吳群英 莫小梅 黃嵐珍 王凌宇 黃 江 肖福英

（桂林醫(yī)學院生物技術學院，廣西 桂林 541004）

白褲瑤是瑤族中民族特色保留較為完整的支系之一，自稱“努格勞”，因其男子穿及膝的白褲而得名“白褲瑤”,主要集居在廣西南丹縣和貴州荔波縣相接壤的里湖瑤族鄉(xiāng)、八圩瑤族鄉(xiāng)和瑤山瑤族鄉(xiāng)等地[1]。人類線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)是一個由16569個堿基組成的閉合環(huán)狀雙鏈分子，由于母系遺傳的特性，缺乏重組、進化速率高、群體內變異大等特點，而被廣泛地應用于人類群體的起源、演化和親緣關系以及疾病的遺傳的研究。本文采用聚合酶鏈反應(PCR）技術及DNA測序法對廣西南丹白褲瑤族mtDNA D-Loop HVRⅠ區(qū)進行了研究,為少數(shù)民族群體遺傳學研究提供新的數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

31名體檢健康的白褲瑤樣本均采自廣西河池市南丹縣，彼此間無親緣關系，3代均為白褲瑤族，所有研究對象均知情同意。

1.2 mtDNA的提取

用消毒棉簽刮取口腔黏膜細胞，浸泡于生理鹽水中，將采集口腔黏膜細胞的棉簽用生理鹽水把口腔細胞清洗出來于1.5mlEP管中，進行13000 rpm，離心15min，小心棄去上清，然后加入200ul 10%chelex100樹脂，56℃水浴30min，取出后振蕩5-10s,100℃水浴 10min，離心3min，4℃保存，上清用于PCR擴增。

1.3 HVRⅠ區(qū)的PCR擴增

PCR反應總體積為 50ul，引物各 1 umol/L,上游引物：5’-TTAACTCCACCA -TTACCACC -3’， 下 游 引 物 ：5’ -GAGGATGGTGGTCAAGGGAC-3’（由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，擴增片段長度為 440bp），2×Taq PCR Master Mix 25ul,DNA模板5ul，去離子水補足50 ul。反應條件：94℃預變性1min，94℃變性30s，58℃退火 30s，72℃延伸 30s，30個循環(huán)后 72℃延伸 10min。

1.4 PCR產物的檢測及測序

每個樣品均取10μl PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色觀察擴增結果；40ulPCR產物委托上海立菲生物技術有限公司進行測序。

1.5 統(tǒng)計學分析

測序結果與劍橋標準Anderson序列比較，統(tǒng)計變異位點及變異類型。按照公式P=∑x2(x為每個個體單倍型頻率)計算偶合概率,按公式h=(1-∑x2)n/(n-1)(n為樣本含量)計算基因變異度。

2 結果

2.1 HVRⅠ區(qū)的PCR擴增

用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物大小及純度，結果表明，31例白褲瑤樣本均成功擴增，擴增片段大小為440bp（見圖1）。

圖1 HVR I區(qū)的PCR擴增電泳結果

2.2 HVRⅠ區(qū)的多態(tài)性

將31例白褲瑤族HVRⅠ區(qū)的PCR擴增產物測序后，所得的核苷酸序列分別與Anderson標準序列進行比較，共檢測出88個突變位點，其中以堿基置換為主，包括30個堿基轉換，57個堿基顛換，1個堿基缺失，1個堿基插入。堿基顛換明顯高于堿基轉換、插入及缺失，堿基顛換占總堿基變異的64.77%，其中A-C的顛換占總堿基變異的39.44%（見圖 2）。

圖2 HVRⅠ區(qū)測序的核苷酸序列與Anderson標準序列對比結果

2.3 HVRⅠⅠ區(qū)基因變異度和偶合概率結果

按照公式P=∑x2(x為每個個體單倍型頻率)計算偶合概率,公式h=(1-∑x2)n/(n-1)(n為樣本含量)計算基因變異度[2]。計算得出偶合概率為0.25，基因變異度分別為1.00。由此說明，廣西白褲瑤族線粒體DNA HVRⅠ區(qū)具有較高的序列多態(tài)性。

