含N—乙?；嗡毓烟堑闹苽浼靶蛄蟹治?/h1>
2015-07-09 10:27林江慧張建偉肖曉毛高建平張惠芳魏崢
分析化學(xué) 2015年5期
林江慧 張建偉 肖曉毛 高建平 張惠芳 魏崢
摘 要 建立了含N-乙?；嗡毓烟堑姆蛛x提純及其序列結(jié)構(gòu)分析方法。首先應(yīng)用肝素酶Ⅰ深度酶解低分子量肝素來(lái)富集含N-乙?；Y(jié)構(gòu)寡糖，通過(guò)Bio-Gel P10凝膠色譜法分離制備了包括二糖至十四糖的系列肝素寡糖粗樣品，ProPac PA-1強(qiáng)陰離子高效液相色譜（SAX-HPLC）等方法對(duì)粗樣品進(jìn)一步分離，提純得到4種六糖和3種八糖片段。其次應(yīng)用肝素酶Ⅰ， Ⅱ和Ⅲ復(fù)合酶解與 HPLC法分析各純化寡糖的二糖組分，并結(jié)合肝素酶Ⅰ底物特異性，初步推斷4種六糖和3種八糖的序列結(jié)構(gòu)。在寡糖的糖鏈兩端均含有N-硫酸化二糖，而N-乙酰化二糖分布在糖鏈當(dāng)中。應(yīng)用電噴霧離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜（ESI-IT-TOF-MS）在負(fù)離子模式下進(jìn)一步表征寡糖并分析其裂解規(guī)律。結(jié)果表明，各寡糖中均出現(xiàn)大量因SO2
3丟失形成的碎片離子峰，六糖中主要有雙電荷和三電荷碎片離子峰；在八糖中出現(xiàn)了一系列從雙電荷至五電荷的離子峰。各寡糖的雙電荷離子峰質(zhì)荷比進(jìn)一步確定了上述寡糖的序列結(jié)構(gòu)。六糖的裂解規(guī)律表明，裂解主要存在于糖苷鍵，N-乙酰葡糖胺和糖醛酸上的裂解方式分別為0，2X和0，2Z。本研究提供了切實(shí)有效的分離、分析未知結(jié)構(gòu)肝素寡糖序列的新方法。
關(guān)鍵詞 肝素寡糖； 飛行時(shí)間質(zhì)譜； 肝素酶； 序列測(cè)定
1 引 言
肝素（Heparin， HP）是帶有大量負(fù)電荷的線性糖胺聚糖，在細(xì)胞表面和細(xì)胞基質(zhì)中廣泛表達(dá)。HP與眾多的蛋白質(zhì)相互作用，調(diào)控多種生物學(xué)功能。除了抗凝血及抗血拴生成外， 肝素還具有抗平滑肌細(xì)胞增殖、抗炎癥、抗腫瘤及抗病毒等， 而這些生物活性與肝素的特異結(jié)構(gòu)密切相關(guān)【1～3】。
肝素聚糖鏈由50～200個(gè)重復(fù)的二糖單元構(gòu)成。HP二糖是由己糖醛酸（Hexuronic acid， Hex A）與葡萄糖胺（Glucosamine， GlcN）以1-4糖苷鍵連接而成。己糖醛酸有兩種結(jié)構(gòu)，即葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸。己糖醛酸上的修飾有2位氧硫酸化，葡萄糖胺上的修飾有N位硫酸化、 N位乙?；6位氧硫酸化，以及一些稀有結(jié)構(gòu) C3位硫酸化。這些修飾的組合構(gòu)成了最常見的8種二糖單元（如表1所示）【4，5】。迄今為止評(píng)價(jià)HP結(jié)構(gòu)主要是通過(guò)分析其酶解二糖組分，對(duì)功能性寡糖的序列研究報(bào)道不多。
高效液相色譜、凝膠色譜、毛細(xì)管電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等技術(shù)已被應(yīng)用于HP結(jié)構(gòu)的研究【6】。NMR雖然能夠測(cè)定肝素寡糖結(jié)構(gòu)，但是需要樣品純度高且量較大，這限制了它在微量結(jié)構(gòu)寡糖分析中的應(yīng)用。由于質(zhì)譜精度高，可快速分析糖類精細(xì)結(jié)構(gòu)。近年來(lái)，質(zhì)譜和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)被大量應(yīng)用于分析HP二糖或寡糖。Kailemia等應(yīng)用質(zhì)譜表征了一個(gè)類似肝素結(jié)構(gòu)的五糖藥物【7】。Huang等通過(guò)化學(xué)修飾，全序列分析了合成的肝素、硫酸類肝素寡糖類似物【8】。Huang等應(yīng)用質(zhì)譜電子轉(zhuǎn)移裂解技術(shù)分析了硫酸類肝素寡糖【9】。Shi等應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜分析了肝素/硫酸類肝素寡糖的SO2
