高柳柳,張晶,徐外蘭,李玉良,郭延壘,于超

(重慶醫(yī)科大學(xué) 生命科學(xué)研究院，重慶 400016)

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柴胡與氯苯那敏在大鼠體內(nèi)藥物間的相互作用研究

高柳柳,張晶,徐外蘭,李玉良,郭延壘,于超Δ

(重慶醫(yī)科大學(xué) 生命科學(xué)研究院，重慶 400016)

目的 探討柴胡提取物與氯苯那敏在大鼠體內(nèi)藥物間的相互作用。方法 將20只SD大鼠隨機分為2組，實驗組10只給予20 mg/kg的柴胡提取物2周，對照組10只平行給予生理鹽水，第15天分別給予氯苯那敏，于(0、0.1、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24 h)點采血200 μL，采用LC-MS分析方法測定氯苯那敏的血藥濃度，以Graphpad prism 5.01軟件計算2組的藥代動力學(xué)參數(shù)。結(jié)果 實驗組的AUC(0-∞)[1.40±0.27(μg·h)/mL] 明顯高于對照組[0.87±0.25(μg·h)/mL]；而代謝清除率CLint[14.25±2.84(L·kg)/h]明顯低于對照組[22.97±2.03(L·kg)/h](P<0.05)。結(jié)論 柴胡提取物能夠降低大鼠體內(nèi)氯苯那敏的代謝清除率，臨床上用藥時應(yīng)盡量避免2種藥物的聯(lián)合使用。

柴胡提取物；氯苯那敏；CYP2D6；相互作用

中藥-西藥聯(lián)合使用導(dǎo)致的藥物-藥物相互作用引起廣泛的關(guān)注，相關(guān)報道不斷增多[1-3]。據(jù)2007年美國的一項調(diào)查顯示，40%的患者可能因中藥-西藥相互作用導(dǎo)致不良反應(yīng)[4]。中藥有效成分在體內(nèi)代謝酶的作用下發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化的同時對酶產(chǎn)生抑制或誘導(dǎo)作用，引起合用藥物代謝行為的改變，增高血藥濃度或引起蓄積，導(dǎo)致不良反應(yīng)或者毒性反應(yīng)的發(fā)生。例如甘草可增加地高辛的毒性，人參可增加阿司匹林和非甾體抗炎藥的出血效應(yīng)[5]等。因此研究中西藥間相互作用對于臨床安全用藥、降低藥物相互作用的風(fēng)險有重要意義。

感冒是臨床上的常見疾病，是由病毒引起的急性上呼吸道感染疾病。近年來，中藥在治療感冒時的有效性受到人們的廣泛關(guān)注。在感冒藥處方中，中西藥聯(lián)用的處方占有較大比例。柴胡是許多用于抗感冒的中成藥或中藥復(fù)方的主要藥物之一，如小柴胡顆粒、小柴胡湯等，其具有解熱、抗病毒、抗炎等多方面的藥理作用[6]。馬來酸氯苯那敏又稱撲爾敏，是第一代組胺 H1 受體拮抗劑，常用于緩解流淚打噴嚏流涕等感冒癥狀[7]，是常用的抗感冒藥(如感冒靈顆粒)的組方成分[8]。因此2者在臨床上聯(lián)合使用的可能性非常大。本課題組在體外研究中發(fā)現(xiàn)柴胡提取物對氯苯那敏的代謝有明顯的抑制作用[9]。而在動物體內(nèi)是否存在抑制作用需進一步驗證及探討。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 島津2010AH液質(zhì)串聯(lián)系統(tǒng)(日本島津公司)；XS-105十萬分之一精密電子天平(美國METTLER TOLEDO公司)；SIGMA1-14低速離心機(美國SIGMA公司)；Elix10超純水凈化系統(tǒng)(美國MILLIPOER公司)；RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(中國上海亞榮生化儀器廠)。

馬來酸氯苯那敏(批號為D9684-5G，純度≥99 %)購自Sigma公司；地西泮(批號為9101003, 純度≥98%)由中國藥品生物制品檢定所提供；乙腈為色譜純；實驗用水為超純水，其余所用試劑均為分析純。

1.2 實驗動物 清潔級雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠，體質(zhì)量(220±20)g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物合格許可證號: SCXK(渝)2007-0002。

