方超，李晴，魯美麗，黃國(guó)興，楊菁

(遼寧醫(yī)學(xué)院 遼寧省心腦血管藥物基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 錦州 12100)

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肌肽對(duì)大鼠腦片缺氧缺糖/再灌損傷的保護(hù)作用

方超，李晴，魯美麗，黃國(guó)興，楊菁Δ

(遼寧醫(yī)學(xué)院 遼寧省心腦血管藥物基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 錦州 12100)

目的 在離體腦片缺氧缺糖/再灌損傷模型上，評(píng)價(jià)肌肽對(duì)腦組織的保護(hù)作用。方法 肌肽預(yù)處理后，用缺氧缺糖/再灌(oxygen glucose deprivation/reperfusion，OGD/RP)來(lái)制備大鼠離體腦片損傷模型。以2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride，TTC)染色法檢測(cè)腦片活性；HPLC法檢測(cè)海馬腦片中ATP、ADP、AMP含量；熒光法檢測(cè)腦組織活性氧(reactive oxygen species，ROS)。 結(jié)果 與對(duì)照組相比，缺氧缺糖/再灌損傷可以明顯損傷大鼠海馬腦片，TTC染色顏色變淺，A490 nm明顯下降，ATP和ADP含量明顯降低，而AMP含量明顯升高，ROS明顯升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組相比，缺氧缺糖/再灌損傷前預(yù)先加入1000、200、40 μg/mL肌肽預(yù)處理15 min可顯著抑制缺氧缺糖/再灌引起的損傷，TTC染色顏色加深，A490 nm明顯升高，ATP、ADP、AMP含量升高，ROS含量降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論 肌肽可減輕缺氧缺糖/再灌導(dǎo)致的損傷，其機(jī)制可能與其改善腦組織能量代謝，增強(qiáng)抗氧化能力有關(guān)。

肌肽；腦片；缺氧缺糖/再灌注損傷；能量代謝；氧化應(yīng)激

腦缺血在臨床上較多見(jiàn)，多發(fā)生于心臟呼吸驟停、重癥休克等造成的腦部血流低灌注。隨著急救水平的提高，搶救成功后繼發(fā)腦缺血再灌成為研究重點(diǎn)。因此，篩選出具有相關(guān)療效的藥物已經(jīng)成為21 世紀(jì)世界生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[1]。

肌肽是一種由β-丙氨酸和L-組氨酸組成的水溶性二肽，主要存在于脊柱動(dòng)物的骨骼肌中，在腦組織及心肌中含量也很高[2-3]。肌肽是目前為止發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)最為簡(jiǎn)單的生物活性肽之一，具有抗氧化、抗炎、清楚自由基、免疫調(diào)節(jié)等功能[4-5]。

本研究通過(guò)制備缺糖缺氧/再灌損傷大鼠海馬組織模型，觀察肌肽對(duì)腦片缺糖缺氧/再灌損傷的影響，探討肌肽的保護(hù)作用及可能機(jī)制，為其治療缺血性腦血管疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性SD大鼠4只，體質(zhì)量90～110 g，由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(遼)2011～2018。

