等。

在腦內(nèi)，IL-6 由多種細(xì)胞分泌比如神經(jīng)元細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，而其中主要來(lái)源為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，其主要作用是調(diào)控炎癥反應(yīng)，從而起到營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用。另外IL-1 是一種致炎因子，而IL-6 能夠抑制其合成，從而使神經(jīng)元損傷減輕，這也就說(shuō)明IL-6 能起到抗炎和抑制免疫反應(yīng)的多方面作用。所以，通過(guò)實(shí)驗(yàn)IL-6 水平表達(dá)增高，表明其參與了腦出血后的細(xì)胞損傷或修復(fù)。

周爽等［2］研究表明檢測(cè)到IL-6 過(guò)度表達(dá)時(shí)，說(shuō)明神經(jīng)元細(xì)胞此時(shí)已有損傷，腦出血后釋放各種炎癥介質(zhì)，過(guò)多的IL-6 刺激細(xì)胞表達(dá)白細(xì)胞粘附分子，使白細(xì)胞向損傷區(qū)浸潤(rùn)，與此同時(shí)損傷區(qū)TNF、IL- α、IL-8 合成，形成出血后損傷［3］。另一方面部分分子的粘附性增強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致微血管的阻塞，這樣補(bǔ)體系統(tǒng)被激活，產(chǎn)生毒性細(xì)胞，破壞現(xiàn)有的細(xì)胞成分。這一事實(shí)會(huì)導(dǎo)致鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，使病損灶周圍血管收縮功能、通透性下降而引起腦水腫。而水腫帶的形成，又會(huì)向外擴(kuò)張，壓迫周圍的及鄰近的腦組織，產(chǎn)生對(duì)應(yīng)的功能區(qū)的損傷。

神經(jīng)功能缺損的量化評(píng)定與血清中IL-6 濃度的關(guān)系是正相關(guān)的，為研究提供了很好的理論依據(jù)。劉丹等［4］研究進(jìn)一步證明這一觀點(diǎn)，并再次指出血清中IL-6 表達(dá)與出血量的多少、缺損的神經(jīng)功能程度表現(xiàn)為正相對(duì)應(yīng)關(guān)系，可以更進(jìn)一步解釋為:出血多IL-6表達(dá)高，出血少IL-6 表達(dá)低;則功能缺損重，其血清中IL-6 表達(dá)水平高于運(yùn)動(dòng)功能缺損程度輕的。同樣腦水腫程度越嚴(yán)重，其血清中IL-6 濃度相對(duì)也高，所以根據(jù)血清中IL-6 的表達(dá)水平可以推測(cè)其預(yù)后情況。

李麗［5］、于洋［6］通過(guò)實(shí)驗(yàn)也證明血清中IL-6 的動(dòng)態(tài)變化:出血量越多，其預(yù)后效果相對(duì)較差，而出血量越少，其預(yù)后效果相對(duì)較好。肖家平［7］提供藥物早期干預(yù)治療后，減輕了腦水腫的程度，降低了血清中IL-6 的表達(dá)，同時(shí)清除了自由基，保護(hù)了腦細(xì)胞。周汝娟等［8］通過(guò)相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明:當(dāng)血清中檢測(cè)出IL-6過(guò)高表達(dá)時(shí)，其腦水腫程度較重，而引起血管再次出血的可能性也較大。吳濤［9］同樣也通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明在腦出血早期，血清中的IL-6 是成上升狀態(tài)的，隨著藥物的治療，血清中的IL-6 濃度控制在一定水平，然后逐漸下降，進(jìn)而控制了感染，降低了腦水腫，改善了腦功能?，F(xiàn)在IL-6 的測(cè)定不僅在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中，而且也已應(yīng)用于臨床。研究已表明:IL-6 參與腦血管疾病恢復(fù)過(guò)程，為預(yù)后判斷提供了重要依據(jù)。

導(dǎo)師在臨床用本法治療腦出血患者眾多，同時(shí)也收到了較好的治療效果，故通過(guò)這次基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究來(lái)進(jìn)一步提供理論依據(jù)支持。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明“百會(huì)透懸厘”針刺法可以:①減輕神經(jīng)功能缺損程度;②保護(hù)急性期腦出血中受損的細(xì)胞。針刺治療中風(fēng)病歷史悠久，在臨床實(shí)踐中效果突出。腦出血后通過(guò)少針透刺治療是未來(lái)的趨勢(shì)，更是研究的方向，希望更多的專家、學(xué)者加入進(jìn)來(lái)，為本療法提供更多的臨床和基礎(chǔ)研究依據(jù)。

［1］ 石學(xué)敏.中風(fēng)病與醒腦開(kāi)竅針刺法［M］.天津:天津科學(xué)技術(shù)出版社，1998:323-325

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