2.4 mtDNA HVRⅠ區(qū)14bp高變結構域

Anderson序列在16180-16193位置有一個14bp富含C的高變結構域,連續(xù)9個C被16189位點的T隔開,其長度及序列因受堿基插入、缺失、轉換、顛換等影響而出現(xiàn)個體間序列多態(tài)性,該區(qū)域也具有典型的人類學特征。本研究出現(xiàn)3種單倍型,分別為：AAAACCCCCTCCCC(2個),AAAACCCCCTCCTC（1 個),AACCCCCCCCCCCC(1 個)。

3 討論

線粒體DNA D-loop環(huán)區(qū)在人類學研究上是非常有價值的DNA區(qū)段,比較研究相應區(qū)段的序列間差異和變異速率,可以獲得豐富的進化信息,為人類起源、進化和人群的遷移提供可靠的遺傳信息。本研究選擇廣西白褲瑤族群體進行線粒體HVRⅠ區(qū)序列分析,研究結果表明在線粒體DNA HVRⅠ區(qū)有多個堿基突變,這表明廣西白褲瑤線粒體DNA HVRⅠ區(qū)具有高度序列多態(tài)性,可以作為法醫(yī)學個體識別的遺傳標記。從廣西白褲瑤族線粒體DNA HVRⅠ區(qū)堿基突變類型來看，突變以堿基顛換為主，然而HVRⅢ區(qū)堿基突變卻是以堿基轉換為主,以嘧啶(T-C)之間的轉換最多,這個結果支持mtDNA的突變是由于DNA在復制時錯配所造成[3]。

本研究中發(fā)現(xiàn)白褲瑤族的有些位點與其他東亞人群間確實存在差異,白褲瑤族人在nt16093及nt16183位置分別出現(xiàn)T-C和A-C堿基替換,而中國漢族人[5]、日本人[6]、朝鮮人[7]卻未發(fā)現(xiàn)上述部位的堿基突變,表明白褲瑤族在進化過程中保留了其獨特的遺傳特征。此外,由于nt16189位出現(xiàn)T-C堿基轉換導致nt16180-16193區(qū)域形成的的poly-C(C重復)序列,日本人[6]、朝鮮人[7]分別有16、19種單倍型,白褲瑤族只有3種。白褲瑤族單倍型少,是否與樣本量有關,還需要進一步證實。

［1］田培燕,陳應康,羅惠,等.白褲瑤人群12對遺傳性狀的基因頻率[J].現(xiàn)代預防醫(yī)學,2009,36(8).

［2］Tajima F.Statistical method for testing the neutral mutation hypothesis by DNA polymorphism[J].Genetics,1989,123:585-595.

［3］Bendall KE,Sykes BC.Length heteroplasmy in the first hypervariable segment of the human mtDNA control region[J].Am J Hum Genet,1995,57(2):248-256.

［4］劉雅誠,嚴江偉,唐暉,等.中國5個民族 mtDNA(CA)n重復的多態(tài)性[J].中國法醫(yī)學雜志,2003,18(1):37-38.

［5］Nishimaki Y,Sato K,Fang L,etal.Sequence polymorphism in the mtDNA HVS-I region in Japanese and Chinese[J].Legal Med,1999,1(4):238-249.

［6］Horai S,Hayasaka K.Intraspecific nucleotide sequence differences in the major noncoding region of human mitochondria DNA[J].Am J H um Gen et,1990,46(4):828-842.

［7］Lee SD,Shin CH,Kim KB,etal.Sequence variation of mitochondrial DNA control region in Korean s[J].Forensic Sci Int,1997,87(2):99-116.

［8］Poulton J,Luan J,Macaulay V,et al.Type 2 diabetes is associated with a common mitochondrial variant:evidence from a population-based case-control study[J].Hum Mol Genet,2002,Jun 15,11(13):1581-1583.