4丟失【10】。Kailemia等應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜分析了酶化學(xué)合成的肝素結(jié)構(gòu)【11】。
肝素大部分結(jié)構(gòu)是高硫結(jié)構(gòu)，N-乙?；Y(jié)構(gòu)含量較低，但這部分結(jié)構(gòu)對(duì)于肝素功能也是至關(guān)重要的【11】。肝素六糖和八糖通過(guò)特殊的序列與多種蛋白質(zhì)、酶等相互作用調(diào)控肝素的生理功能。肝素的抗凝血和抗帶狀皰疹病毒作用的六糖片段中C3位硫酸化和N位乙?；课皇腔钚缘谋匦栉稽c(diǎn)【12】。肝素的N位基團(tuán)是它與多種細(xì)胞增長(zhǎng)因子相互結(jié)合的必要位點(diǎn)【13，14】，并且具有抑制腫瘤細(xì)胞來(lái)源的類肝素酶的活性【15】。最引人關(guān)注的是，低分子量肝素在臨床上有直接的抗癌活性，它有助于延長(zhǎng)腫瘤患者的生存時(shí)間，推測(cè)這與肝素的微量結(jié)構(gòu)有著密切關(guān)系【16，17】。
分析微量結(jié)構(gòu)肝素寡糖的序列，不僅對(duì)其結(jié)構(gòu)與功能的研究具有重要意義，同時(shí)也為肝素作為有效的抑制劑提供了理論基礎(chǔ)。肝素酶是制備二糖和寡糖的重要工具酶。其中肝素酶I對(duì)含有N位和C2位SO2
4的高硫二糖具有底物特異性【6】，對(duì)含N-乙?；土蚪Y(jié)構(gòu)不酶解。
本研究基于肝素酶Ⅰ底物特異性，采用二糖組分分析法，酶解低分子量肝素，分離制備含N-乙?；嗡毓烟?，初步確定了它們的序列結(jié)構(gòu)，并通過(guò)質(zhì)譜測(cè)定寡糖的質(zhì)荷比及裂解規(guī)律。與文獻(xiàn)報(bào)道中用質(zhì)譜表征合成的已知結(jié)構(gòu)的肝素寡糖類似物相比，本研究采用天然肝素對(duì)其寡糖的研究更具現(xiàn)實(shí)意義。
2 實(shí)驗(yàn)部分
2.1 儀器與試劑
1200系列高效液相色譜儀（HPLC，美國(guó)Agilent公司）；Christ Alpha 1-4 LD Plus冷凍干燥機(jī)、Christ RVC 2-18真空離心濃縮儀（德國(guó)Christ公司）； MS-IT-TOF離子阱飛行時(shí)間質(zhì)譜、2450型紫外分光光度計(jì) （日本島津公司）。ProPac PA-1強(qiáng)陰離子交換（SAX）色譜柱（250 mm×4.0 mm，美國(guó)Dionex公司）；Bio-Gel P10凝膠色譜柱 （115 cm × 1.7 cm，fine grade，美國(guó)Bio-Rad公司）。
低分子量肝素（分子量1000～14000 Da，英國(guó)Leo Laboratories公司）；8種肝素標(biāo)準(zhǔn)二糖（ΔHexA（2S）-GlcNAc，ΔHexA-GlcNAc，ΔHexA-GlcNAc（6S），ΔHexA（2S）-GlcNS，ΔHexA-GlcNS，ΔHexA-GlcNS（6S），ΔHexA（2S）-GlcNAc（6S），ΔHexA（2S）-GlcNS（6S）），四糖（dp4），六糖（dp6），八糖（dp8），十糖（dp10），十二糖（dp12）， 十四糖（dp14） （英國(guó)Idroun公司）；肝素酶Ⅰ，肝素酶Ⅱ， 肝素酶 Ⅲ（美國(guó)Sigma公司）；乙腈（色譜純，德國(guó)Merck KGaA 公司）；乙酸銨，碳酸氫銨（分析純，美國(guó)Sigma公司）；NaCl（色譜純，美國(guó)Sigma公司）；BSA（生物級(jí)，美國(guó)MPBio公司）；其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。endprint
2.2 低分子量肝素深度酶解