1.3 方法

1.3.1 色譜與質(zhì)譜條件：色譜條件：色譜柱為Waters C18柱(150 mm×2.0 mm，5 μm)。流動相為乙腈：醋酸銨(10 mmol/L, pH4.5)45:55，等度洗脫；流速：0.2 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：210 nm。質(zhì)譜條件：MS選用ESI源，正離子條件下(Positive)采用選擇性離子檢測模式(SIM)；噴霧電壓為4.5 KV；采用高純N2作為載氣，載氣流量為1.5 L/min；檢測器電壓為1.75 KV；干燥氣溫度250 ℃。SIM模式下氯苯那敏和地西泮的監(jiān)測離子質(zhì)核比分別為m/z 275和m/z 285。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制：精密稱取馬來酸氯苯那敏10.63 mg，加水溶解并定容至10 mL容量瓶，置于4 ℃冰箱存儲備用。精密稱取內(nèi)標(biāo)地西泮1.02 mg，加水溶解并定容至1 mL容量瓶，置于4 ℃冰箱存儲備用。

1.3.3 柴胡提取物溶液[10]的配制：稱取柴胡1000 g，置圓底燒瓶中，精密加入適量70% 乙醇并加熱煮沸1 h后，置雙層網(wǎng)孔濾膜過濾，濾渣以相同方法提取2次，收集并合并濾液。所得濾液首先經(jīng)AB-8型大孔吸附樹脂純化，再用RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行濃縮，烘干至恒重，得到柴胡提取物(產(chǎn)量為柴胡經(jīng)烘干后質(zhì)量的18.5 %)。所得柴胡提取物置于4 ℃冰箱備用。精密稱取柴胡提取物50 mg于5 mL量瓶中，用熱水溶解，冷卻后定容至刻度，得10 mg/mL柴胡提取物溶液備用，每1 mL柴胡提取物相當(dāng)于0.054 05 g柴胡。

1.3.4 給藥與分組：本研究所用SD大鼠按照簡單抽樣的方法分實驗組與對照組，每組各10只，均在標(biāo)準(zhǔn)條件下(正常白晝交替，溫度為22～25 ℃)給予充足的食物和蒸餾水喂養(yǎng)。實驗組大鼠每天給予20 mg/kg的柴胡提取物，連續(xù)給藥2周，對照組的大鼠平行給予生理鹽水。

1.3.5 血漿樣品的采集：于第15天口服給予20 mg/kg的氯苯那敏溶液，分別在不同時間點(0、0.1、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24 h)取大鼠眼靜脈血液樣品約200 μL，置于預(yù)先肝素化的EP管中。將得到的血液樣品在5000 r/min下離心10 min，吸取上清液100 μL，放于-20 ℃冰箱存儲至分析。

1.3.6 血漿樣品的處理：采用液-液萃取的方法處理血漿樣品。SD大鼠眼靜脈采血約200 μL，置于肝素化的EP管中，以5000 r/min離心10 min，取上清液100 μL，并轉(zhuǎn)移至2 mL的EP管中，依次加入100 μL飽和碳酸鈉溶液，20 μL地西泮標(biāo)準(zhǔn)品溶液，1.5 mL乙酸乙酯︰正己烷(2:1，v/v)萃取液，渦旋混勻3 min，以5000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液1.4 mL，氮氣吹干，殘渣加入100 μL流動相復(fù)溶以12000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液進行LC-MS分析并計算氯苯那敏血藥濃度。

1.4 方法學(xué)考察

1.4.1 方法專屬性：將空白血漿樣品、氯苯那敏(0.25 μg/mL)和地西泮標(biāo)準(zhǔn)品(1.0 μg/mL)、加入氯苯那敏和地西泮的血漿樣品，按照選定的色譜條件進行LC-MS分析，記錄質(zhì)譜圖。

1.4.2 線性關(guān)系與檢測限：取空白血漿樣品100 μL，并轉(zhuǎn)移至2 mL的EP管中，依次加入100 μL飽和碳酸鈉溶液，20 μL地西泮標(biāo)準(zhǔn)品溶液，20 μL系列濃度的氯苯那敏標(biāo)準(zhǔn)品溶液，1.5 mL乙酸乙酯 ：正己烷(2:1，v/v)萃取液，渦旋混勻3 min，以5000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液1.4 mL，氮氣吹干，殘渣加入100 μL流動相復(fù)溶以12000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液進行LC-MS分析，氯苯那敏終濃度分別為0.1，0. 25，0.5，1，2.5，5，10，25，50 μg/mL。以氯苯那敏與內(nèi)標(biāo)(Y)的峰面積的比值為縱坐標(biāo)，以氯苯那敏的濃度(X, μg/mL) 為橫坐標(biāo)進行線性回歸分析。

