邱軍，張子威，樊瑞鋒，王冠菊，徐世文*

呼倫貝爾地區(qū)豬源大腸桿菌血清型鑒定與耐藥基因檢測

邱軍1,2，張子威1，樊瑞鋒1，王冠菊2，徐世文1*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，哈爾濱150030；2.內(nèi)蒙古扎蘭屯農(nóng)牧學校，內(nèi)蒙古扎蘭屯162650）

為了解呼倫貝爾地區(qū)豬大腸桿菌血清型與耐藥基因情況，研究于2013～2014年從8個規(guī)模化豬場分離、鑒定出108株致病性大腸桿菌。對分離菌株進行血清型鑒定，確定以O8、O9、O149、O157為主，分屬8個血清型的97株大腸桿菌菌株。研究采用PCR方法檢測四環(huán)素類耐藥基因（tetA、tetB、tetC、tetD）、大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因（ermB、ermC、ermF）、以及β-內(nèi)酰胺類耐藥基因（blaSHV-1、blaCTX-M、blaTEM）共10種耐藥基因。結果顯示，108株分離菌株中檢測出5種耐藥基因（tetA、tetB、ermB、blaCTX-M、blaTEM），與GenBank中相應基因有很高的同源性。

豬；大腸桿菌；血清型；耐藥基因

臨床中常見的仔豬黃痢、白痢和豬水腫病均是由豬大腸桿菌引起，由于該病發(fā)病率與死亡率較高[1]，給養(yǎng)豬業(yè)造成經(jīng)濟損失。大腸桿菌血清型較多，預防此病的疫苗間交叉免疫保護力較低，給臨床有效防控帶來難度。當豬群感染大腸桿菌病時，治療以抗菌藥物為主，由于抗菌藥物的不規(guī)范使用和濫用，使豬大腸桿菌對抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性，甚至多重耐藥性[2]。細菌耐藥性嚴重威脅人類與動物健康[3]。本研究對呼倫貝爾地區(qū)豬源樣品進行大腸桿菌血清型鑒定以及耐藥基因檢測和分析，以期為該地區(qū)豬大腸桿菌病有效防控提供科學依據(jù)與理論參考。

1 材料與方法

1.1 病料來源

2013～2014年從呼倫貝爾地區(qū)8個規(guī)?；i場，用無菌棉拭子采集腹瀉仔豬直腸內(nèi)容物或腹瀉死亡仔豬剖檢小腸內(nèi)容物樣本136份，病料樣本分別單獨裝于滅菌的10 mL EP管中，放入帶冰保溫箱中帶回，24 h內(nèi)進行細菌分離培養(yǎng)。

1.2 試劑與儀器

營養(yǎng)肉湯、普通瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂（MacConkey agar）、伊紅美藍瓊脂（EMB agar）購于北京奧博星生物技術有限責任公司；革蘭氏染液購于南京建成生物技術有限公司；腸桿菌科細菌生化編碼鑒定管購于杭州天和微生物試劑有限公司；大腸桿菌標準抗“O”抗原單因子血清購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；質(zhì)控菌E.coli ATCC25922購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；細菌基因組DNA提取試劑盒購于上海生工公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒購于愛思進生物技術（杭州）有限公司；質(zhì)粒小量抽提試劑盒（FastPlasmid Mini kit）購于康為世紀生物科技有限公司。EasyTaq PCR SuperMiX、Trans2K?DNA Marker購于北京全世金生物技術有限公司；DL500 DNA Marker購于大連TaKaRa公司。

1.3 試驗動物

體質(zhì)量18～22 g小白鼠，雌雄各半，由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。

1.4 細菌分離鑒定

①細菌分離。將采樣的棉拭子與小腸內(nèi)容物樣本加入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12 h，取少量菌液接種于麥康凱瓊脂平板上，正置30 min后，倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待麥康凱瓊脂平板上形成分布均勻的粉紅色菌落后，挑取典型菌落進行純培養(yǎng)和鑒定。②革蘭氏染色、鏡檢。挑取經(jīng)純化后的待檢單個典型圓潤粉紅色菌落接種于MH肉湯中，37℃培養(yǎng)12 h，取一接種環(huán)菌液進行固定、革蘭氏染色與鏡檢。③培養(yǎng)特性觀察。待檢菌純化后分別接種于麥康凱、伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12 h，觀察菌落形態(tài)以及培養(yǎng)基顏色變化。④生化試驗。將純化好的細菌參照文獻[4]方法進行MR、吲哚、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、阿拉伯糖、VP、尿素酶、硫化氫、氧化酶、硝酸鹽、檸檬酸鹽等生化試驗，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察結果。