200 mg低分子量肝素溶解在2 mL 0.1 mol/L乙酸鈉緩沖溶液（含0.1 mmol/L乙酸鈣和100 μg/mL BSA， pH 7.0）中，加入50 mIU肝素酶Ⅰ在37 ℃酶解12 h后，加入50 mIU肝素酶Ⅰ繼續(xù)酶解12 h。加熱至沸3 min終止反應(yīng)。10000 r/min離心10 min，取上清液，凍干。
2.3 肝素寡糖的粗分離制備
上述樣品用1 mL 0.2 mol/L NH4HCO3溶解，上樣到Bio-Gel P10凝膠色譜層析柱（115 cm×1.7 cm）。0.2 mol/L NH4HCO3洗脫，流速0.2 mL/min。紫外檢測(cè)波長(zhǎng)232 nm，依次收集每個(gè)色譜峰對(duì)應(yīng)的糖片段。55 ℃加熱24 h 揮發(fā)NH4HCO3，凍干獲得肝素寡糖粗樣品。
2.4 肝素寡糖的細(xì)分與制備
ProPac PA-1柱強(qiáng)陰離子交換HPLC（250 mm×4.0 mm）進(jìn)一步分離2.3節(jié)中獲得的dp6和dp8寡糖。流動(dòng)相A 為超純水（以 HCl調(diào)至pH 3.5），流動(dòng)相B 為， 2 mol/l NaCl（以 HCl調(diào)至pH 3.5）。dp6和dp8粗樣品溶解在1 mL水（pH 3.5）中，上樣。流速1 mL/min，線性梯度洗脫：0～2 min， 100% A； 2.1～7.1 min， 100%～60% A； 7.1～47.1 min， 60%～25% A。檢測(cè)波長(zhǎng)232 nm。收集色譜峰對(duì)應(yīng)的寡糖樣品，截留分子量500透析膜（美國(guó)Spectrum公司）透析2天，凍干，得到 dp6a， dp6b， dp6c， dp6d， dp8a， dp8b和dp8c 純品。
2.5 肝素寡糖組分分析
2.5.1 各粗樣組分分析 取2.3節(jié)制備的四糖（dp4）、六糖（dp6）、八糖（dp8）、十糖（dp10）、十二糖（dp12）、十四糖（dp14）、大于十四糖（>dp14）各50 μg，分別加入10 mIU肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ完全酶解，SAX HPLC分離。色譜條件如下：A 為超純水（以 HCl調(diào)至pH 3.5），流動(dòng)相B 為 2 mol/L NaCl（以HCl調(diào)至pH 3.5）。樣品溶解于1 mL A中。色譜流速1 mL/min，線性梯度洗脫：0～2 min， 100% A；2.1～35.1 min，100%～75% A；35.1～57.1 min，75%～50% A。232 nm紫外檢測(cè)。
2.5.2 寡糖dp6a， dp6b， dp6c， dp6d， dp8a， dp8b和dp8c 純樣品組分分析
取2.4節(jié)制備的dp6a ， dp6b， dp6c， dp6d， dp8a ， dp8b和dp8c各100 μg， 分別加入5 mIU的肝素酶Ⅰ， Ⅱ， Ⅲ完全酶解，SAX HPLC分離，色譜分離條件同上。
2.6 肝素寡糖質(zhì)譜分析
離子化模式：ESI源；負(fù)離子模式；霧化氣（高純N2）流速1.50 L/min；干燥氣（高純N2）流速10 L/min；加熱模塊溫度200 ℃；曲形脫溶劑管（CDL）
溫度200 ℃；離子源電壓4.5 kV；檢測(cè)器電壓1.6 kV；質(zhì)量掃描范圍：m/z 200～2000。準(zhǔn)確吸取10 μL 50 μg/mL的dp6a， dp6b， dp6c， dp6d， dp8a， dp8b， dp8c，在負(fù)離子模式下，手動(dòng)注入質(zhì)譜儀。
圖1 凝膠色譜柱分離肝素寡糖的色譜圖
Fig.1 Separation of heparin oligosaccharides on
Bio-Gel P10 chromatographic column
洗脫液： 0.2 mol/L NH4HCO3，流速： 0.2 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)： 232 nm。
Elution： 0.2 mol/L NH4HCO3， flow rate： 0.2 mL/min， UV detection wavelength： 232 nm.