1.4.3 精密度考察：配制濃度為0.25、2.5、25 μg/mL低、中、高3個濃度的氯苯那敏標(biāo)準(zhǔn)品及內(nèi)標(biāo)的血漿樣品，按上述方法進行血漿樣品的處理，在選定的色譜和質(zhì)譜條件下于1 d內(nèi)連續(xù)測定5次和連續(xù)測定3 d，評價測定方法的日內(nèi)和日間精密度(隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線同時測定)。以同一已知濃度的不同樣品測得值之間的RSD值作為日內(nèi)精密度，第1、2、3 d進行3批樣品的精密度測定，每批含低、中、高樣品各5份，計算日間精密度。

1.4.4 準(zhǔn)確度考察：配制濃度為0.25、2.5、25 μg/mL低、中、高3個濃度的氯苯那敏標(biāo)準(zhǔn)品及內(nèi)標(biāo)的血漿樣品，按上述方法進行血漿樣品的處理，在選定的色譜和質(zhì)譜條件下進行LC-MS分析，每個濃度在同一水平條件下平行5個樣品進行分析，以測得各樣品實際測定值的均值與加入標(biāo)準(zhǔn)品測定值計算回收率。

1.4.5 提取回收率：配制濃度為0.25、2.5、25 μg/mL低、中、高3個濃度的氯苯那敏標(biāo)準(zhǔn)品及內(nèi)標(biāo)的血漿樣品各5份，按上述方法進行血漿樣品的處理，在選定的色譜和質(zhì)譜條件下進行LC-MS分析，得到血漿樣品中氯苯那敏的平均峰面積與內(nèi)標(biāo)的平均的峰面積之比值(A1)。另取濃度為0.25、2.5、25 μg/mL低、中、高3個濃度的氯苯那敏標(biāo)準(zhǔn)品溶液各20 μL，加入20 μL的內(nèi)標(biāo)溶液和60 μL的甲醇溶液，在選定的色譜和質(zhì)譜條件下進行LC-MS分析，得到氯苯那敏的平均峰面積與內(nèi)標(biāo)的平均的峰面積之比值(A2)。血漿樣品中的氯苯那敏的提取回收率(%)= A1/A2×100%。

1.4.6 基質(zhì)效應(yīng)考察：精密吸取濃度為0.25、2.5、25 μg/mL低、中、高3個濃度的氯苯那敏標(biāo)準(zhǔn)品各20 μL，加入20 μL的內(nèi)標(biāo)溶液，氮氣吹干；另取空白血漿200 μL，按上述血漿樣品處理方法萃取后，取上清液1.4 mL加入揮干后的標(biāo)準(zhǔn)品試管中，渦旋混勻，氮氣吹干，100 μL流動相復(fù)溶后，在選定的色譜和質(zhì)譜條件下進行LC-MS分析，得到血漿樣品中氯苯那敏的平均峰面積與和內(nèi)標(biāo)的平均的峰面積之比值(A3)。血漿樣品中的氯苯那敏的基質(zhì)效應(yīng)(%)=A3/A2×100%。

1.4.7 穩(wěn)定性考察：配制濃度為0.25、2.5、25 μg/mL低、中、高3個濃度的氯苯那敏標(biāo)準(zhǔn)品及內(nèi)標(biāo)的血漿樣品，分別在室溫保存1 d考察室溫穩(wěn)定性；考察經(jīng)液-液萃取后的樣品在室溫放置1 d的穩(wěn)定性；-20 ℃保存1、2、3 d考察凍存條件下的穩(wěn)定性。按上述方法進行血漿樣品的處理，在選定的色譜和質(zhì)譜條件下進行LC-MS分析，考察樣品在室溫和凍存條件下的穩(wěn)定性。

