王桂明　史棟棟　彭章曉　魯陽(yáng)芳　谷雪　王彥++閆超

摘 要 研究了木香烴內(nèi)酯誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。采用流式細(xì)胞儀測(cè)定不同濃度木香烴內(nèi)酯（0， 2， 4， 8 μg/mL）作用于MCF-7細(xì)胞后細(xì)胞凋亡、活性氧（Reactive oxygen species， ROS）含量及線粒體跨膜電位（Mitochondrial transmembrane potential， MTP）的變化，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-TOF/MS）技術(shù)分析加藥組與未加藥組的代謝差異物。結(jié)果表明，木香烴內(nèi)酯能誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡，并具有濃度依賴性，能夠促使ROS含量升高； MTP在2 μg/mL木香烴內(nèi)酯作用時(shí)升高，在4和8 μg/mL時(shí)顯著下降；基于GC-TOF/MS的細(xì)胞代謝組學(xué)研究，最終發(fā)現(xiàn)15種代謝差異物。基于上述結(jié)果，推測(cè)木香烴內(nèi)酯通過(guò)引起ROS含量升高、MTP降低，擾亂線粒體的正常功能，進(jìn)一步阻礙TCA循環(huán)，抑制ATP合成，擾亂了細(xì)胞內(nèi)代謝物的平衡，并引起位于膜間隙的凋亡相關(guān)蛋白釋放，最終導(dǎo)致MCF-7細(xì)胞的凋亡。

關(guān)鍵詞 MCF-7細(xì)胞； 細(xì)胞凋亡； 細(xì)胞代謝組學(xué)； 活性氧； 線粒體跨膜電位

1 引 言

乳腺癌嚴(yán)重威脅著女性健康，居于女性腫瘤患者致死率的第2位，發(fā)病率在發(fā)展中國(guó)家呈逐年上升趨勢(shì)【1】。木香烴內(nèi)酯是從中藥木香中提取的倍半萜內(nèi)酯，研究發(fā)現(xiàn)其具有抗炎等生物活性【2～4】，可誘導(dǎo)早幼粒白血病HL-60細(xì)胞及U937細(xì)胞、乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡【5～7】，對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒性。它可以通過(guò)引起ROS的升高、MTP的崩潰誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞的凋亡【8】，研究表明，其通過(guò)與微管蛋白作用、抑制端粒酶活性等抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖【9，10】。腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS的含量比正常細(xì)胞高，在以ROS為靶點(diǎn)的藥物作用下腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS首先達(dá)到氧化應(yīng)激狀態(tài)，因此可有選擇性地殺死癌細(xì)胞【11】。MTP的降低可以引起腫瘤細(xì)胞的凋亡，ROS含量升高可以引起線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔的打開(kāi)而引起MTP降低，最終促進(jìn)細(xì)胞凋亡【12】。因此，ROS升高、MTP的降低與細(xì)胞凋亡之間存在密切聯(lián)系。

代謝組學(xué)被稱為“基因型和表型之間的橋梁”【13】，不僅可以測(cè)定藥物本身的代謝及藥代動(dòng)力學(xué)變化，還可以測(cè)定藥物作用引起的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的變化【14，15】。因此，將代謝組學(xué)與傳統(tǒng)生物學(xué)研究方法相結(jié)合，對(duì)于深入探究藥物作用機(jī)制有重要的意義。

目前，代謝組學(xué)結(jié)合傳統(tǒng)生物學(xué)的方法考察藥物抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用的研究已有文獻(xiàn)報(bào)道【16】，但是將此方法用于細(xì)胞凋亡作用機(jī)制方面的研究仍未見(jiàn)報(bào)道。本研究以木香烴內(nèi)酯作用于MCF-7細(xì)胞，基于細(xì)胞內(nèi)ROS含量以及MTP的變化，結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-TOF/MS）技術(shù)分析藥物作用前后細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的變化，探討了木香烴內(nèi)酯誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡作用的機(jī)制。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