3 結(jié)果與討論
3.1 肝素寡糖的粗分離及組分分析
如圖1所示，肝素寡糖混合樣品經(jīng)Bio-Gel P10 凝膠層析柱，依據(jù)分子量大小分離，獲得肝素二糖及一系列寡糖。通過(guò)與寡糖標(biāo)樣的洗脫時(shí)間對(duì)照（外標(biāo)法）可知，圖1中各峰對(duì)應(yīng)二糖（dp2）、四糖（dp4）、六糖（dp6）、八糖（dp8）、十糖（dp10）、十二糖（dp12）、十四糖（dp14）以及 大于十四糖（>dp14）。從圖1可見，Bio-GelP10凝膠色譜柱能夠完全分離7種肝素寡糖和二糖，其中dp2的含量最高，隨著寡糖分子量的增加，含量逐漸減少。由于肝素酶I對(duì)含有3個(gè)SO2
4的高硫二糖具有底物特異性【6】，不能酶解含N-乙?；土蚨?，因此推斷以上系列寡糖中含有不同長(zhǎng)度的N-乙酰化二糖結(jié)構(gòu)。
2.3節(jié)中制備的寡糖dp4至>dp14按2.5.1節(jié)方法經(jīng)肝素酶酶解-SAXHPLC分離，得到其二糖組分見表2，dp4至>dp14 的寡糖中均含有4種N-乙?；牵╠p4除外），4種N-硫酸化二糖。ΔHexA-GlcNAc隨著寡糖分子量的增加，含量呈遞增趨勢(shì)。同樣，ΔHexA-GlcNAc（6S） 和ΔHexA（2S）-GlcNAc的含量也呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)。ΔHexA（2S）-GlcNAc（6S）含量變化不太。dp6至>dp14 的系列寡糖中，含N-乙?；偠呛棵黠@遞增。上述結(jié)果表明，隨著寡糖分子量的增加，N-乙?；窃黾拥目赡軅€(gè)數(shù)為1～3個(gè)。
N-硫酸化二糖含量變動(dòng)趨勢(shì)與N-乙?；遣煌?。從dp6至>dp14 的寡糖中ΔHexA-GlcNS含量呈明顯遞增趨勢(shì)，變動(dòng)范圍為1.9%→16.5%。ΔHexA-GlcNS（6S）呈遞減趨勢(shì)（20.8%→9.8%）。ΔHexA（2S）-GlcNS和ΔHexA（2S）-GlcNAc（6S）的含量變化不大，僅有3.0%和2.0%左右的波動(dòng)。從表2可見，以>dp14為例，N-硫酸化二糖（NS-dp2）占總二糖含量為59.5%，2-O硫酸化二糖占43.5%，6-O硫酸化二糖（6S-dp2）占49.0%。寡糖系列中，隨著分子量的增大，NS-dp2百分含量（84.3%→59.5%），2S-dp2百分含量（84%→43.5%）和 6S-dp2百分含量（87.0%→49.0%）都呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。endprint
3.2 dp6，dp8分離提純及序列分析
利用SAX-HPLC進(jìn)一步分離dp6和dp8寡糖（見圖2）， dp6主要含有4個(gè)寡糖為dp6a， dp6b， dp6c， dp6d和dp8主要有3個(gè)寡糖dp8a， dp8b和dp8c。各提純組分經(jīng)肝素酶Ⅰ， Ⅱ和Ⅲ完全酶解后，SAX-HPLC分析，外標(biāo)法鑒定其二糖組成及摩爾比（表2）。
表3列出了按2.5.2節(jié)中分析dp6和dp8 細(xì)分寡糖的組分及摩爾比。dp6a含有兩種二糖結(jié)構(gòu)ΔHexA-GlcNS， ΔHexA2S-GlcNS6S，摩爾比接近2∶1?；诟嗡孛涪竦孜锾禺愋?，二糖GlcA2S-GlcNS6S在寡糖結(jié)構(gòu)的末端。因此，dp6a序列結(jié)構(gòu)為ΔHexA-GlcNS-HexA-GlcNS-HexA2S-GlcNS6S。按同理分析為了解質(zhì)譜在測(cè)試寡糖中的精確度，表4列出了雙電荷理論質(zhì)荷比、實(shí)測(cè)質(zhì)荷比及偏差。偏差范圍在
34.1～37.4 ppm 之間。肝素寡糖質(zhì)譜相對(duì)較復(fù)雜，質(zhì)譜數(shù)據(jù)中還能觀測(cè)到一系列的同位素峰。
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林江慧 張建偉 肖曉毛 高建平 張惠芳 魏崢