1.5 致病性試驗

已鑒定的大腸桿菌分別接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)12 h，然后將培養(yǎng)液以4 000 r·min-1離心20 min，將離心細菌沉淀物用等量滅菌生理鹽水配制懸浮液作攻毒用。將分離菌株懸浮液分別給每只小白鼠腹腔注射0.2 mL，注射后6 h觀察1次。對死亡小白鼠進行剖檢，取肝臟，抹片，進行革蘭氏染色、鏡檢。另設健康小白鼠10只，注射相同劑量生理鹽水作對照組。

1.6 血清型鑒定

按大腸桿菌屬診斷血清使用說明書要求，取分離好菌落接種麥康凱瓊脂，37℃培養(yǎng)24 h，制作濃縮菌液，破壞其K抗原（121℃高壓滅菌2 h）。在潔凈載玻片上將制成的抗原與大腸桿菌標準抗“O”抗原單因子血清混勻，輕輕搖動載玻片。判定標準如下：2 min內(nèi)呈現(xiàn)明顯凝集現(xiàn)象的為陽性，呈均勻混濁的為陰性。出現(xiàn)陽性結果時以生理鹽水作對照試驗。

1.7 耐藥基因檢測

1.7.1 質(zhì)粒DNA提取

按說明書采用細菌基因組快速提取細菌DNA試劑盒，質(zhì)粒小量抽提試劑盒（Fast Plasmid Mini kit）提取質(zhì)粒DNA。

1.7.2 目的基因PCR擴增

本研究參照文獻[5-9]報道序列設計10對耐藥基因特異性PCR引物，有四環(huán)素類耐藥基因（tetA、tetB、tetC、tetD），大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因（ermB、ermC、ermF）、以及β-內(nèi)酰胺類耐藥基因（bla SHV-1、blaCTX-M、blaTEM），引物由上海生工公司合成（見表1）。PCR體系選取25 μL反應體系：即模板cDNA 2.0 μL，上下游引物各1 μL（10 pmol·μL-1），混合Tag酶9.5 μL，加入滅菌雙蒸水至25 μL。PCR反應條件為：95℃預變性5 min，94℃變性30 s，按各引物Tm值退火30 s，72℃延伸2 min，35個循環(huán)，72℃延伸10 min。取PCR反應產(chǎn)物5 μL，于3.0%瓊脂糖凝膠中電泳，成像拍照以檢測擴增效果。1.7.3基因克隆、鑒定及序列測定

表1 引物序列及目的片段長度Table 1Primer sequences and the length of destination fragment

將獲得的PCR產(chǎn)物，用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒純化后，連接到pMD-18T載體上，10 μL連接體系：PCR產(chǎn)物4.5 μL，pMD-18T載體0.5 μL，Ligation Mix 5 μL，于16℃連接2 h。連接產(chǎn)物轉化到感受態(tài)細胞TG1，經(jīng)過Amp+篩選，挑取單個菌落于5 mL含Amp+液體LB培養(yǎng)基中，37℃振搖過夜。采用質(zhì)粒小量抽提試劑盒（FastPlasmid Mini kit）提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定正確的重組質(zhì)粒送往上海生工公司進行測序鑒定。通過軟件DNAStar將測序結果與已知序列進行比較分析。

2 結果與分析

2.1 分離、鑒定結果

分離菌株進行革蘭氏染色，鏡檢可見紅色、兩端鈍圓、較短的陰性小桿菌；在麥康凱瓊脂平板上進行培養(yǎng)，呈現(xiàn)圓形、濕潤、周邊粉紅、中心深紅的菌落；在伊紅美藍營養(yǎng)瓊脂平板上進行培養(yǎng)，呈現(xiàn)黑色泛金屬光澤的菌落；在普通營養(yǎng)瓊脂上進行培養(yǎng)，呈現(xiàn)圓形微凸，表面光滑濕潤，淺灰色半透明菌落。分離菌株生化反應結果見表2，結合《伯杰細菌鑒定手冊》[4]鑒定為大腸桿菌。本研究共從136份樣本分離到108株大腸桿菌，結果見表3。

2.2 致病性試驗結果

分離出的108株大腸桿菌分別給108只試驗組小白鼠接種12 h后全部發(fā)病，發(fā)病小白鼠出現(xiàn)精神抑郁、呼吸加快、排稀便、肛門周圍被毛污穢不潔；24～48 h試驗小白鼠全部死亡，取死亡小白鼠肝臟進行革蘭氏染色，鏡檢可見紅色、兩端鈍圓、較短的陰性小桿菌，與分離菌株鏡檢結果相同。對照組小白鼠未見死亡。2.3血清型分布