CO2培養(yǎng)箱，氮吹儀（Thermo， USA）；低速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；LSRFortessa流式細(xì)胞儀、 FACSCalibur流式細(xì)胞儀（BD， USA）；GC×GC-TOF/MS （LECO， USA）；FS-150PV超聲細(xì)胞破碎儀 （上海生析超聲儀器有限公司）。木香烴內(nèi)酯（純度>98%，上海源葉生物科技有限公司）；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（PBS）、胰蛋白酶（美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司）；甲醇（色譜純，德國(guó)Merck）；吡啶（分析純）、二甲基亞砜（DMSO，分析純）均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；N， O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA，含1%三甲基氯硅烷）、甲氧胺、2-氯-苯丙氨酸均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、羅丹明123（Rhodamine123）、2′， 7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）均購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所。

2.2 細(xì)胞凋亡分析

用DMSO配制10 mg/mL木香烴內(nèi)酯儲(chǔ)備液，用培養(yǎng)基逐步稀釋至8， 4 和2 μg/mL（DMSO終濃度<0.1%）。用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞凋亡情況。試劑盒中具有Annexin V-FITC與碘化丙啶（PI）兩種染料。磷酯酰絲氨酸（PS）主要分布在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，凋亡細(xì)胞的PS外翻，Annexin V與PS結(jié)合；凋亡晚期及壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜完整性受到破壞，PI可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行標(biāo)記，Annexin V-FITC可以進(jìn)入壞死細(xì)胞內(nèi)與位于內(nèi)側(cè)的PS結(jié)合而標(biāo)記。

指數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞接種在六孔板上（2×105/孔），培養(yǎng)12 h后，隨機(jī)分4組，每組3個(gè)平行，分別加入以下各組藥物：Control（0 μg/ml）， 2， 4和8 μg/mL，培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，用冷PBS緩沖溶液清洗2遍，加入200 μL凋亡結(jié)合液后用移液槍輕輕吹散細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC 和10 μL PI避光孵育15 min，F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)10000個(gè)細(xì)胞。

2.3 細(xì)胞內(nèi)ROS含量的測(cè)定

用熒光探針DCFH-DA測(cè)定ROS的含量。DCFH-DA本身沒(méi)有熒光，進(jìn)入細(xì)胞后可最終被ROS氧化為有熒光的2′，7′-二氯熒光黃（DCF），其熒光強(qiáng)度代表細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞接種在六孔板上（2×105/孔），培養(yǎng)12 h后，隨機(jī)分4組，每組3個(gè)平行，分別加入木香烴內(nèi)酯2， 4 和8 μg/mL和空白培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，用含8 μmol/L DCFH-DA無(wú)血清培養(yǎng)基37 ℃避光孵育20 min，PBS清洗2遍以除去未標(biāo)記的DCFH-DA探針，收集細(xì)胞用LSRFortessa流式細(xì)胞儀分析，檢測(cè)10000個(gè)細(xì)胞。

2.4 線粒體跨膜電位（MTP）的測(cè)定endprint

Rhodamine123是一種攜帶正電荷的陽(yáng)離子染料，可依賴較高的負(fù)線粒體跨膜電位有選擇性的進(jìn)入線粒體，其熒光強(qiáng)度高說(shuō)明線粒體內(nèi)電負(fù)性強(qiáng)，MTP高，反之則MTP低。將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞接種在六孔板上（2×105/孔），培養(yǎng)12 h后，隨機(jī)分4組，每組3個(gè)平行，加入木香烴內(nèi)酯（2， 4 和8 μg/mL）、空白培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，Rhodamine123（0.2 μmol/L）避光染色30 min，用冷PBS緩沖溶液清洗2遍，收集細(xì)胞，LSRFortessa流式細(xì)胞儀測(cè)定其熒光強(qiáng)度。