摘 要 建立了含N-乙?；嗡毓烟堑姆蛛x提純及其序列結(jié)構(gòu)分析方法。首先應(yīng)用肝素酶Ⅰ深度酶解低分子量肝素來(lái)富集含N-乙?；Y(jié)構(gòu)寡糖，通過(guò)Bio-Gel P10凝膠色譜法分離制備了包括二糖至十四糖的系列肝素寡糖粗樣品，ProPac PA-1強(qiáng)陰離子高效液相色譜（SAX-HPLC）等方法對(duì)粗樣品進(jìn)一步分離，提純得到4種六糖和3種八糖片段。其次應(yīng)用肝素酶Ⅰ， Ⅱ和Ⅲ復(fù)合酶解與 HPLC法分析各純化寡糖的二糖組分，并結(jié)合肝素酶Ⅰ底物特異性，初步推斷4種六糖和3種八糖的序列結(jié)構(gòu)。在寡糖的糖鏈兩端均含有N-硫酸化二糖，而N-乙酰化二糖分布在糖鏈當(dāng)中。應(yīng)用電噴霧離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜（ESI-IT-TOF-MS）在負(fù)離子模式下進(jìn)一步表征寡糖并分析其裂解規(guī)律。結(jié)果表明，各寡糖中均出現(xiàn)大量因SO2
3丟失形成的碎片離子峰，六糖中主要有雙電荷和三電荷碎片離子峰；在八糖中出現(xiàn)了一系列從雙電荷至五電荷的離子峰。各寡糖的雙電荷離子峰質(zhì)荷比進(jìn)一步確定了上述寡糖的序列結(jié)構(gòu)。六糖的裂解規(guī)律表明，裂解主要存在于糖苷鍵，N-乙酰葡糖胺和糖醛酸上的裂解方式分別為0，2X和0，2Z。本研究提供了切實(shí)有效的分離、分析未知結(jié)構(gòu)肝素寡糖序列的新方法。
關(guān)鍵詞 肝素寡糖； 飛行時(shí)間質(zhì)譜； 肝素酶； 序列測(cè)定
1 引 言
肝素（Heparin， HP）是帶有大量負(fù)電荷的線性糖胺聚糖，在細(xì)胞表面和細(xì)胞基質(zhì)中廣泛表達(dá)。HP與眾多的蛋白質(zhì)相互作用，調(diào)控多種生物學(xué)功能。除了抗凝血及抗血拴生成外， 肝素還具有抗平滑肌細(xì)胞增殖、抗炎癥、抗腫瘤及抗病毒等， 而這些生物活性與肝素的特異結(jié)構(gòu)密切相關(guān)【1～3】。
肝素聚糖鏈由50～200個(gè)重復(fù)的二糖單元構(gòu)成。HP二糖是由己糖醛酸（Hexuronic acid， Hex A）與葡萄糖胺（Glucosamine， GlcN）以1-4糖苷鍵連接而成。己糖醛酸有兩種結(jié)構(gòu)，即葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸。己糖醛酸上的修飾有2位氧硫酸化，葡萄糖胺上的修飾有N位硫酸化、 N位乙?；6位氧硫酸化，以及一些稀有結(jié)構(gòu) C3位硫酸化。這些修飾的組合構(gòu)成了最常見的8種二糖單元（如表1所示）【4，5】。迄今為止評(píng)價(jià)HP結(jié)構(gòu)主要是通過(guò)分析其酶解二糖組分，對(duì)功能性寡糖的序列研究報(bào)道不多。
高效液相色譜、凝膠色譜、毛細(xì)管電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等技術(shù)已被應(yīng)用于HP結(jié)構(gòu)的研究【6】。NMR雖然能夠測(cè)定肝素寡糖結(jié)構(gòu)，但是需要樣品純度高且量較大，這限制了它在微量結(jié)構(gòu)寡糖分析中的應(yīng)用。由于質(zhì)譜精度高，可快速分析糖類精細(xì)結(jié)構(gòu)。近年來(lái)，質(zhì)譜和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)被大量應(yīng)用于分析HP二糖或寡糖。Kailemia等應(yīng)用質(zhì)譜表征了一個(gè)類似肝素結(jié)構(gòu)的五糖藥物【7】。Huang等通過(guò)化學(xué)修飾，全序列分析了合成的肝素、硫酸類肝素寡糖類似物【8】。Huang等應(yīng)用質(zhì)譜電子轉(zhuǎn)移裂解技術(shù)分析了硫酸類肝素寡糖【9】。Shi等應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜分析了肝素/硫酸類肝素寡糖的SO2