1.1.2 試劑與藥物：肌肽(純度≥99%)、ATP、ADP、AMP、二甲基亞砜(DMSO)均購(gòu)自Sigma公司；2，3，5-三苯基氯化四氮唑，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；色譜甲醇購(gòu)自天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器：LC-10Avp高效液相色譜儀購(gòu)自日本島津公司。熒光酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)PerkinElmer公司。ZQP-86型振動(dòng)切片機(jī)購(gòu)自上海之信儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型的制備及分組[6-7]：每次取SD大鼠2只，用頸部脫臼方法處死后，迅速取出海馬，放入預(yù)冷的人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF)中。將海馬橫切為350 μm腦片。迅速將腦片放到4 ℃并預(yù)先通以混合氧氣(95%O2+5% CO2)的ACSF中恢復(fù)1 h。然后將腦片轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，用預(yù)先通以混合氧氣飽和的ACSF灌流，流速0.5 mL/min，溫度(35.0±0.5) ℃。穩(wěn)定30 min后將腦片進(jìn)行隨機(jī)分組，每組含12片腦片。對(duì)照組，繼續(xù)用預(yù)先通以混合氧氣飽和的ACSF灌流2 h45 min。模型組，繼續(xù)用預(yù)先通以混合氧氣飽和的ACSF灌流15 min后，再用預(yù)先通以混合氮?dú)?95%N2+5%CO2)的無(wú)糖ACSF孵育30 min，隨后恢復(fù)為混合氧氣飽和的ACSF灌流2 h。肌肽保護(hù)組，分別用預(yù)先通以混合氧氣飽和內(nèi)含1000、200、40 μg/mL肌肽的ACSF灌流15 min，隨后應(yīng)用預(yù)先通以混合氮?dú)?95%N2+5% CO2)的飽和內(nèi)含1000、200、40 μg/mL肌肽的無(wú)糖ACSF孵育30 min，隨后恢復(fù)為混合氧氣飽和的ACSF灌流2 h。單純肌肽組，用預(yù)先通以混合氧氣飽和內(nèi)含1000 μg/mL肌肽的ACSF灌流45 min，隨后恢復(fù)為混合氧氣飽和的ACSF灌流2 h。

ACSF的成分如下：NaCl：124 mmol/L；KCl：4.4 mmol/L；CaCl2：2.5 mmol/L； MgSO4：1.3 mmol/L；NaH2PO4：1 mmol/L； NaHCO3：26 mmol/L；葡萄糖：10 mmol/L[6]。

無(wú)糖ACSF的成分，將ACSF中的葡萄糖換成等摩爾濃度的蔗糖。

需按以上方法重復(fù)制備模型，模型結(jié)束后樣品分別用于TTC染色、ATP、ADP和AMP含量及活性氧的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)一次。

1.2.2 檢測(cè)指標(biāo)

① TTC染色：每組取4片腦片，與1.5 mL 2% 2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride，TTC)溶液在 35 ℃條件下避光孵育30 min后，取出，生理鹽水漂洗后拍照。然后再用濾紙吸去表面水分，稱濕重后每個(gè)單獨(dú)以每克腦片20 mL的比例加入抽提液(乙醇:二甲亞砜=1:1)，避光24 h，按皮質(zhì)腦片每孔200 μL，海馬腦片每孔100 μL的量加入到96孔板，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在490 nm處吸光度值(A490 nm)。損傷后腦片TTC染色的A490 nm值下降，按下列公式計(jì)算組織損傷百分率：組織損傷百分率=(1-A損傷/A對(duì)照) ×100%[8]。

② 海馬組織ATP、ADP和AMP含量測(cè)定：每組取海馬腦片4片，濾紙吸干后稱重，加4 ℃預(yù)冷的0.4 mmol/L的高氯酸1 mL，于超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)中粉碎，制成勻漿。15000×g，4 ℃，離心30 min。取上清液，加入4 ℃預(yù)冷的2.0 mmol/L氫氧化鈉溶液200 μL?；靹蚝?，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即為供試品溶液。采用Kromasil C18色譜柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫33 ℃。檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。流動(dòng)相為100 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH為6.5。進(jìn)樣 2 μL。采用外標(biāo)法定量。

③ 腦組織活性氧ROS的檢測(cè)：取海馬腦片4片，按照每100 mg加入1 mL的組織勻漿液比例加入組織勻漿液， 用超聲組織勻漿器在4 ℃，冰浴勻漿，12000×g 離心10 min取上清液， 用BCA試劑盒測(cè)定其蛋白濃度。取腦組織勻漿上清液190 μL，加入1 mmol/L DCFH-DA 探針10 μL， 同時(shí)用10 μL PBS代替探針的本底作為對(duì)照?；靹蚝?7 ℃孵育30 min， 熒光酶標(biāo)儀測(cè)定熒光值(激發(fā)波長(zhǎng)484 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm)。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出最終結(jié)果， 即pmol DCF formed/min/mg(protein)[9]。