表2 細菌生化鑒定結果Table 2Results of bacterial biochemical identification

表3 大腸桿菌分離結果Table 3Results of Escherichia coli separation

108株分離大腸桿菌經(jīng)血清學試驗，除11株未鑒定出血清型外，其余97株鑒定為8種不同的血清型，結果見表4，分別為O8、O9、O60、O64、O115、O139、O149、O157，其中以O8（19/108）、O9（13/108）、O149（13/108）、O157（40/108）為優(yōu)勢血清型。

表4 大腸桿菌血清型鑒定結果Table 4Results of Escherichia coli serotype identification

2.4 大腸桿菌耐藥基因PCR檢測結果

2.4.1 測序結果

經(jīng)上海生工公司測序，各擴增片斷序列采用DNAStar軟件與GenBank上發(fā)表的相應基因序列進行比對分析后確定基因：tetA與登陸號X61367（tetA）同源性為99.2%；tetB與登陸號J01830（tetB）同源性為99.0%；ermB與登陸號KJ710358（ermB）同源性為99.1%；blaCTX-M與登陸號X92506（blaCTX-M）同源性為99.2%；blaTEM與登陸號FJ668751（bla?TEM）同源性為99.1%。說明擴增到的片段為相應的基因序列。

2.4.2 檢測結果

經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳分析各自PCR產(chǎn)物，部分PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1～5。分離菌株四環(huán)素耐藥基因只檢出tetA（見圖1）與tetB（見圖2），檢出率分別為92.60%和64.81%，未檢測出tetC與tetD基因；大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因只檢出ermB（見圖3），檢出率為4.63%，未檢測出ermC與ermF基因；β-內(nèi)酰胺類耐藥基因只檢出blaCTX-M（見圖4）與blaTEM（見圖5）基因，檢出率分別為43.52%和88.89%，未檢測出blaSHV-1基因。耐藥基因陽性菌株數(shù)及檢出率結果見表5。

圖1 tetA基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig.1Agarose gel electrophoresis of tetA gene products obtained by PCR

圖2 tetB基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig.2Agarose gel electrophoresis of tetB gene products obtained by PCR

圖4 blaCTX-M基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig.4Agarose gel electrophoresis of blaCTX-M gene products obtained by PCR

圖3 ermB基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig.3Agarose gel electrophoresis of ermB gene products obtained by PCR

圖5 blaTEM基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig.5Agarose gel electrophoresis of blaTEM gene products obtained by PCR

表5 耐藥基因陽性菌株數(shù)及檢出率Table 5Detected rate and number of positive strains with resistance genes

3 討論

3.1 各地區(qū)豬大腸桿菌血清型

大腸桿菌血清型眾多，且具有較強地域性分布。國外報道致病性大腸桿菌“O”型血清型主要有O8、O9、O20、O45、O64、O101、O138、O139、O141、O157、O162等[10-11]。而我國流行的致病性大腸桿菌血

清型與國外報道有較大差異，如湖北省分離株以O107、O101、O93、O9、O139、O141和O157為主[12]，華東地區(qū)分離株以O107、O101、O20、O93、O11和O149為主[13]，陜西分離株以O139、O101、O149、O141、O60為主[14]，重慶市分離株以O101、O8、O20、O64、O45、O149為主[15]，云南分離株以O24、O119、O88、O8、O9、O85為主[16]，廣西分離株以O138、O18、O85、O9和O21為主[17]，河

南地區(qū)分離株以O8、O9、O161、O107為主[18]。本研究中108株分離菌株中有97株菌血清型以O8、O9、O149、O157為主，與國內(nèi)外豬致病性大腸桿菌優(yōu)勢血清型有一定差別；同時，108株分離菌株中有11株菌未能確定血清型，是否屬于新流行血清型尚待進一步研究。本研究顯示，不同豬場存在多種豬大腸桿菌“O”型血清型，不同地區(qū)豬場血清型差異更大，豬場血清型復雜性可能與菌株變異有關[19]。因此，必須定期進行血清型監(jiān)測，研制出當?shù)亓餍袃?yōu)勢菌株制備疫苗，進行免疫接種，才能取得較好預防效果。