2.5 基于GC-TOF/MS的細(xì)胞代謝組學(xué)研究

2.5.1 細(xì)胞代謝物的提取及衍生化 將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種在100 mm×20 mm的培養(yǎng)皿中（3×106/皿），培養(yǎng)12 h后加入木香烴內(nèi)酯（6 μg/mL）、含等量DMSO的培養(yǎng)基，設(shè)6個(gè)平行。細(xì)胞的提取及衍生化過(guò)程如下【17】：培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，用生理鹽水清洗3遍，液氮迅速猝滅。每個(gè)培養(yǎng)皿加入1000 μl甲醇-水（4∶1， V/V）溶液，刮取細(xì)胞至樣品瓶中，為更充分提取細(xì)胞，每個(gè)樣品加入200 μL氯仿。每一樣品加入10 μL 2-氯-苯丙氨酸（內(nèi)標(biāo)，0.3 mg/mL），渦旋，超聲破碎（3 min，5 s開(kāi)，5 s關(guān)，4 ℃）細(xì)胞提取代謝物。

將提取后的細(xì)胞樣品4000 r/min離心10 min，取1000 μL上清液至GC進(jìn)樣瓶中，室溫真空干燥，用氮?dú)庠俅未蹈珊?，加?0 μL甲氧胺（15 mg/mL，吡啶配制），混合1 min，30 ℃反應(yīng)90 min后，加入80 μL BSTFA和40 μL正己烷，70 ℃下反應(yīng)90 min。

2.5.2 GC-TOF/MS條件 DB-5 MS色譜柱（30 m × 250 μm I.D.， J&W Scientific， Folsom， CA）； 載氣： 高純氦氣，流速1.0 mL/min。程序升溫： 起始溫度80 ℃，保持0.2 min；以10 ℃/min升至180 ℃，以5 ℃/min升至240 ℃，以20 ℃/min升至290 ℃，保持11 min。進(jìn)樣口溫度280 ℃，接口溫度270 ℃，EI源溫度220 ℃，電子碰撞能量70 eV。

質(zhì)量掃描范圍： m/z 30～600全掃描，質(zhì)譜圖采集速度：每秒20 幅。

2.5.3 GC-TOF/MS數(shù)據(jù)分析 GC-TOF/MS得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)ChromaTOF（v 4.50， LECO， St Joseph， MI，USA）軟件進(jìn)行預(yù)處理，得到包括樣品信息、保留時(shí)間及峰面積等信息的CSV三維數(shù)據(jù)矩陣，扣除已知的假峰后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行峰面積歸一化，然后導(dǎo)入SIMCA-P 11.5軟件進(jìn)行多維統(tǒng)計(jì)分析。本實(shí)驗(yàn)主要進(jìn)行無(wú)監(jiān)督的主成分分析（PCA）和有監(jiān)督的正交偏最小二乘法分析（OPLS-DA）。PCA分析主要觀察樣本的總體分布，OPLS-DA來(lái)區(qū)分加藥組與對(duì)照組之間的代謝差異物。變量權(quán)重值（Variable importance in the projection， VIP）>1的代謝物被認(rèn)為是差異代謝物，同時(shí)結(jié)合t檢驗(yàn)及Wilcoxon-Mann-Whitney檢驗(yàn)驗(yàn)證差異性代謝物，最后將得到的代謝差異物進(jìn)行NIST庫(kù)搜索。

3 結(jié)果與討論

3.1 木香烴內(nèi)酯對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡的影響

研究木香烴內(nèi)酯對(duì)MCF-7細(xì)胞的凋亡作用，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組凋亡率，圖1A是其中一組凋亡實(shí)驗(yàn)的散點(diǎn)圖，①②③和④分別代表細(xì)胞碎片、后期凋亡細(xì)胞、活細(xì)胞、前期凋亡細(xì)胞；圖1B是對(duì)3次平行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析的結(jié)果，從圖可以看出隨著藥物作用濃度的升高，MCF-7細(xì)胞的前期凋亡、后期凋亡及總凋亡率逐漸升高（在2 μg/mL處前期凋亡率略降低，但是與對(duì)照組沒(méi)有顯著性差異）。由此可知，