2 結(jié)果

2.1 肌肽對(duì)TTC法檢測(cè)的缺氧缺糖/再灌腦片損傷程度的影響 從TTC染色的照片可以看出，對(duì)照組腦片被染成紅色，而模型組顏色明顯變淺，說(shuō)明正常組腦片代謝正常，模型組的損傷程度明顯。隨著肌肽濃度的升高，肌肽保護(hù)組腦片的顏色加深，說(shuō)明肌肽對(duì)缺氧再灌損傷具有保護(hù)作用。單純肌肽組染色的程度略高于對(duì)照組。見(jiàn)圖1。

圖1 肌肽對(duì)海馬腦片缺血缺氧/再灌損傷TTC染色的影響A：對(duì)照組； B：模型組；C：1000 μg/mL肌肽保護(hù)組；D：200 μg/mL肌肽保護(hù)組；E：40 μg/mL肌肽保護(hù)組；F：?jiǎn)渭兗‰慕MFig.1 Effect of carnosine on the TTC staining of oxygen-glucose deprivation/reperfusion induced brain slicesA:Control group; B:Model group; C:1000 μg/mL carnosine protection group; D:200 μ g/mL carnosine protection group; E:40 μg/mL carnosine protection group; F:Simple carnosine group

從A490nm的吸光度值來(lái)看，模型組的吸光度值明顯降低，缺氧再灌對(duì)腦片組織的損傷率為56%。肌肽保護(hù)組的組織損傷率明顯降低(P<0.01)。單純肌肽組吸光度比對(duì)照組的吸光度增加了6%。見(jiàn)表1。

組別肌肽(μg/mL)A490nm損傷率(%)對(duì)照組—0.33±0.02 0模型組—0.19±0.02**56肌肽保護(hù)組10000.33±0.01##42000.32±0.02*##6400.26±0.01**##27單純肌肽組10000.35±0.01##-6

**P<0.01， 與對(duì)照組相比，compared with control group；##P<0.01， 與模型組相比，compared with model group

2.2 肌肽對(duì)缺氧缺糖/再灌損傷海馬腦片ATP、ADP和AMP含量的影響 與對(duì)照組相比較，模型組腦組織中ATP、ADP含量顯著降低(P<0.01)，而單純肌肽組含量明顯升高(P<0.01、P<0.05)。與模型組相比，肌肽保護(hù)組腦組織中ATP、ADP含量均明顯升高(P<0.01)，ATP、ADP含量隨著肌肽劑量的增加而增加。與對(duì)照組相比較，模型組腦組織中AMP含量顯著升高(P<0.01)，單純肌肽組含量變化不明顯。與模型組相比，肌肽保護(hù)組腦組織中AMP含量均明顯升高(P<0.01)，AMP含量隨著肌肽劑量的增加而增加。見(jiàn)表2。

表2 肌肽對(duì)缺氧缺糖/再灌損傷海馬腦片ATP、ADP和AMP含量的影響Tab.2 Effects of carnosine on ATP,ADP and AMP content of OGD rat hippocampal slices ±s)

**P<0.01，與對(duì)照組比較，compared with control group；#P<0.05，##P<0.01，與模型組比較，compared with model group

2.3 肌肽對(duì)缺氧缺糖/再灌損傷海馬腦片ROS含量的影響 與對(duì)照組相比，模型組腦組織ROS含量顯著升高(P<0.01)，單純肌肽組組織ROS含量降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組相比，肌肽保護(hù)組ROS含量明顯降低，隨著肌肽含量的增加，ROS含量降低的更加明顯。結(jié)果表明肌肽可以明顯抑制腦組織ROS的產(chǎn)生。見(jiàn)表3。

表3 肌肽對(duì)缺氧缺糖/再灌損傷海馬腦片ROS含量的影響±s，n=8)Tab.3 Effects of carnosine on ROS content of OGD rat hippocampal slices ±s,n=8)

*P<0.05，**P<0.01，和對(duì)照組比較，compared with control group；#P<0.05，##P<0.01，與模型組相比，compared with injury group