3.2 豬大腸桿菌耐藥基因檢測情況

本研究對豬大腸桿菌四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、β-內(nèi)酰胺類三大類抗生素10種耐藥基因進行擴增及檢測，結果擴增到五種耐藥基因。其中，四環(huán)素類耐藥基因tetA、tetB檢出率分別為92.60%、64.81%，tetA、tetB作為豬大腸桿菌中最普遍存在的耐藥基因，與國外研究結果相同[20]。四環(huán)素類藥物耐藥基因存在，與四環(huán)素類藥物長期廣泛應用于治療、預防以及用作生長促進劑有關[21]。細菌對四環(huán)素類藥物耐藥機制有外排泵、核糖體保護、酶滅活和靶位修飾4種[22]，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)至少有45種不同的四環(huán)素耐藥基因[23]，其中tetA、tetB基因與外排泵機制相關[24]。分離菌株大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因ermB檢出率為4.63%，檢出率較少，可能和大腸桿菌對大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥以酶滅活機制為主，而ermB基因以靶位修飾耐藥機制為主有關[25]，可能與大環(huán)內(nèi)酯類藥物在養(yǎng)豬生產(chǎn)中應用較少有關。β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaCTX-M、blaTEM檢出率分別為43.52%、88.89%，與相關報道的動物源大腸桿菌攜帶的β-內(nèi)酰胺類耐藥基因以blaCTX-M、blaTEM為主相一致[26]。β-內(nèi)酰胺類藥物在臨床中較常用，占抗菌藥物總量的30%～40%[27]，β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaCTX-M與blaTEM存在可能與臨床不規(guī)范的大量使用和濫用此類藥物有關[28]。大腸桿菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥機制是產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶，其中β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaCTX-M、blaTEM均屬于超廣譜基因型，且主要通過質(zhì)粒在細菌中傳播[29]。未能擴增出和檢測到tetC、tetD、ermC、ermF、blaSHV-1耐藥基因，表明這些基因在呼倫貝爾地區(qū)動物源性細菌中不存在或極少。細菌耐藥現(xiàn)象嚴重，目前針對大腸桿菌耐藥性消除主要措施有：①針對耐藥機制合理選擇抗菌藥物；②使用各種理化因素或中草藥等消除耐藥性質(zhì)粒；③開發(fā)新的抗菌藥與耐藥抑制劑[30]。本研究顯示大部分分離菌株含有多種耐藥基因，耐藥基因檢測結果表明，該地區(qū)豬源大腸桿菌耐藥性嚴重，應定期對豬場進行藥敏試驗，根據(jù)藥敏試驗結果選擇適合藥物。

4 結論

本研究闡明呼倫貝爾地區(qū)豬致病性大腸桿菌優(yōu)勢血清型以O8、O9、O149、O157為主，為該病有效預防和疫苗研制奠定基礎；從分離菌株檢測出5種耐藥基因（tetA、tetB、ermB、blaCTX-M、blaTEM），為豬源大腸桿菌耐藥性產(chǎn)生分子機理方面研究提供參考。

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Serotype identification and resistance gene detection of swineEsche?richia coliin Hulunbeir/

QIU Jun1,2,ZHANG Ziwei1,FAN Ruifeng1,WANG Guanju2,XU Shiwen1(1.School of Veterinary Medicines,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.Inner Mongolia ZhalantunAgricultural and Grazing School,Zhalantun Inner Mongolia 162650,China)

In order to study conditions of the swineEscherichia coliserotypes and drug resistance genes in the Hulunbeir.Total 108 strains pathogenicEscherichia colifrom eight farms were isolated and identified in 2013-2014.And 97 strains ofEscherichia colimainly belonged to O8,O9,O149and O157,and all belonged to eight serotypes.In this study,PCR method was used to detect the tetracycline resistance genes (tetA,tetB,tetC,tetD),macrolide resistance genes(ermB,ermC,ermF),and beta lactam resistance genes (blaSHV-1,blaCTX-M,blaTEM).The results showed that five kinds of drug resistance genes(tetA,tetB, ermB,blaCTX-M,blaTEM)had a very high homology with the corresponding genes in GenBank from the 108 strains of swineEscherichia coli.

pig;Escherichia coli;serotype;resistance gene

S858.28

A

1005-9369（2015）07-0050-07

時間2015-7-9 14:42:57[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150709.1442.015.html

邱軍,張子威,樊瑞鋒,等.呼倫貝爾地區(qū)豬源大腸桿菌血清型鑒定與耐藥基因檢測[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2015,46(7)∶50-56.

Qiu Jun,Zhang Ziwei,Fan Ruifeng,et al.Serotype identification and resistance gene detection of swineEscherichia coliin Hulunbeir[J].Journal of Northeast Agricultural University,2015,46(7)∶50-56.(in Chinese with English abstract)

2015-01-23

環(huán)保部公益性項目（200909043）

邱軍（1975-），男，講師，博士，研究方向為環(huán)境毒理。E-mail:979191050@qq.com

*通訊作者：徐世文，教授，博士生導師，研究方向為環(huán)境毒理。E-mail:1009598967@qq.com