4丟失【10】。Kailemia等應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜分析了酶化學(xué)合成的肝素結(jié)構(gòu)【11】。
肝素大部分結(jié)構(gòu)是高硫結(jié)構(gòu)，N-乙?；Y(jié)構(gòu)含量較低，但這部分結(jié)構(gòu)對(duì)于肝素功能也是至關(guān)重要的【11】。肝素六糖和八糖通過(guò)特殊的序列與多種蛋白質(zhì)、酶等相互作用調(diào)控肝素的生理功能。肝素的抗凝血和抗帶狀皰疹病毒作用的六糖片段中C3位硫酸化和N位乙?；课皇腔钚缘谋匦栉稽c(diǎn)【12】。肝素的N位基團(tuán)是它與多種細(xì)胞增長(zhǎng)因子相互結(jié)合的必要位點(diǎn)【13，14】，并且具有抑制腫瘤細(xì)胞來(lái)源的類肝素酶的活性【15】。最引人關(guān)注的是，低分子量肝素在臨床上有直接的抗癌活性，它有助于延長(zhǎng)腫瘤患者的生存時(shí)間，推測(cè)這與肝素的微量結(jié)構(gòu)有著密切關(guān)系【16，17】。
分析微量結(jié)構(gòu)肝素寡糖的序列，不僅對(duì)其結(jié)構(gòu)與功能的研究具有重要意義，同時(shí)也為肝素作為有效的抑制劑提供了理論基礎(chǔ)。肝素酶是制備二糖和寡糖的重要工具酶。其中肝素酶I對(duì)含有N位和C2位SO2
4的高硫二糖具有底物特異性【6】，對(duì)含N-乙?；土蚪Y(jié)構(gòu)不酶解。
本研究基于肝素酶Ⅰ底物特異性，采用二糖組分分析法，酶解低分子量肝素，分離制備含N-乙?；嗡毓烟?，初步確定了它們的序列結(jié)構(gòu)，并通過(guò)質(zhì)譜測(cè)定寡糖的質(zhì)荷比及裂解規(guī)律。與文獻(xiàn)報(bào)道中用質(zhì)譜表征合成的已知結(jié)構(gòu)的肝素寡糖類似物相比，本研究采用天然肝素對(duì)其寡糖的研究更具現(xiàn)實(shí)意義。
2 實(shí)驗(yàn)部分
2.1 儀器與試劑
1200系列高效液相色譜儀（HPLC，美國(guó)Agilent公司）；Christ Alpha 1-4 LD Plus冷凍干燥機(jī)、Christ RVC 2-18真空離心濃縮儀（德國(guó)Christ公司）； MS-IT-TOF離子阱飛行時(shí)間質(zhì)譜、2450型紫外分光光度計(jì) （日本島津公司）。ProPac PA-1強(qiáng)陰離子交換（SAX）色譜柱（250 mm×4.0 mm，美國(guó)Dionex公司）；Bio-Gel P10凝膠色譜柱 （115 cm × 1.7 cm，fine grade，美國(guó)Bio-Rad公司）。
低分子量肝素（分子量1000～14000 Da，英國(guó)Leo Laboratories公司）；8種肝素標(biāo)準(zhǔn)二糖（ΔHexA（2S）-GlcNAc，ΔHexA-GlcNAc，ΔHexA-GlcNAc（6S），ΔHexA（2S）-GlcNS，ΔHexA-GlcNS，ΔHexA-GlcNS（6S），ΔHexA（2S）-GlcNAc（6S），ΔHexA（2S）-GlcNS（6S）），四糖（dp4），六糖（dp6），八糖（dp8），十糖（dp10），十二糖（dp12）， 十四糖（dp14） （英國(guó)Idroun公司）；肝素酶Ⅰ，肝素酶Ⅱ， 肝素酶 Ⅲ（美國(guó)Sigma公司）；乙腈（色譜純，德國(guó)Merck KGaA 公司）；乙酸銨，碳酸氫銨（分析純，美國(guó)Sigma公司）；NaCl（色譜純，美國(guó)Sigma公司）；BSA（生物級(jí)，美國(guó)MPBio公司）；其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。endprint
2.2 低分子量肝素深度酶解