3 討論

由于離體腦片保持了腦組織形態(tài)學(xué)完整性，因此具有在體實(shí)驗(yàn)的特點(diǎn)，同時(shí)它又克服了在體實(shí)驗(yàn)，如血管或者其它整體系統(tǒng)，難于控制的缺點(diǎn)，因此越來(lái)越多地被用于腦功能和藥物作用機(jī)制的研究[10]。TTC是無(wú)色的化合物，可以被細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原成紅色的結(jié)晶產(chǎn)物，應(yīng)用它來(lái)染色及提取后的比色測(cè)定已被有效的應(yīng)用在檢測(cè)腦片的損傷程度方面[11]。選擇缺糖缺氧30 min，復(fù)氧2 h來(lái)制備腦片損傷模型，結(jié)果表明，和對(duì)照組相比，TTC的染色后模型組染色明顯減輕，可見(jiàn)模型組損傷明顯。和模型組相比，肌肽保護(hù)組腦片染色隨著肌肽含量逐步升高，顏色逐漸加深，說(shuō)明肌肽對(duì)缺糖缺氧再灌造成的損傷具有保護(hù)作用。在此基礎(chǔ)上，對(duì)染色的腦片進(jìn)行了有機(jī)提取，并測(cè)定提取液在490 nm的吸光度，結(jié)果表明，模型組腦組織損傷率為56%，而1000、200、40 μg/mL肌肽保護(hù)組的損傷率分別降低為4%、6%和27%，該結(jié)果和目測(cè)腦片的顏色結(jié)果相似，但結(jié)果更加量化。

能量代謝障礙是腦缺血損傷的基礎(chǔ)。ATP和ADP均為高能磷酸化合物，為腦組織的主要能量來(lái)源。AMP為ADP和ATP的主要分解產(chǎn)物。肌肽可以降低培養(yǎng)的皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞氧氣的消耗量，而在缺氧的情況下提高ATP的含量[12]。和對(duì)照組相比，模型組腦片組織ATP和ADP的含量顯著降低，而AMP的含量明顯升高。這些變化與缺氧缺糖有關(guān)，物質(zhì)代謝的原料葡萄糖含量減少，代謝途徑也由有氧氧化轉(zhuǎn)換成糖酵解。和模型組相比，肌肽保護(hù)組的ATP、ADP和AMP的含量均明顯升高，說(shuō)明不同濃度的肌肽均可改善腦組織能量代謝，該結(jié)果和文獻(xiàn)相似[11]。

氧化應(yīng)激是指機(jī)體活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生過(guò)多或清除能力，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致潛在性損傷的病理過(guò)程。其中ROS 包括超氧陰離子、過(guò)氧化氫和羥自由基等。氧化應(yīng)激損傷是腦缺血/再灌注損傷的重要原因[13]。ROS能與生物膜中不飽和脂肪酸形成過(guò)氧化脂質(zhì)，引起細(xì)胞膜損傷。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，模型組ROS含量明顯升高；而肌肽可以抑制缺血缺氧再灌引起的ROS的升高。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，肌肽能夠減輕缺氧缺糖/再灌所致大鼠海馬腦片損傷，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，從而改善腦組織的能量代謝，這可能是肌肽發(fā)揮保護(hù)的主要機(jī)制。本研究也為肌肽的進(jìn)一步應(yīng)用提供了重要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

[1] Wang Y, Jia J,Ao G,et al. Hydrogen sulfide protects blood-brain barrier integrity following cerebral ischemia[J].J Neurochem,2014,129(5):827-838.

[2] Boldyrev AA, Aldini G, Derave W. Physiology and pathophysiology of carnosine[J].Physiol Rev，2013, 93(4):1803-1845.

[3] 楊菁，吳國(guó)強(qiáng)，白劍，等.鄰苯二甲醛柱前衍生化高效液相色譜法測(cè)定組織中肌肽含量[J].中國(guó)生化藥物雜，2009,30(4)：258-260.

[4] Albayrak S, Atci IB, Kalayci M, et al. Effect of carnosine, methylprednisolone and their combined application on irisin levels in the plasma and brain of rats with acute spinal cord injury[J]. Neuropeptides, 2015，52(1):47-54.