3.2 木香烴內(nèi)酯對(duì)MCF-7細(xì)胞線粒體跨膜電位（MTP）的影響

MTP的崩潰能引起細(xì)胞凋亡【18】。為探究木香烴內(nèi)酯誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，本研究考察了其對(duì)MCF-7細(xì)胞MTP的影響。由圖2可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，在2 μg/mL木香烴內(nèi)酯作用下MTP升高，在4和8 μg/mL時(shí)顯著下降，且隨著濃度的升高而下降。文獻(xiàn)＼表1 基于GC-TOF/MS數(shù)據(jù)的MCF-7細(xì)胞木香烴內(nèi)酯組與對(duì)照組對(duì)比的代謝差異物代謝差異物中，檸檬酸含量下降、琥珀酸含量上升，可能是由于細(xì)胞內(nèi)ROS含量的升高及MTP的降低破壞了三羧酸循環(huán)（TCA）而造成的。已有研究表明，氧化應(yīng)激與TCA循環(huán)功能性障礙相關(guān)，ROS可促使α-酮戊二酸轉(zhuǎn)化為琥珀酸【21】。琥珀酸脫氫酶可催化琥珀酸轉(zhuǎn)化為延胡索酸，是TCA循環(huán)中唯一與線粒體內(nèi)膜結(jié)合的酶。在上述研究中，MTP降低，琥珀酸脫氫酶活性可能受到抑制，使琥珀酸的含量升高。

線粒體是ATP合成的主要場(chǎng)所，MTP的降低，使氧化磷酸化過(guò)程解耦聯(lián)，ATP水解大于合成，破壞了離子和代謝物平衡【22】。TCA循環(huán)是糖類、脂肪和蛋白質(zhì)最終氧化的重要酶促循環(huán)反應(yīng)系統(tǒng)。在正常情況下，糖酵解、TCA循環(huán)的速度以及氧化磷酸化的速度是相互協(xié)調(diào)的【23】。在上述研究中，MTP降低，使氧化磷酸化過(guò)程解耦聯(lián)，抑制了ATP的合成。因此，推測(cè)TCA循環(huán)受到抑制，進(jìn)而抑制了糖酵解過(guò)程，使葡萄糖、山梨糖的含量升高。核糖醇是組成核黃素的成分之一，核黃素在生物體內(nèi)以黃素單核苷酸（FMN）和黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的形式參與氧化呼吸鏈、TCA循環(huán)。因此推測(cè)，氧化呼吸鏈以及TCA循環(huán)受到抑制后，引起核糖醇的含量升高。氨基酸可通過(guò)脫氨基作用生成α-酮酸參與到TCA循環(huán)中，其中苯丙氨酸、酪氨酸可轉(zhuǎn)化為延胡索酸，谷氨酸可轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸，絲氨酸、甘氨酸可轉(zhuǎn)化為丙酮酸【23】，谷氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸含量下降，絲氨酸、甘氨酸含量升高可能是由木香烴內(nèi)酯抑制了TCA循環(huán)進(jìn)而引起了氨基酸代謝的紊亂而造成的。endprint

4 結(jié) 論

以細(xì)胞代謝組學(xué)和傳統(tǒng)生物學(xué)方法為基礎(chǔ)，探究了木香烴內(nèi)酯作用于MCF-7細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)ROS含量、MTP及細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的變化。結(jié)果表明，木香烴內(nèi)酯作用于乳腺癌MCF-7細(xì)胞后，使ROS含量升高，MTP降低，導(dǎo)致線粒體的結(jié)構(gòu)受到破壞，可能進(jìn)一步阻礙了TCA循環(huán)，抑制了ATP合成，擾亂了細(xì)胞內(nèi)代謝物的平衡，并引起位于膜間隙的凋亡相關(guān)信號(hào)的釋放，最終導(dǎo)致MCF-7細(xì)胞的凋亡。本研究不僅從代謝組學(xué)的角度為研究木香烴內(nèi)酯抗腫瘤的作用機(jī)制提供了新線索，而且進(jìn)一步表明基于GC-TOF/MS的細(xì)胞代謝組學(xué)方法可以作為研究藥物作用機(jī)制的有效分析工具。