200 mg低分子量肝素溶解在2 mL 0.1 mol/L乙酸鈉緩沖溶液（含0.1 mmol/L乙酸鈣和100 μg/mL BSA， pH 7.0）中，加入50 mIU肝素酶Ⅰ在37 ℃酶解12 h后，加入50 mIU肝素酶Ⅰ繼續(xù)酶解12 h。加熱至沸3 min終止反應(yīng)。10000 r/min離心10 min，取上清液，凍干。
2.3 肝素寡糖的粗分離制備
上述樣品用1 mL 0.2 mol/L NH4HCO3溶解，上樣到Bio-Gel P10凝膠色譜層析柱（115 cm×1.7 cm）。0.2 mol/L NH4HCO3洗脫，流速0.2 mL/min。紫外檢測(cè)波長(zhǎng)232 nm，依次收集每個(gè)色譜峰對(duì)應(yīng)的糖片段。55 ℃加熱24 h 揮發(fā)NH4HCO3，凍干獲得肝素寡糖粗樣品。
2.4 肝素寡糖的細(xì)分與制備
ProPac PA-1柱強(qiáng)陰離子交換HPLC（250 mm×4.0 mm）進(jìn)一步分離2.3節(jié)中獲得的dp6和dp8寡糖。流動(dòng)相A 為超純水（以 HCl調(diào)至pH 3.5），流動(dòng)相B 為， 2 mol/l NaCl（以 HCl調(diào)至pH 3.5）。dp6和dp8粗樣品溶解在1 mL水（pH 3.5）中，上樣。流速1 mL/min，線性梯度洗脫：0～2 min， 100% A； 2.1～7.1 min， 100%～60% A； 7.1～47.1 min， 60%～25% A。檢測(cè)波長(zhǎng)232 nm。收集色譜峰對(duì)應(yīng)的寡糖樣品，截留分子量500透析膜（美國(guó)Spectrum公司）透析2天，凍干，得到 dp6a， dp6b， dp6c， dp6d， dp8a， dp8b和dp8c 純品。
2.5 肝素寡糖組分分析
2.5.1 各粗樣組分分析 取2.3節(jié)制備的四糖（dp4）、六糖（dp6）、八糖（dp8）、十糖（dp10）、十二糖（dp12）、十四糖（dp14）、大于十四糖（>dp14）各50 μg，分別加入10 mIU肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ完全酶解，SAX HPLC分離。色譜條件如下：A 為超純水（以 HCl調(diào)至pH 3.5），流動(dòng)相B 為 2 mol/L NaCl（以HCl調(diào)至pH 3.5）。樣品溶解于1 mL A中。色譜流速1 mL/min，線性梯度洗脫：0～2 min， 100% A；2.1～35.1 min，100%～75% A；35.1～57.1 min，75%～50% A。232 nm紫外檢測(cè)。
2.5.2 寡糖dp6a， dp6b， dp6c， dp6d， dp8a， dp8b和dp8c 純樣品組分分析
取2.4節(jié)制備的dp6a ， dp6b， dp6c， dp6d， dp8a ， dp8b和dp8c各100 μg， 分別加入5 mIU的肝素酶Ⅰ， Ⅱ， Ⅲ完全酶解，SAX HPLC分離，色譜分離條件同上。
2.6 肝素寡糖質(zhì)譜分析
離子化模式：ESI源；負(fù)離子模式；霧化氣（高純N2）流速1.50 L/min；干燥氣（高純N2）流速10 L/min；加熱模塊溫度200 ℃；曲形脫溶劑管（CDL）
溫度200 ℃；離子源電壓4.5 kV；檢測(cè)器電壓1.6 kV；質(zhì)量掃描范圍：m/z 200～2000。準(zhǔn)確吸取10 μL 50 μg/mL的dp6a， dp6b， dp6c， dp6d， dp8a， dp8b， dp8c，在負(fù)離子模式下，手動(dòng)注入質(zhì)譜儀。
圖1 凝膠色譜柱分離肝素寡糖的色譜圖
Fig.1 Separation of heparin oligosaccharides on
Bio-Gel P10 chromatographic column
洗脫液： 0.2 mol/L NH4HCO3，流速： 0.2 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)： 232 nm。
Elution： 0.2 mol/L NH4HCO3， flow rate： 0.2 mL/min， UV detection wavelength： 232 nm.