1.4.8 血藥濃度及藥動學(xué)參數(shù)結(jié)果：將給藥組和對照組采集的血漿樣品按上述血漿樣品處理方法處理并進行LC-MS分析，計算兩組各時間點的氯苯那敏血藥濃度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用DAS 3.0藥物代謝動力學(xué)軟件對血藥濃度-時間數(shù)據(jù)進行房室模型分析，繪制血藥濃度-時間曲線，采用Graphpad Prism 5.01 軟件對氯苯那敏藥代動力學(xué)參數(shù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 方法專屬性 氯苯那敏與地西泮分離效果良好，且無內(nèi)源性干擾，見圖1。

圖1 血漿中氯苯那敏與內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜圖A：空白血漿；B：氯苯那敏+內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品；C：給藥血樣+內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品a：氯苯那敏；b：內(nèi)標(biāo)Fig. 1 MS profiles of chlorpheniramine and internal standardA:blank plasma;B: chlorpheniramine + internal standard; C:plasma + internal standard a:chlorpheniramine; b: internal standard

2.2 線性關(guān)系與檢測限 計算氯苯那敏在0.1～50 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好?；貧w方程為Y=0.0098X+0.1625，r=0.9934。氯苯那敏的檢測限(LOD)為0.002 μg/mL(S/N>3,n=5)，定量限(LLOQ)為0. 1 μg/mL。

2.3 精密度考察 結(jié)果顯示低、中、高樣品的日內(nèi)RSD分別為6.69 %，3.24 %，5.74 %，日間RSD分別為10.70 %，8.07%，9.82%，以上結(jié)果表明樣品測定的重現(xiàn)性良好。

2.4 準(zhǔn)確度考察 以測得各樣品實際濃度的均值與加入對照品濃度的比值作為回收率，經(jīng)計算低、中、高樣品的回收率

分別為95.36 %， 102.59 %，93.18 %，結(jié)果顯示回收率均在85%～115%之間，表明該分析方法準(zhǔn)確性良好，符合生物樣品分析檢測要求。

2.5 提取回收率 經(jīng)計算，3種濃度氯苯那敏血漿樣品的提取回收率分別為83.8%，76.8%，80.5%，符合相關(guān)要求。

2.6 基質(zhì)效應(yīng)考察 經(jīng)計算，3種濃度氯苯那敏血漿樣品的基質(zhì)效應(yīng)分別為95.2%，97.6%，96.0%(n=5)。結(jié)果表明本研究建立的方法無基質(zhì)效應(yīng)干擾。

2.7 穩(wěn)定性考察 結(jié)果表明室溫保存1 d后，低、中、高3個樣品的實際測得濃度與樣品濃度的比值分別為105.6%，100.2%，102.5 %(n=5)；經(jīng)液-液萃取的樣品在室溫下放置1 d后，低、中、高3個樣品的實際測得濃度與樣品濃度的比值分別為98.6%，95.2%，96.7%(n=5)；-20 ℃保存1、2、3 d后，低、中、高3個樣品的實際測得濃度與樣品濃度的比值分別在98.4%～107.1%，97.8%～ 108.6 %，96.8%～ 97.7%(n=5)之間。結(jié)果顯示穩(wěn)定性均在95%～115% 之間，表明樣品在室溫下保存1 d和-20 ℃保存3 d的過程中都較為穩(wěn)定。

2.8 血藥濃度及藥動學(xué)參數(shù)結(jié)果 血藥濃度-時間曲線見圖2，并采用Graphpad Prism 5.01 軟件計算氯苯那敏藥代動力學(xué)參數(shù)，見表1。

圖2 氯苯那敏給藥后的血藥濃度-時間曲線Fig.2 Plot of plasma concentration vs time after administered with chlorpheniramine

組別 AUC(0-t)(μg·h/mL)AUC(0-∞)(μg·h/mL)t1/2(h)Tmax(h)Cmax(μg/mL)CLint(L·kg/h)對照組0.81±0.160.87±0.253.09±0.161.50.81±0.2022.97±2.03實驗組1.29±0.271.40±0.277.04±1.481.51.44±0.2914.25±2.84