References

1 Desantis C， Ma J， Bryan L， Jemal A. CA Cancer J. Clin.， 2014， 64（1）： 52-62

2 Park H J， Jung W T， Basnet P， Kadota S， Namba T. J. Nat. Prod.， 1996， 59（12）： 1128-1130

3 Wedge D E， Galindo J C， Macias F A. Phytochem.， 2000， 53（7）： 747-757

4 Chen H C， Chou C K， Lee S D， Wang J C， Yeh S F. Antivir. Res.， 1995， 27（1-2）： 99-109

5 Choi J H， Ha J H， Park H H， Lee J Y， Park H J， Choi J W， Masuda Y， Nakaya K， Lee K T. Jpn. J. Cancer Res.， 2002， 93（12）： 1327-1333

6 Hibasami H， Yamada Y， Moteki H， Katsuzaki H， Imai K， Yoshioka K， Komiya T. Int. J. Mol. Med.， 2003， 12（2）： 147-151

7 Pitchai D， Roy A， Banu S. Phytother Res， 2014， 28： 1499-1505

8 Rasul A， Bao R， Malhi M， Zhao B， Tsuji I， Li J， Li X. Molecules.， 2013， 18（2）： 1418-1433

9 Bocca C， Gabriel L， Bozzo F， Miglietta A. Chem. Biol. Interact.， 2004， 147（1）： 79-86

10 Choi S H， Im E， Kang H K， Lee J H， Kwak H S， Bae Y T， Park H J， Kim N D. Cancer Lett.， 2005， 227（2）： 153-162

11 Schumacker P T. Cancer Cell， 2006， 10（3）： 175-176

12 Sinha K， Das J， Pal P B， Sil P C. Arch. Toxicol.， 2013， 87（7）： 1157-1180

13 Fiehn O. Plant Mol. Biol.， 2002， 48（1-2）： 155-171

14 SHIDong-Dong， KUANG Yuang-Yuan， WANG Gui-Ming， PENG Zhang-Xiao， WANG Yan， YAN Chao. Chinese Journal of Chromatography， 2014， 32（3）： 278-283

史棟棟， 況媛媛， 王桂明， 彭章曉， 王 彥， 閆 超. 色譜， 2014， 32（3）： 278-283

15 GU Jin-Ning， NIU Jun， PI Zi-Feng， YUE Hao， WU Sui-Sheng， LIU Shu-Ying. Chinese J. Anal. Chem.， 2013， 41（3）： 371-376

谷金寧， 牛 俊， 皮子鳳， 越 皓， 吳綏生， 劉淑瑩. 分析化學(xué)， 2013， 41（3）： 371-376

16 Jager W， Gruber A， Giessrigl B， Krupitza G， Szekeres T， Sonntag D. OMICS， 2011， 15（1-2）： 9-14

17 SHI Dong-Dong， WANG Gui-Ming， KUANG Yuan-Yuan， PENG Zhang-Xiao， WANG Yan， GU Xue， YAN Chao. Chinese J. Anal. Chem.， 2014， 42（8）： 1088-1093

史棟棟， 王桂明， 況媛媛， 彭章曉， 王 彥， 谷 雪， 閻 超. 分析化學(xué)， 2014， 42（8）： 1088-1093

18 Wang M， Ruan Y， Chen Q， Li S， Wang Q， Cai J. Eur. J. Pharmacol.， 2011， 650 （1）： 41-47

19 Scarlett J L， Sheard P W， Hughes G， Ledgerwood E C， Ku H H， Murphy M P. FEBS Lett.， 2000， 475（3）： 267-272

20 Simon H U， Haj-Yehia A， Levi-Schaffer F. Apoptosis， 2000， 5（5）： 415-418

21 Tiziani S， Lodi A， Khanim F L， Viant M R， Bunce C M， Günther U L. PloS One， 2009， 4（1）： e4251

22 Duchen M R. Mol. Aspects Med.， 2004， 25（4）： 365-451

23 JIA Hong-Ti， FENG Zuo-Hua. Biochemistry and Molecular Biology. Beijing： People′s Medical Publishing House， 2010： 194-250

賈弘褆， 馮作化. 生物化學(xué)與分子生物學(xué). 北京： 人民衛(wèi)生出版社， 2010： 194-250endprint