3 結(jié)果與討論
3.1 肝素寡糖的粗分離及組分分析
如圖1所示，肝素寡糖混合樣品經(jīng)Bio-Gel P10 凝膠層析柱，依據(jù)分子量大小分離，獲得肝素二糖及一系列寡糖。通過(guò)與寡糖標(biāo)樣的洗脫時(shí)間對(duì)照（外標(biāo)法）可知，圖1中各峰對(duì)應(yīng)二糖（dp2）、四糖（dp4）、六糖（dp6）、八糖（dp8）、十糖（dp10）、十二糖（dp12）、十四糖（dp14）以及 大于十四糖（>dp14）。從圖1可見，Bio-GelP10凝膠色譜柱能夠完全分離7種肝素寡糖和二糖，其中dp2的含量最高，隨著寡糖分子量的增加，含量逐漸減少。由于肝素酶I對(duì)含有3個(gè)SO2
4的高硫二糖具有底物特異性【6】，不能酶解含N-乙?；土蚨?，因此推斷以上系列寡糖中含有不同長(zhǎng)度的N-乙酰化二糖結(jié)構(gòu)。
2.3節(jié)中制備的寡糖dp4至>dp14按2.5.1節(jié)方法經(jīng)肝素酶酶解-SAXHPLC分離，得到其二糖組分見表2，dp4至>dp14 的寡糖中均含有4種N-乙?；牵╠p4除外），4種N-硫酸化二糖。ΔHexA-GlcNAc隨著寡糖分子量的增加，含量呈遞增趨勢(shì)。同樣，ΔHexA-GlcNAc（6S） 和ΔHexA（2S）-GlcNAc的含量也呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)。ΔHexA（2S）-GlcNAc（6S）含量變化不太。dp6至>dp14 的系列寡糖中，含N-乙?；偠呛棵黠@遞增。上述結(jié)果表明，隨著寡糖分子量的增加，N-乙?；窃黾拥目赡軅€(gè)數(shù)為1～3個(gè)。
N-硫酸化二糖含量變動(dòng)趨勢(shì)與N-乙?；遣煌?。從dp6至>dp14 的寡糖中ΔHexA-GlcNS含量呈明顯遞增趨勢(shì)，變動(dòng)范圍為1.9%→16.5%。ΔHexA-GlcNS（6S）呈遞減趨勢(shì)（20.8%→9.8%）。ΔHexA（2S）-GlcNS和ΔHexA（2S）-GlcNAc（6S）的含量變化不大，僅有3.0%和2.0%左右的波動(dòng)。從表2可見，以>dp14為例，N-硫酸化二糖（NS-dp2）占總二糖含量為59.5%，2-O硫酸化二糖占43.5%，6-O硫酸化二糖（6S-dp2）占49.0%。寡糖系列中，隨著分子量的增大，NS-dp2百分含量（84.3%→59.5%），2S-dp2百分含量（84%→43.5%）和 6S-dp2百分含量（87.0%→49.0%）都呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。endprint
3.2 dp6，dp8分離提純及序列分析
利用SAX-HPLC進(jìn)一步分離dp6和dp8寡糖（見圖2）， dp6主要含有4個(gè)寡糖為dp6a， dp6b， dp6c， dp6d和dp8主要有3個(gè)寡糖dp8a， dp8b和dp8c。各提純組分經(jīng)肝素酶Ⅰ， Ⅱ和Ⅲ完全酶解后，SAX-HPLC分析，外標(biāo)法鑒定其二糖組成及摩爾比（表2）。
表3列出了按2.5.2節(jié)中分析dp6和dp8 細(xì)分寡糖的組分及摩爾比。dp6a含有兩種二糖結(jié)構(gòu)ΔHexA-GlcNS， ΔHexA2S-GlcNS6S，摩爾比接近2∶1?；诟嗡孛涪竦孜锾禺愋?，二糖GlcA2S-GlcNS6S在寡糖結(jié)構(gòu)的末端。因此，dp6a序列結(jié)構(gòu)為ΔHexA-GlcNS-HexA-GlcNS-HexA2S-GlcNS6S。按同理分析為了解質(zhì)譜在測(cè)試寡糖中的精確度，表4列出了雙電荷理論質(zhì)荷比、實(shí)測(cè)質(zhì)荷比及偏差。偏差范圍在
34.1～37.4 ppm 之間。肝素寡糖質(zhì)譜相對(duì)較復(fù)雜，質(zhì)譜數(shù)據(jù)中還能觀測(cè)到一系列的同位素峰。
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