3 討論

柴胡為我國傳統(tǒng)中藥，在中國的臨床應(yīng)用歷史悠久。其具有鎮(zhèn)靜、解熱、抗炎、抗病毒、保肝、降血壓和抗腫瘤等多種藥理活性[12]。有文獻[13]報道，小柴胡湯對大鼠肝線粒體的單胺氧化酶有一定抑制作用。因此，當(dāng)柴胡藥物與其他藥物聯(lián)合使用時，很可能會發(fā)生藥物-藥物相互作用。馬來酸氯苯那敏主要用于治療打噴嚏、流涕等感冒癥狀，是第一代組胺 H1受體拮抗劑。臨床上常將柴胡藥物與馬來酸氯苯那敏聯(lián)合使用，用于治療感冒等癥狀。氯苯那敏在體內(nèi)主要由CYP2D6酶代謝[11]，當(dāng)柴胡提取物使CYP2D6酶活性受到影響時，體內(nèi)氯苯那敏的代謝清除率應(yīng)當(dāng)會發(fā)生變化[14]。因此，研究柴胡提取物與氯苯那敏是否存在相互作用具有重要意義。

將給藥組和對照組的動力學(xué)參數(shù)進行比較結(jié)果顯示，實驗組的AUC(0-∞)(1.40±0.27)μg·h/mL明顯高于對照組(0.87±0.25)μg·h/mL；而代謝清除率CLint(14.25±2.84)μg·h/mL明顯低于對照組 (22.97±2.03)L·kg/h(P<0.05)。實驗組和對照組的藥代動力學(xué)參數(shù)經(jīng)t檢驗， 發(fā)現(xiàn)平均AUC(0-∞)和體內(nèi)總體清除常數(shù)2組之間均存在統(tǒng)計學(xué)差異 (P<0.05)，其他藥代動力學(xué)參數(shù)(如Cmax, Tmax, t1/2)與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果分析表明給藥柴胡提取物后，大鼠體內(nèi)氯苯那敏的代謝受到抑制。文獻[11]報道，氯苯那敏主要經(jīng)由CYP2D6代謝，由此推斷，柴胡提取物可能是通過抑制CYP2D6的活性，從而抑制了氯苯那敏的代謝。因此柴胡與馬來酸氯苯那敏合用可能發(fā)生藥物-藥物相互作用。

研究結(jié)果表明，給藥柴胡提取物后大鼠體內(nèi)氯苯那敏的代謝受到了抑制。而氯苯那敏主要經(jīng)P450酶中的CYP2D6代謝。因此可推斷柴胡提取物對氯苯那敏代謝抑制原因可能柴胡提取物對CYP2D6產(chǎn)生抑制，進而抑制氯苯那敏的代謝。因此柴胡提取物對氯苯那敏的代謝存在抑制作用，當(dāng)柴胡與馬來酸氯苯那敏聯(lián)合使用時可能會發(fā)生藥物-藥物相互作用。這將為臨床上柴胡的合理化用藥提供理論依據(jù)。

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(編校：王冬梅)

Study of drug interaction betweenBupleurumsmithiiextracts and chlorpheniramine in rats

GAO Liu-liu,ZHANG Jing,XU Wai-lan,LI Yu-liang,GUO Yan-lei,YU ChaoΔ

(Institute of Life Sciences, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China)

ObjectiveTo investigate the drug-drug interaction betweenBupleurumsmithiiextract and chlorpheniramine in rats.Methods20 SD rats were randomized into two groups. 10 SD rats in experimental group were orally administered withBupleurumsmithiiextract (20 mg/kg) once a day for two weeks and the other 10 rats in control group were orally administered with normal saline. On the 15th day, 20 SD rats were orally administered with chlorpheniramine.200 μL plasma samples were collected at(0,0.1,0.5,1,1.5,2,3,4,6,8,10,12,24 h) different time points. Plasma concentrations of chlorpheniramine were detected by LC-MS and pharmacokinetic parameters of 2 groups were calculated using Graphpad prism 5.01.ResultsThe AUC(0-∞)of experimental group[1.40±0.27(μg·h)/mL]was higher than that of control group[0.87±0.25(μg·h)/mL], while the CLintof experimental group[14.25±2.84(L·kg)/h]was obviously lower than that of control group[22.97±2.03(L·kg)/h](P< 0.05). ConclusionThese results demonstrates that Bupleurum smithii extract can decrease the CLintof chlorpheniramine, clinical medication should try to avoid combination of 2 drugs.

Bupleurumsmithiiextract; chlorpheniramine; CYP2D6; interaction

國家自然科學(xué)基金(81370403)

高柳柳，女，碩士，研究方向：藥物代謝與動力學(xué)E-mail：coucoi1234@sina.com；于超，通訊作者，男，博士，教授，研究方向：藥物代謝與動力學(xué)，E-mail：yuchaom@163.com。

R969

A

1005-1678(2015)02-0165-04