[5] 李宗澤，楊清俊，朱艷凌，等. 肌肽對(duì)高糖誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用[J].中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,2013,27(5):795-800.

[6] De La Cruz JP, Del Rio S, Arrebola MM, et al al.Effect of virgin olive oil plus acetylsalicylic acid on brain slices damage after hypoxia-reoxygenation in rats with type 1-like diabetes mellitus[J]. Neurosci Lett， 2010,471(2):89-93.

[7] Huang X, Li Q, Zhang Y, et al. Neuroprotective effects of cactus polysaccharide on oxygen and glucose deprivation induced damage in rat brain slices[J]. Cell Mol Neurobiol,2008,28(4):559-568.

[8] Yu BW,Xue QS,Xia M,et al. The influence of propofol on diferent kinds of brain injuries in rat brain slices[J].Natl Med J China,2003,83(10):1176-1179.

[9] Shinomol GK, Muralidhara. Differential induction of oxidative impairments in brain regions of male mice following subchronic consumption of Khesari dhal (Lathyrus sativus) and detoxified Khesari dhal [J]. Neurotoxicology, 2007, 28(4): 798-806.

[10] Taylor CP, Burke SP, Weber ML.Hippocampal slices: glutamate overflow and cellular damage from ischemia are reduced by sodium-channel blockade[J]. J Neurosci Methods,1995,59(1): 121-128.

[11] Preston E, Webster J. Spectrophotometric measurement of experimental brain injury[J].J Neurosci Methods, 2000, 94(2):187-192.

[12] Shen Y, Tian Y, Yang J, et al. Dual effects of carnosine on energy metabolism of cultured cortical astrocytes under normal and ischemic conditions[J]. Regul Pept, 2014,192-193:45-52.

[13] Candelario-Jalil E. Injury and repair mechanisms in ischemic stroke: considerations for the development of novel [J]. Curr Opin Investig Drugs, 2009,10(7): 644-654

(編校：譚玲)

Neuroprotective of carnosine on oxygen-glucose deprivation/reperfusion induced injury in rat brain slices

FANG Chao, LI Qing, LU Mei-li, HUANG Guo-xing, YANG JingΔ

(Provincial key laboratory of cardiovascular and cerebrovascular drug basic research, Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, China)

ObjectiveTo investigate effect of carnosine on oxygen glucose deprivation/reperfusion (OGD/RP) induced injury in rat brain slices.MethodsInjury of brain slices was determined by TTC methods.The contents of ATP, ADP and AMP were determined by high performance liquid chromatography.Reactive Oxygen species (ROS) were determined by fluorescence methods.ResultsCompared with control group, rat hippocampal slices were significantly damaged by OGD/RP, indicated by light color and decreased A490 nmvalue of TTC staining.Meanwhile the contents of ATP and ADP were significantly decreased, and the content of AMP and ROS were significantly increased, the difference between two group was significant (P<0.01).Pre-incubation with Carnosine (1000, 200, 40 μg/mL) significantly inhibited the light color and decreased A490 nmvalue of TTC staining, increased the contents of ATP, ADP and AMP, and decreased the content of ROS, the difference between two group was significant (P<0.01).ConclusionCarnosine can protect rat hippocampal slices against injury induced by OGD/RP, which may relate to improve the energy metabolism and strengthen the ability of anti-oxidative stress.

carnosine; brain slices; OGD/RP ; energy metabolism; oxidative stress

遼寧省科技項(xiàng)目(2013225305)；遼寧醫(yī)學(xué)院“校長(zhǎng)基金”奧鴻博澤基金醫(yī)藥創(chuàng)新基金(XZJJ20130103-01)

方超，男，學(xué)士，研究方向：生化藥物，E-mail：fangchao.loving@qq.com；楊菁，通訊作者，男，博士后，教授，研究方向：神經(jīng)生物學(xué)及相關(guān)藥物，E-mail：jzyj126@126.com。

R963, R971

A

1005-1678(2015)09-0041-04